基于ISSR分子標(biāo)記的孑遺瀕危植物四合木遺傳結(jié)構(gòu)分析

段義忠 王海濤 張格格 嚴(yán)偉娜

（榆林學(xué)院，陜西省陜北生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，榆林 719000）

四合木（Tetraena mongolica）屬蒺藜科（Zygophyllaceae），是古地中海第三紀(jì)活化石植物，國家一級(jí)保護(hù)植物。四合木屬于落葉小灌木，雙數(shù)羽狀復(fù)葉，花1～2 朵著生于短枝上，成熟果實(shí)具有不開裂的分果瓣4 個(gè)，其種子形狀為鐮狀披針形，絕大多數(shù)果實(shí)中只含有一個(gè)較小的種子［1］。目前四合木（T.mongolica）在全世界分布區(qū)主要集中在中國內(nèi)蒙古鄂爾多斯、烏海、寧夏石嘴山等地，在俄羅斯、烏克蘭也有零星分布，為典型的西鄂爾多斯特有單種屬和特有群系，對(duì)維持中國西北干旱、半干旱區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)功能及穩(wěn)定性具有重要意義。四合木具有超強(qiáng)抗旱能力，但近年來由于全球氣候變化的加劇以及人類對(duì)其分布區(qū)域所屬地區(qū)的煤炭等天然礦產(chǎn)資源的大量開采等對(duì)生態(tài)環(huán)境的干擾［2～3］，使得四合木這一瀕危物種所在分布區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)變得非常脆弱且分布面積迅速縮小，其棲息地僅為2 700 km2，且呈現(xiàn)破碎化分布，生境適宜性驟降，瀕危狀況加劇［4］。

當(dāng)前國內(nèi)外針對(duì)四合木的研究主要集中在其光和特征及固碳能力［5～6］、保護(hù)對(duì)策［7］、花粉形態(tài)學(xué)［8］、種子脂肪酸含量測(cè)定及分析［9］、傳粉生態(tài)學(xué)［10］、生理學(xué)和瀕危肇因與機(jī)制等方面［11～12］。依據(jù)四合木在異域播種后生長(zhǎng)量大小比較及對(duì)不同屬性土壤和對(duì)水、熱等綜合影響因子的適應(yīng)性分析得到，相同地區(qū)不同土壤間四合木生長(zhǎng)量之間不存在差異性，不同地區(qū)相同土壤間四合木生長(zhǎng)量之間卻存在著特別明顯的差異性，表明了土壤條件對(duì)四合木的生長(zhǎng)影響不大，而氣候成為直接影響四合木生長(zhǎng)的最重要條件；四合木分布區(qū)與異地保護(hù)區(qū)中土壤之間的微量元素具有一定的差異性，但因?yàn)橥寥乐械奈⒘吭睾烤陀谥参镏泻?，表明四合木具有?duì)土壤中微量元素的富集作用，土壤中微量元素的含量并不能影響四合木正常生長(zhǎng)［13］。張?jiān)骑w等［14］通過設(shè)計(jì)了9個(gè)10 m×10 m 樣方的觀察結(jié)果，系統(tǒng)地對(duì)比了四合木在自然更新、消極圍欄保護(hù)和積極圍欄保護(hù)3種不同情況下的種群生長(zhǎng)狀況，結(jié)果表明消極圍欄保護(hù)對(duì)四合木種群的更新?lián)Q代并無促進(jìn)作用；而積極進(jìn)行圍欄保護(hù)也就是人工圍欄并進(jìn)行適當(dāng)?shù)难a(bǔ)水補(bǔ)肥對(duì)四合木種群有很好的保護(hù)作用，是就地保護(hù)四合木的有效手段。Ge 等［15］對(duì)四合木基因的變異、種群結(jié)構(gòu)和譜系地理等方面進(jìn)行評(píng)估，為四合木保護(hù)和管理提供依據(jù)。張穎娟和盧萍［16］對(duì)四合木進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化、基因變異性和遺傳多樣性的研究，提出了應(yīng)對(duì)具有較高遺傳多樣性的四合木中的meta-種群加強(qiáng)保護(hù)。近年來，諸多學(xué)者利用等位酶、RAPD和微衛(wèi)星等方法對(duì)四合木的遺傳多樣性和遺產(chǎn)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究［16～18］，但等位酶分析法所選酶的所有基因未必都能表達(dá)在酶譜上，且受酶數(shù)量影響，數(shù)量較少時(shí)，其結(jié)果可能不具有代表性［19］，而且RAPD 具有對(duì)反應(yīng)條件敏感，重復(fù)性差，多態(tài)性信息量較低等不足［20］，增加了試驗(yàn)難度和工作量。目前，還未見基于ISSR技術(shù)對(duì)四合木的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的分析研究。

