洋參御唐丸對大鼠血糖水平、胰島結(jié)構(gòu)及功能的影響

趙大鵬 謝 寧

(黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱,150000)

洋參御唐丸對大鼠血糖水平、胰島結(jié)構(gòu)及功能的影響

趙大鵬 謝 寧

(黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱,150000)

目的：觀察洋參御唐丸對大鼠血糖水平、胰島結(jié)構(gòu)及功能的影響。方法：將30只OLETF大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組和對照組，每組15只；15只同系非糖尿病的LETO大鼠為正常對照組。所有大鼠均為8周齡。正常對照組：在SPF級條件下標(biāo)準(zhǔn)飼料，單籠飼養(yǎng)；對照組：在正常對照組的基礎(chǔ)上以2 mL蒸餾水灌胃；觀察組：洋參御唐丸溶于蒸餾水中灌胃，療程24周。治療前后每組處死大鼠，進(jìn)行血清葡萄糖濃度檢測、采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA法)檢測空腹胰島素(FINS)；并通過HE染色和Masson復(fù)合染色觀察胰島結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果：1)胰腺HE染色形態(tài)學(xué)顯示治療后對照組胰島形狀不規(guī)則，出現(xiàn)大量的纖維組織增生，胰島有明顯的萎縮；觀察組胰島無明顯肥大或萎縮，纖維組織不明顯。2)胰腺M(fèi)asson染色形態(tài)學(xué)顯示治療后，對照組發(fā)現(xiàn)大量纖維組織長入胰島，與外分泌腺界限不明；而觀察組僅見胰島周邊有少量纖維組織，未見纖維組織長入胰島。3)治療后，與正常對照組比較，對照組和觀察組明顯升高(P<0.05)，ISI降低(P<0.05)。觀察組FBG、FINS均低于對照組(P<0.05)，ISI高于對照組(P<0.05)。結(jié)論:洋參御唐丸能有效調(diào)節(jié)OLETF大鼠的血糖水平和改善胰島的功能和結(jié)構(gòu)。

洋參御唐丸;大鼠;血糖水平;胰島結(jié)構(gòu);胰島功能

2型糖尿病(T2DM)具有復(fù)雜的病因，其中胰島素抵抗及胰島B細(xì)胞功能受損是目前較為公認(rèn)的主要病因。隨之研究的逐日加深，研究人員發(fā)現(xiàn)胰腺自身亦存在胰島素抵抗的問題，因此保護(hù)胰腺是治療T2DM的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。洋參御唐丸源自民間基礎(chǔ)方，是歷代醫(yī)賢針對消渴病的病因，并結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)擬訂而成，由多種地道名貴中藥材科學(xué)加工制成，具有滋陰補(bǔ)陽，益氣補(bǔ)腎之功。臨床不乏文獻(xiàn)證實(shí)洋參御唐丸對T2DM具有理想的臨床療效，今為進(jìn)一步研究其治療機(jī)制，我們以T2DM模型OLETF大鼠為研究對象，探討洋參御唐丸對血糖水平的影響及其對胰腺形態(tài)的保護(hù)效應(yīng)，具體如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 30只自發(fā)性T2DM動(dòng)物模型OLETF大鼠和15只同系非糖尿病的LETO大鼠作為研究對象，購自日本大塚制藥株式會社德島研究所。

1.1.2 藥物 洋參御唐丸(西洋參、龜甲、山藥、鹿茸、玉竹、葛根、烏梅、黃芪、麥冬、山茱萸等，黑龍江省中西醫(yī)結(jié)合研究所制劑室生產(chǎn))溶于蒸餾水中，濃度為0.8 g/mL。

1.1.3 試劑與儀器 DAB免疫組化試劑盒(ZYMED公司 美國)，葡萄糖檢查試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)研究所，中國)，飽和苦味酸溶液(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)、75%乙醇、0.9%氯化鈉注射液、5%葡萄糖注射液、4%多聚甲醛溶液、液氮、2，3，5-氯化三苯基四氮唑(Sigma)、無水乙醇、蘇木素染色液、伊紅染色液、鏈脲佐菌素。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將30只OLETF大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組和對照組，每組15只；15只同系非糖尿病的LETO大鼠為正常對照組。實(shí)驗(yàn)小鼠下腹部皮膚消毒后，按35 mg/kg劑量于右側(cè)腹腔注射鏈脲佐菌素，72 h后空腹斷尾采血測得血糖值大于或等于11.1 mmol/L為糖尿病小鼠，選取造模成功30只。

1.2.2 干預(yù)方法 1)正常對照組：在SPF級條件下標(biāo)準(zhǔn)飼料，單籠飼養(yǎng)；2)對照組：在正常對照組的基礎(chǔ)上以2 mL蒸餾水灌胃；3)觀察組：洋參御唐丸(西洋參、龜甲、山藥、鹿茸、玉竹、葛根、烏梅、黃芪、麥冬、山茱萸等，黑龍江省中西醫(yī)結(jié)合研究所制劑室生產(chǎn))溶于蒸餾水中，濃度為0.8 g/mL，根據(jù)大鼠體重2.4 g/kg的計(jì)算灌胃劑量，1次/d。療程24周(即大鼠32周齡時(shí)結(jié)束治療)。

