磁性納米吸附劑對GST-tagged蛋白的分離純化

鄒雪艷,孫 新,秦明明,董 爍，張于濤,曹朋樂,李強偉,柴 云*

(1.河南大學 納米材料工程研究中心，河南 開封 475004； 2.河南大學 化學化工學院，河南 開封 475004)

磁性納米吸附劑對GST-tagged蛋白的分離純化

鄒雪艷1,孫 新2,秦明明1,董 爍1，張于濤1,曹朋樂1,李強偉2,柴 云2*

(1.河南大學 納米材料工程研究中心，河南 開封 475004； 2.河南大學 化學化工學院，河南 開封 475004)

本文以Fe3O4/半胱氨酸(以Fe3O4/Cys)為載體，通過在其表面修飾功能化的谷胱甘肽(GSH)基團，得到Fe3O4/Cys-GSH納米吸附劑，可直接應用于谷胱甘肽S-轉移酶標記(GST-tagged)融合蛋白的親和分離. 實驗結果表明，制備的Fe3O4/Cys-GSH納米吸附劑對GST-tagged融合蛋白具有特異性、普適性、重復利用性能，可實現(xiàn)對目標蛋白的快速、高效分離，具有潛在的市場應用價值.

四氧化三鐵；L-半胱氨酸；親和分離；谷胱甘肽S-轉移酶標記(GST-tagged)

谷胱甘肽S-轉移酶(GST)是一組具有多種生理功能的蛋白質，在機體有毒化合物的代謝、保護細胞免受急性毒性化學物質攻擊中起到重要作用，是體內(nèi)代謝反應中II相代謝反應的重要轉移酶[1]. 同時GST還是一種新的腫瘤標志物，對肝癌、肺癌、卵巢癌腺癌、腺鱗癌等具有一定的預測作用[2-4]，為臨床治療及預后判斷提供理論依據(jù). 因此分離、純化GST及GST標簽(GST-tagged)蛋白具有十分重要的意義.

目前常見的蛋白質提純方法有：親和沉淀法、電泳法、透析法、層析法、超速離心法等[5-10]. 其中親和沉淀法因其具有操作簡便、易于放大等優(yōu)點，被認為是蛋白質純化強有力的技術手段. 早在1997年河北醫(yī)科大學劉滿英等[11]綜述了以殼聚糖為載體，通過表面不同功能化后，實現(xiàn)對牛血清蛋白、酶蛋白的分離、純化. LEE等[12]以聚醛樹脂為載體，通過在表面修飾Ni-NTA基團，從而實對His-tagged蛋白的親和分離. 重慶醫(yī)科大學游莉等[13]，利用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)對融合蛋白GST-hS100A9進行了誘導重組菌表達，最后經(jīng)過谷胱甘肽-瓊脂糖4B(GS4BB)對其進行分離純化. 華南理工大學羅立新教授[14]利用 GSTrapFF 1 mL和BIO-RADLP 層析系統(tǒng)親和層析柱對GST-SrtAΔN59蛋白進行了分離純化. 為了實現(xiàn)對目標蛋白的快速、高效分離，選用磁性材料為親和吸附劑載體，顯得尤為重要. 磁性四氧化三鐵是一種常用的磁性材料，它制備工藝簡單、成本低廉、磁響應性強，在腫瘤治療、細胞分離、催化、醫(yī)藥等領域均有廣泛應用[15-16]. 本文報道了一步法合成Fe3O4/Cys磁性微球，通過表面生物功能化后直接用于GST-tagged蛋白的親和分離.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

三氯化鐵(FeCl3·6H2O，≥99.0%)、無水乙酸鈉(CH3COONa，≥99.0%)、L-半胱氨酸(L-Cys，≥99.0%)、谷胱甘肽(GSH，≥99.0%)、氯化鈉(NaCl，≥99.0%)、氯化鉀(KCl，≥99.0%)均購自天津市科密歐化學試劑有限公司，乙二醇((CH2OH)2，≥99.0%)購自天津市富宇化學式劑有限公司，無水乙醇購自安徽安特食品股份有限公司，0.01 mol pH=7.4 PBS(KCl 2.08g、NaCl 8.03 g、KH2PO40.25 g、Na2HPO4·12H2O 2.31 g)磷酸緩沖溶液，KH2PO4購自天津市基準化學試劑有限公司，十二烷基硫酸鈉、聚丙烯酰胺、Na2HPO4·12H2O來自國藥集團化學試劑有限公司. 試劑均為市售分析純.