ISSR（Inter-simple sequence repeat）即簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記，其基本原理為將1～4 個(gè)堿基作引物標(biāo)定在SSR 的3'或5'端，擴(kuò)增兩側(cè)具有反向排列SSR 的一段序列，而不是擴(kuò)增SSR 本身［21］。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)同時(shí)具有多種分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，ISSR 成本低且多態(tài)性高、可獲得幾倍于RAPD 的信息量、精確度高、有較高的重復(fù)性且相對(duì)穩(wěn)定、簡(jiǎn)單快捷且更容易操作、更專一。物種經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)化而具有了豐富的遺傳多樣性，這對(duì)研究物種的生物學(xué)特性具有重要意義，通過對(duì)物種遺傳多樣性的研究可以得知該物種的適應(yīng)性、生存力，進(jìn)而對(duì)其實(shí)施科學(xué)有效保護(hù)措施。ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)同時(shí)兼具多種分子標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，因此該技術(shù)得到了各界的肯定并得到了廣泛應(yīng)用［22］。李娟等［23］利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)閩楠不同地理種群的遺傳多樣性進(jìn)行分析，研究結(jié)果為該物種保護(hù)策略制定提供有價(jià)值的種群遺傳學(xué)信息。沈奇等［24］采用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)野生桃兒七13 個(gè)居群進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明種群內(nèi)的基因流十分豐富，居群內(nèi)的遺傳分化明顯大于居群間的分化，聚類結(jié)果顯示桃兒七13 個(gè)居群可以分為兩大類，研究結(jié)果為其品種分類及種質(zhì)保護(hù)提供理論依據(jù)。

本試驗(yàn)以中國西北干旱區(qū)特有孑遺瀕危植物四合木為研究對(duì)象，選取鄂爾多斯高原西部6個(gè)不同地理分布的四合木種群作作為試驗(yàn)材料，利用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，通過分析和探討其遺傳多樣性水平及遺傳結(jié)構(gòu)，以解釋其遺傳多樣性與不同地區(qū)的生境條件關(guān)系，為四合木遺傳資源的有效保護(hù)、管理與利用提供重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所采集的四合木種群材料均來自中國四合木自然棲息地6 個(gè)自然種群（見表1），采下嫩葉置于自封袋并放入適量變色硅膠，記錄后放于-80℃的超低溫冰箱中作為試驗(yàn)材料。

表1 四合木采樣地點(diǎn)Table 1 Sampling position of T.mongolica

1.2 DNA的提取及檢測(cè)

采用三博遠(yuǎn)志公司提供的DNA提取試劑盒提取，將提取好的DNA 溶液稀釋10 倍后，將其保存于-20℃的冷藏環(huán)境中備用。將上述試驗(yàn)提取出來的四合木DNA 挑選出一組作為模板，選取30 條UBC引物進(jìn)行擴(kuò)增。從中篩選出6個(gè)清晰度較好、條帶數(shù)目多且沒有拖尾現(xiàn)象的引物，將以下6 個(gè)UBC引物作為下一步擴(kuò)增的引物（見表2）。