1.2.3 檢測指標(biāo)

1.2.3.1 血清葡萄糖濃度檢測 治療前后每組處死5只大鼠，大鼠空腹?fàn)顟B(tài)下采血，空腹血糖(FBG)采用于上海榮盛生物公司購買葡萄糖檢查試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書操作，計(jì)算葡萄糖值。葡萄糖(mmol/L)=標(biāo)本吸光度值/標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值×校準(zhǔn)液濃度(5.55 mmol/L)。

1.2.3.2 胰島結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)觀察 治療前后每組處死5只大鼠，麻醉后打開腹腔分離出胰腺組織于液氮中保存。取出胰腺于10%多聚甲醛中固定，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)技術(shù)石蠟包埋，連續(xù)切片，4 μm/片，常規(guī)HE染色，觀察各組胰島結(jié)構(gòu)變化；另外采用酸性復(fù)紅、麗春紅和桔黃的Masson復(fù)合染色液進(jìn)行染色，膠原纖維呈綠色。

1.2.3.3 胰島功能的檢測 治療前后每組處死5只大鼠，大鼠空腹?fàn)顟B(tài)下采血，空腹胰島素(FINS)采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA法)檢測大鼠血漿胰島素水平，具有根據(jù)上海西塘生物試劑有限公司購買的胰島素試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀450 nm檢測OD值。計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)=Ln(1/(FBG*FINS))，該指數(shù)呈偏態(tài)分布，故取自然對數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 胰腺HE染色形態(tài)學(xué)改變 正常對照組治療前后胰島結(jié)構(gòu)基本正常，治療前對照組和觀察組的大鼠胰島增大，但仍保持正常胰島的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。治療后對照組胰島形狀不規(guī)則，出現(xiàn)大量的纖維組織增生，胰島有明顯的萎縮；觀察組胰島無明顯肥大或萎縮，纖維組織不明顯。如圖1。

2.2 胰腺M(fèi)asson染色形態(tài)學(xué)改變 正常對照組的胰腺結(jié)構(gòu)正常，胰島與外分泌腺的界限分明，治療前對照組和觀察組的胰腺結(jié)構(gòu)也相對正常，未見明顯纖維組織長入胰島。治療后，對照組發(fā)現(xiàn)大量纖維組織長入胰島，與外分泌腺界限不明；而觀察組僅見胰島周邊有少量纖維組織，未見纖維組織長入胰島。見圖2。

2.3 治療前后各組大鼠血糖和功能的影響 治療前，3組FBG、FINS和ISI比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。治療后，與正常對照組比較，對照組和觀察組明顯升高(P<0.05)，ISI降低(P<0.05)。觀察組FBG、FINS均低于對照組(P<0.05)，ISI高于對照組(P<0.05)。見表1。

組別FBG(mmol/L)FINS(μg/L)ISI正常組 治療前(8周齡)5.22±0.841.41±0.15-2.16±0.22 治療后(32周齡)5.19±0.981.38±0.16-2.09±0.24對照組 治療前(8周齡)5.64±0.871.53±0.31-2.13±0.31 治療后(32周齡)8.9±0.763.44±0.35-3.40±0.39觀察組 治療前(8周齡)5.66±0.961.55±0.34-2.14±0.26 治療后(32周齡)7.74±1.022.38±0.24-2.91±0.32

3 討論

有研究顯示小鼠接受胰島素受體基因敲除后可出現(xiàn)不同程度的胰島素抵抗[1]，而因β細(xì)胞功能受損導(dǎo)致胰島素抵抗時(shí)可同時(shí)出現(xiàn)β細(xì)胞分泌胰島素不足[2-4]。由此我們有理由相信胰島素抵抗及β細(xì)胞功能減退是T2DM發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，隨著糖尿病的的發(fā)生發(fā)展，胰腺的形態(tài)逐漸發(fā)生變化，而此類形態(tài)改變是影響胰島功能的基礎(chǔ)。本研究以O(shè)LETF大鼠為研究對象，該大鼠是目前國內(nèi)外首推觀察糖尿病的理想模型[5-9]，本研究對T2DM模型、正常對照組大鼠進(jìn)行胰腺形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常大鼠胰島結(jié)構(gòu)規(guī)則，整齊，而患有T2DM的大鼠胰島形狀不規(guī)則，出現(xiàn)大量的纖維組織增生，胰島有明顯的萎縮，這說明T2DM的發(fā)生的確伴隨著胰島結(jié)構(gòu)的明顯改變，因此我們認(rèn)為某種干預(yù)措施如若可以改善胰島的形態(tài)結(jié)構(gòu)，應(yīng)可以一定程度治療T2DM。