1.1.2 儀器

掃描電子顯微鏡(SEM，JSM-5600，日本)，傅立葉變換紅外光譜儀(FT-IR， Nicolet 6700，美國)，熱重分析儀(TG，TGA/DSC1，瑞士)，X射線粉末衍射儀(XRD，X’Pert Philips，荷蘭)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，Power PAC 300，中國)，電熱鼓風干燥箱(101F-1，中國)，電子天平(BS224S，中國).

1.2 實驗步驟

1.2.1 Fe3O4/Cys-GSH的制備[17]

稱取1.0 g FeCl3·6H2O，2.7 g NaAc，0.1 gL-Cys溶于30 mL乙二醇中，室溫攪拌30 min后，轉入高壓反應釜，于200 ℃反應8 h. 自然冷卻至室溫，用無水乙醇和蒸餾水各洗三次，60 ℃干燥24 h即得Fe3O4/Cys樣.

稱取 3 mg Fe3O4/Cys樣品于10 mL離心管中，超聲5 min，用0.01 mol ·L-1pH=7.4的PBS洗滌兩次，加入10 mL 8 mg ·mol-1GSH，超聲10 min后放入恒溫搖床37 ℃反應24 h(120 r·min-1). 產(chǎn)物用0.01 mol·L-1pH=7.4的PBS洗滌6次，沉淀分散于25%的乙醇溶液中于4 ℃下保存.

1.2.2 GST-tagged融合蛋白的分離、純化

取60 μL濃度為30%(質量分數(shù))的Fe3O4/Cys-GSH用0.01 mol·L-1pH=7.4的PBS溶液洗滌3次，隨后加入1 000 μL GST-tagged細胞裂解液，于4 ℃孵育2 h. 離心后，沉淀用1 000 μL PBS洗滌3次，加入30 μL 50 mmol·L-1的GSH進行洗脫，離心后上清即為目標蛋白.

2 結果與討論

2.1 磁性微球的表征

圖1為制備的Fe3O4/Cys(a)和Fe3O4/Cys-GSH(b)樣品SEM圖. 從圖1中可以看出，制備的樣品為球形顆粒形貌，粒徑均一，平均粒徑為30～40 nm，分散均勻.

圖1 制備Fe3O4/Cys(a)和Fe3O4/Cys-GSH(b)的SEM圖Fig.1 SEM images of Fe3O4/Cys (a) and Fe3O4/Cys-GSH (b)

圖2為制備Fe3O4/Cys(曲線1)和Fe3O4/Cys-GSH(曲線2)樣品的XRD圖，從圖中可以看出，兩條曲線在2θ=30.3°，36.5°，42.8°，53.1°，56.8°和62.5°處具有明顯的衍射峰，對應于立方相Fe3O4的(220)，(311)，(400)，(422)，(511)以及(440)晶面(JCPDS編號19-629)，說明表面功能化后并不影響樣品的主體結構.

圖2 Fe3O4/Cys(曲線1)和Fe3O4/Cys-GSH(曲線2)的XRD圖Fig.2 XRD patterns of Fe3O4/Cys (curve 1) and Fe3O4/Cys-GSH (curve 2)

圖3為制備Fe3O4/Cys(曲線1)、Fe3O4/Cys-GSH(曲線2)樣品的TG圖，從圖中可以看出兩個樣品從室溫20～740 ℃均有明顯的失重：其中室溫-240 ℃失重率分別為5.9%(曲線1)、6.3%(曲線2)，歸因于樣品表面吸附水或結合水失水. 在240～580 ℃區(qū)間的失重是由于表面修飾基團的熱分解，失重率分別為6.0%、7.2%，F(xiàn)e3O4/Cys-GSH的失重率比Fe3O4/Cys增加了1.2%，為表面修飾-GSH基團的失重，間接說明GSH成功的修飾在Fe3O4/Cys-GSH上面.