表2 UBC引物序列Table 2 UBS primer sequence

本試驗(yàn)采用了單因素法對(duì)25 μL 的PCR 反應(yīng)體系各項(xiàng)因子進(jìn)行優(yōu)化。以UBC 811 和UBC 835為引物，參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)了4 個(gè)10×Easy Tag buffer梯度：1.5，2.0，2.5和3.0 μL；4個(gè)dNTPs梯度：1.6，2.0，2.4 和2.8 μL；4 個(gè)Easy Taq DNA 聚合酶梯度：0.10，0.15，0.20 和0.25 μL；DNA（母液稀釋10倍）模板設(shè)計(jì)4 個(gè)梯度1，2，3 和4 μL。最后得出PCR 反應(yīng)體系為：DNA 模板2 μL，UBC 引物1 μL，Taq 聚合酶0.15 μL，dNTP 1.6 μL，10×Buffer 2.5 μL，ddH2O 17.75 μL。對(duì)退火溫度、循環(huán)次數(shù)及延伸時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化后的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋孩龠x擇94℃預(yù)變性5 min；②變性30s 后在42℃～48℃溫度下退火30 s；③在72℃溫度下延伸3 min，循環(huán)32次，再補(bǔ)平7 min；④選擇8℃溫度下永久保存。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

通過人工識(shí)別的手段記錄四合木66個(gè)材料的凝膠電泳圖譜條帶數(shù)目。由于ISSR分子標(biāo)記是顯性標(biāo)記，所以一個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)用電泳圖譜中的每個(gè)清晰的條帶表示。對(duì)于同一引物，條帶電泳遷移率一致說明是具有同源性的擴(kuò)增產(chǎn)物。篩選上述凝膠電泳圖中易于辨認(rèn)且較為清晰的條帶，將同一位置上是否有DNA 結(jié)合位點(diǎn)的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)的結(jié)果以二元數(shù)據(jù)的形式記錄，穩(wěn)定出現(xiàn)的清晰條帶（顯性）記作1，沒有條帶（隱性）記為0，制作“0.l”組成的原始矩陣并記錄數(shù)據(jù)。利用軟件Popgene 32 計(jì)算“0，1 矩陣”多態(tài)位點(diǎn)、多態(tài)位點(diǎn)百分率、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)（He）、Shannon’s信息指數(shù)以及Nei的遺傳距離等參數(shù)。用分析軟件NTSYS-PC對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，得到四合木種群間的遺傳聚類圖，以此來研究四合木6個(gè)不同地理種群的親緣關(guān)系和遺傳多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

本試驗(yàn)利用6個(gè)ISSR引物（UBC810，UBC811，UBC814，UBC824，UBC835，UBC873）對(duì)6個(gè)不同地理種群的66個(gè)四合木個(gè)體進(jìn)行ISSR-PCR 擴(kuò)增，引物UBC811對(duì)千里溝、伊克布拉格、甘德爾山、四合木自然保護(hù)區(qū)、磴口—桃司兔和巴拉貢的24 個(gè)個(gè)體DNA模板擴(kuò)增后電泳得到的電泳圖（見圖1）。

2.2 各個(gè)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性

本試驗(yàn)選擇用6 個(gè)ISSR 引物對(duì)6 個(gè)不同地理種群的四合木進(jìn)行ISSR-PCR 擴(kuò)增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳共獲得370 個(gè)清晰的電泳譜帶，利用POPGENE 1.31 軟件分析四合木各種群的遺傳多樣性指數(shù)［25］。結(jié)果顯示不同ISSR引物的差異存在于擴(kuò)增帶數(shù)量、擴(kuò)增帶型、多態(tài)性檢出率、條帶分布均勻度等多方面。試驗(yàn)所用的6條引物，各自的擴(kuò)增結(jié)果于不同材料間表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，在一定程度上表明四合木遺傳背景的復(fù)雜性與豐富的遺傳多樣性。四合木的各引物擴(kuò)增多態(tài)性結(jié)果參照ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果（見表3）。

2.3 蒙古沙冬青不同地理種群的遺傳多樣性

用Popgene 32 軟件計(jì)算四合木各種群的各項(xiàng)相關(guān)指數(shù)［26］。計(jì)算結(jié)果參照四合木遺傳多樣性（見表4），不同種群的四合木平均多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為23，Nei’s 多樣性指數(shù)（He）為0.286 5～0.350 8，Shannon’s 信息指數(shù)（I）為0.423 6～0.504 9，其四合木自然保護(hù)區(qū)的Nei’s多樣性指數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)均為6個(gè)地理種群中最高，而磴口桃司兔的Nei’s 多 樣 性 指 數(shù) 和Shannon’s 信 息 指 數(shù) 均 為最低。