T2DM屬于中醫(yī)學(xué)“消渴病”的范疇，洋參御唐丸源自民間基礎(chǔ)方，是歷代醫(yī)賢針對消渴病的病因，并結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)擬訂而成，由多種地道名貴中藥材科學(xué)加工制成，方中西洋參有滋陰益氣圣經(jīng)功效，清代醫(yī)者張錫純在其《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》一書中寫到：“西洋參性涼而補(bǔ)，凡欲用人參而不受人參之溫者，皆可以此代之”。黃芪有益氣之功，入脾肺經(jīng)且有生血止渴的作用。龜甲有滋陰潛陽作用，元醫(yī)家朱丹溪認(rèn)為龜甲大補(bǔ)陰血之上品。玉竹有養(yǎng)陰益胃生津的功效，女貞子可清虛熱，而山藥有進(jìn)一步健脾胃之功，山茱萸在補(bǔ)陽的同時(shí)可助精，而白芍可斂陰，烏梅亦可如肺經(jīng)，有生津止渴的作用，加之鹿茸有補(bǔ)陽調(diào)沖任的作用。諸藥合用共奏益氣健脾、養(yǎng)陰生津止渴的功效，與消渴病的病機(jī)相互呼應(yīng)[10-15]。眾所周知對于臨床對于T2DM患者主要監(jiān)測指標(biāo)及血糖水平，我們對不同組大鼠進(jìn)行了長達(dá)32周的血糖水平的監(jiān)測，結(jié)果顯示對照組和觀察組大鼠的血糖水平有上調(diào)趨勢，這與國內(nèi)外文獻(xiàn)描述T2DM模型OLETF大鼠隨著周齡的延長，T2DM患病率逐漸增加的研究結(jié)果一致，而在經(jīng)過一段時(shí)間的干預(yù)后服用洋參御唐丸后觀察組大鼠血糖水平明顯低于未接受干預(yù)的大鼠，這一結(jié)果表明我們不但成功飼養(yǎng)了OLETF大鼠，且同時(shí)證實(shí)了洋參御唐丸可理想控制T2DM大鼠的血糖，促使機(jī)體減少對葡萄糖吸收，我們再對3組大鼠胰島形態(tài)學(xué)觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過洋參御唐丸干預(yù)后大鼠胰島的病理學(xué)表征逐漸恢復(fù)，這說明洋參御唐丸可減輕胰島的負(fù)擔(dān)，可糾正受損的胰島功能，恢復(fù)其調(diào)控機(jī)體血糖的能力，減少胰島的病理學(xué)損害。在形態(tài)學(xué)染色中我們發(fā)現(xiàn)觀察組大鼠胰島的纖維化變性程度逐漸減弱，比較未干預(yù)大鼠可充分說明洋參御唐丸可維持胰島的正常結(jié)構(gòu)，以實(shí)現(xiàn)預(yù)防糖尿病的目的。

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EffectofYangshenYutangPillonBloodGlucoseandStructureandFunctionofPancreasinRats

Zhao Dapeng, Xie Ning

(HeilongjiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Harbin150000,China)

Objective:To observe the effect of Yangshen Yutang Pill on blood glucose, structure and function of pancreas in rats.MethodsThirty 8-week-old OLETF rats were randomly divided into intervention group and control group with 15 rats in each group and 15 8-week-old syngeneic non-diabetic LETO rats were taken as blank control group. Blank control group: rats were fed at the SPF level with standard feedings and one rat in single cage; control group: 2 mL of distilled water was added compared to the blank control group; the intervention group: Rats took Yangshen Yutang Pill distilled into solution by gavage for 24 weeks. The rats were executed in each group before and after the treatment to test the serum glucose concentration and the fasting insulin (FINS) by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method) and HE staining and Masson staining were used to observe the morphology of pancreas structure.Results1) Pancreatic morphology by HE staining showed that the pancreas of rats in the control group after the treatment was irregular in shape with the emergence of a large number of fibrous tissue hyperplasia and there was obvious atrophy in the pancreas but no obvious hypertrophy or atrophy and fibrous tissue in the pancreas of rats in the intervention group. 2) Pancreatic morphology by Masson staining showed that a large number of fibrous tissue appeared in pancreas of rats in the control group and boundaries between pancreas and exocrine glands were ambiguous after the treatment, while only a small amount of fibrous tissue appeared surrounding the pancreas of rats in the intervention group with no fibrous tissue in the pancreas. 3) Compared with the blank control group, the control group and the intervention group were significantly higher after the treatment (P<0.05) and ISI decreased(P<0.05). The FBG and FINS in the intervention group were lower than those in the control group (P<0.05) and ISI was higher than that in the control group (P<0.05).ConclusionYangshen Yutang Pill may effectively regulate the blood glucose level of OLETF rats and improve the function and structure of pancreas.

Yangshen Yutang Pill; Rats; Blood glucose; Pancreas structure; Pancreas function

黑龍江省博士后資助項(xiàng)目(LBH-Z13192)；黑龍江省自然科學(xué)基金(面上項(xiàng)目)(H2015022)

趙大鵬(1979.08—)，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：糖尿病的中西醫(yī)結(jié)合治療，E-mail：z_1098@126.com

R255.4;R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.039

(2017-03-10收稿 責(zé)任編輯：王明)