圖3 Fe3O4/Cys(曲線2)和Fe3O4/Cys-GSH(曲線1)樣品的熱重圖Fig.3 TG curres of Fe3O4/Cys (curve 2) and Fe3O4/Cys-GSH (curve 1)

圖4 Fe3O4/Cys(曲線1)和Fe3O4/Cys-GSH(曲線2)樣品的紅外圖Fig.4 IR spectra of Fe3O4/Cys (curve 1) and Fe3O4/Cys-GSH (curve 2)

圖4為制備Fe3O4/Cys(曲線1)和Fe3O4/Cys-GSH(曲線2)的紅外光譜圖. 從圖中可以看出，兩條曲線在584 cm-1處均出現(xiàn)了明顯的吸收峰，屬于Fe3O4中Fe-O鍵的特征吸收峰[18]. 3 460 cm-1處對應Fe3O4/Cys中-NH2和-OH的伸縮振動峰[19]. 與曲線1相比，曲線2多了2 930 cm-1及2 880 cm-1兩個峰，歸屬于GSH中-CH3及-CH2-的伸縮振動峰. 另外在1 730 cm-1處出現(xiàn)了酰胺I帶的特征吸收峰，來自于表面修飾-GSH中的酰胺鍵[20].

2.2 分離目標蛋白

2.2.1 Fe3O4/Cys-GSH樣品的制備及其分離目標蛋白的示意圖

蛋白質常常以復雜混合物的形式存在于生物體的細胞或者組織中. 親和沉淀法是一種分離蛋白質、酶的常用表征方法，其基本原理是利用蛋白質和一種特定的配體分子特異性結合，從而達到從混合蛋白中提純目標蛋白的目的. 圖5為Fe3O4/Cys-GSH樣品的合成及其對GST-tagged蛋白分離、純化過程. 由圖所示，樣品從制備到分離目標蛋白共需三步：首先，以FeCl3·6H2O為鐵源，采用溶劑熱法一步合成了復合納米材料Fe3O4/Cys；隨后，在該復合微球表面修飾-GSH基團，形成Fe3O4/Cys-GSH磁性納米親和吸附劑，最后，制備的磁性吸附劑直接從混合蛋白中分離純化GST-tagged融合蛋白.

圖5 Fe3O4/Cys-SH樣品的制備及分離GST-tagged 蛋白示意圖Fig.5 Schematic representation of the preparation procedure of Fe3O4/Cys-SH and its enrichment and separation of GST-tagged proteins

2.2.2 SDS-PAGE分析

圖6為Fe3O4/Cys-GSH磁性吸附劑分離GST-tagged LOV蛋白的SDS-PAGE圖，泳道1為Marker，泳道2為混合蛋白，泳道3-5分別為磁性吸附劑第一、二、三次分離目標蛋白. 從泳道1可以看出制備的Fe3O4/Cys-GSH磁性吸附劑具有很好的特異性，能快速從混合蛋白中分離、純化GST-tagged蛋白. 為了考察該吸附劑的重復利用性能，我們對分離過GST-tagged LOV蛋白的Fe3O4/Cys-GSH磁性吸附劑用PBS洗滌后，繼續(xù)加入混合蛋白，實驗過程與第一次分離過程相同. 從泳道4，泳道5可以看出，該吸附劑均具有較高的特異性，說明制備的磁性吸附劑具有很多的重復利用性能.