表3 ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果Table 3 ISSR primer amplification results

2.4 四合木不同地理種群遺傳多樣性及遺傳距離分析

利用軟件Popgene 32 軟件計(jì)算四合木不同地理種群的遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.125 3，表明群體間存在一定程度的遺傳分化；種群內(nèi)遺傳多樣性（Hs）為0.316 7，表明四合木的遺傳分化主要發(fā)生在種群內(nèi)；6 個(gè)種群的基因流（Nm）為3.491 5＞1，表明四合木6個(gè)種群間具有一定的基因流，可以防止遺傳漂變所導(dǎo)致的遺傳分化。由四合木種群間的遺傳距離結(jié)果可知，伊克布拉格種群（YKBLG）和巴拉貢種群（BLG）的遺傳距離最小為0.025 9，而四合木千里溝種群（QLG）和甘德爾山種群（GDES）遺傳距離最大為0.974 4（見表5）。

2.5 四合木不同種群聚類分析

用NTSYS.pc 2.10e 軟件構(gòu)建了四合木6 個(gè)種群的聚類分析圖（見圖2），6 個(gè)種群聚類結(jié)果被聚為三大類，千里溝種群、伊克布拉格種群和巴拉貢種群先聚成第一大類，再與磴口—桃司兔種群聚成第二大類，而種群四合木自然保護(hù)區(qū)種群和種群甘德爾山種群則組成第三大類。

表4 基于ISSR標(biāo)記的四合木遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of T.mongolica based on ISSR marker

表5 四合木種群間的遺傳距離Table 5 Genetic distance between T.monglica populations

3 討論

遺傳多樣性一般指物種種內(nèi)的遺傳多樣性，即同一物種不同群體間或是同一種群內(nèi)的不同個(gè)體的遺傳變異總和。一個(gè)物種的遺傳多樣性與其適應(yīng)環(huán)境變化的能力呈正相關(guān)，遺傳多樣性越高其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)［27］。四合木作為一種特有建群植物，其長(zhǎng)期處在土壤貧瘠、氣候干燥的惡劣環(huán)境中且不斷繁衍、進(jìn)化，因此展現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。6 個(gè)地理種群中，Nei’s 多樣性指數(shù)（He）、Shannon’s信息指數(shù)（I）最高的均是四合木自然保護(hù)區(qū)種群，該地區(qū)年均溫度相對(duì)其他幾個(gè)地區(qū)偏高，且滿足四合木生長(zhǎng)所需要的水分，這些條件是導(dǎo)致四合木具有豐富的遺傳多樣性的基礎(chǔ)，而桃司兔因其特殊的地理位置，相對(duì)較低的溫度和相對(duì)濕潤(rùn)的氣候，使得該地區(qū)四合木種群的遺傳多樣性較低。和其余種群相比，四合木自然保護(hù)區(qū)種群的遺傳多樣性更顯著，對(duì)其周邊的四合木種群應(yīng)首先加強(qiáng)保護(hù)，但是只保護(hù)該地區(qū)的四合木種群對(duì)四合木整體的遺傳多樣性的保護(hù)是不利的，所以應(yīng)當(dāng)制定合適的遷地保護(hù)策略。基因流即生物種群之間的基因交流，當(dāng)某一物種的基因流大于5.0 時(shí)，說明該物種具有較高的異交率，而當(dāng)基因流（Nm）小于l時(shí)，遺傳漂變導(dǎo)致了種群間的遺傳分化。植物種群內(nèi)和種群間的基因流主要依賴于孢子、花粉、種子、植株個(gè)體以及其他攜有遺傳物質(zhì)的物體等媒介進(jìn)行，花粉傳播和種子擴(kuò)散是自然植物種群最主要的基因流的方式［18］。適當(dāng)?shù)幕蛄鞑坏梢跃S持種群的穩(wěn)定性，而且在一定程度上可以提高它們對(duì)不斷變化的環(huán)境適應(yīng)能力。四合木基因流Nm為3.491 5，Nm＞1.0，說明四合木種群間基因流水平較高。四合木6 個(gè)種群的平均遺傳距離為0.139 3，說明四合木種群之間的遺傳分化程度較小。通過四合木種群間的聚類圖可知聚類結(jié)果分為三類，種群千里溝、伊克布拉格和巴拉貢先聚成一大類，再與甘德爾山聚成第二大類，而四合木自然保護(hù)區(qū)和桃司兔則組成第三大類。這說明距離因素是影響四合木種群間遺傳分化的主要原因，但不同生境條件也對(duì)四合木種群的遺傳分化產(chǎn)生了影響，桃司兔與千里溝、伊克布拉格和巴拉貢因距離較近，但也產(chǎn)生了一定的遺傳分化，主要原因是因?yàn)樘宜就玫纳硹l件為黃河河灘生境，相對(duì)濕度較大；而千里溝、伊克布拉格和巴拉貢為荒漠草原生境，相對(duì)濕度較小，生境的差異導(dǎo)致了桃司兔種群與另外的三個(gè)種群產(chǎn)生了遺傳差異。因此，本研究的結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步研究四合木的遺傳分化是否與地理因素相關(guān)具有一定的參考意義。張穎娟等［28］利用等位酶和RAPD分析技術(shù)對(duì)海南區(qū)、桃司圖、烏加廟、石嘴山和千里山的四合木種群進(jìn)行遺傳距離分析結(jié)果表明，烏加廟種群與其他4 個(gè)種群的遺傳距離都較大，并認(rèn)為是生境的選擇壓力所導(dǎo)致而與距離因素?zé)o關(guān)，與本研究的結(jié)果不一致，主要原因可能是RAPD 與ISSR 算法原理上的不同，雖然ISSR 與RAPD 兩種研究方法在一定程度上都能反映四合木的遺傳多樣性較高，但RAPD 在方法上有一定缺陷，而ISSR多態(tài)性、精確度和重復(fù)性都較高，

通過對(duì)四合木6 個(gè)不同地理種群進(jìn)行研究得出如下結(jié)論：①本試驗(yàn)共篩選出6 條ISSR 引物獲得多樣性豐富、清晰的條帶共370 個(gè)，其中261 個(gè)條帶具有多態(tài)性，占總條帶數(shù)的71%，6 個(gè)地理種群中四合木自然保護(hù)區(qū)種群的Nei’s多樣性指數(shù)、Shannon’s 信息指數(shù)均為最高，而磴口—桃司兔的則為最低。以上結(jié)果表明本試驗(yàn)的四合木遺傳多樣性水平較高，且本研究所采集的66 個(gè)樣本分布范圍較廣，生態(tài)環(huán)境差異較大，其所處植物群落結(jié)構(gòu)差異較大，所以具有豐富的遺傳多樣性。②通過對(duì)四合木6個(gè)種群的基因分化系數(shù)（Gst）分析，表明種群內(nèi)遺傳多樣性變異的百分率為81.81%，說明種群內(nèi)變異是四合木的遺傳變異主要來源。種群內(nèi)遺傳多樣性（Hs）為0.316 7，說明四合木的遺傳分化主要發(fā)生在種群內(nèi)。6 個(gè)種群的基因流（Nm）為3.491 5＞1，表明6 個(gè)種群間具有一定的基因流，可以防止遺傳漂變所導(dǎo)致的遺傳分化。四合木的6 個(gè)種群的遺傳距離平均值為0.139 3，伊克布拉格種群和巴拉貢種群的遺傳距離最小為0.025 9，而千里溝種群和甘德爾山種群遺傳距離最大為0.974 4。由四合木種群間的聚類圖得知聚類結(jié)果分為三類：千里溝種群、伊克布拉格種群和巴拉貢種群先聚成一大類，再與磴口—桃司兔種群聚成第二大類，而四合木自然保護(hù)區(qū)種群和甘德爾山種群則組成第三大類。這說明距離因素是影響四合木種群間遺傳分化的主要原因，但不同生境條件也對(duì)四合木種群的遺傳分化產(chǎn)生了影響。