圖6 Fe3O4/Cys-GSH磁性吸附劑重復利用的SDS-PAGE圖：泳道1，Maker；泳道2，混合蛋白；泳道3，第一次分離；泳道4，第二次分離；泳道5，第三次分離Fig.6 SDS-PAGE analysis of proteins by reused Fe3O4/Cys-GSH magnetic adsorbent. Lane1, Marker; Lane 2, GST tagged LOV E. coil lysate; Lane 3-5, the fractionsreleased from reused Fe3O4/Cys-GSH NSs up to three times: Lane 3, 1 st; Lane 4, 2 nd; Lane 5, 3 rd

為了驗證制備微球對GST-tagged融合蛋白的普適性，我們采用GST-tagged LOV、GST-tagged N2、GST-tagged GPX3三種融合蛋白作為實驗對象. 圖7為Fe3O4/Cys-GSH磁性吸附劑對三種GST蛋白分離純化的SDS-PAGE圖，從泳道5-7可以看出，制備的Fe3O4/L-Cys-GSH磁性吸附劑對GST-tagged LOV、GST-tagged N2、GST-tagged GPX3三種蛋白均具有很好的特異性，說明制備的磁性吸附劑對GST-tagged蛋白具有普適性.

圖7 Fe3O4/Cys-GSH磁性吸附劑分離純化三種GST-tagged蛋白的SDS-PAGE圖：泳道1，Maker；泳道2，GST-tagged LOV混合蛋白；泳道3，GST-tagged N2混合蛋白；泳道4，GST-tagged GPX3 混合蛋白；泳道5，F(xiàn)e3O4/Cys-GSH復合微球對GST-tagged LOV分離純化；泳道6，F(xiàn)e3O4/Cys-GSH復合微球對GST-tagged N2分離純化；泳道7，F(xiàn)e3O4/Cys-GSH復合微球對GST-taggedGPX3分離純化Fig.7 Fe3O4/Cys-GSH magnetic adsorbent of three GST-tagged protein purified SDS-PAGE: Lane 1, Marker; Lane 2, GST-tagged LOV E. coil lysate; Lane 3, GST-tagged N2 E. coil lysate; Lane 4, GST-tagged GPX3 E. coil lysate. The fractions washed off from the Fe3O4/Cys-GSH when different kinds of GST-tagged proteins were used (Lane 5, GST-tagged LOV; Lane 6, GST-tagged N2; Lane 7, GST-tagged GPX3)

3 結論

以磁性Fe3O4/Cys納米微球為載體，通過表面生物功能化后，得到Fe3O4/Cys-GSH磁性親和吸附劑，可直接應用于混合蛋白中GST-tagged融合蛋白的分離、純化. 實驗結果表明，制備的磁性納米微球對GST-tagged蛋白具有特異性，可快速、高效地對目標蛋白進行分離，且重復使用性能良好，具有潛在的市場應用價值.

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SeparationandpurificationofGST-taggedproteinbymagneticnanoadsorbent

ZOU Xueyan1, SUN Xin2, QIN Mingming1, DONG Shuo1, ZHANG Yutao1, CAO Pengle1, LI Qiangwei2, CHAI Yun2*

(1.EnginerringResearchCenterforNanomaterials,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China; 2.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

Using Fe3O4/Cys as a carrier, Fe3O4/Cys-GSH nano adsorbent was obtained by modifying glutathione (GSH) group, which could be applied to the affinity separation of GST-tagged fusion protein. The results show that the prepared Fe3O4/Cys-GSH nano adsorbent has the specificity, universality and reusability to the GST-tagged fusion protein, and can realize the rapid and efficient separation of the target protein. A potential application value would be expected.

Fe3O4;L-cysteine; affinity separation; GST-tagged

O61

A

1008-1011(2017)05-0617-05

2017-06-13.

國家自然科學基金(21571051), 河南大學科研基金項目(2015YBZR032), 河南省科技創(chuàng)新杰出人才支持計劃(164200510005), 河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃(17IRTSTHN004), 濟源市科技發(fā)展計劃項目(170220).

鄒雪艷(1981-), 女, 講師, 研究方向為復合納米材料的制備及其對蛋白質的親和分離.*

,E-mail:chaiyun@henu.edu.cn.

[責任編輯：張普玉]