中藥醫(yī)院制劑活血益氣方對(duì)裸鼠抑瘤作用及小鼠急性毒性的實(shí)驗(yàn)研究

陳 菲 馮英楠 莊 偉 張 鵬 林曉蘭

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥劑科，北京，100053)

中藥醫(yī)院制劑活血益氣方對(duì)裸鼠抑瘤作用及小鼠急性毒性的實(shí)驗(yàn)研究

陳 菲 馮英楠 莊 偉 張 鵬 林曉蘭

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥劑科，北京，100053)

目的：測(cè)試首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥劑科制劑活血益氣方抗瘤丸的抑瘤作用及對(duì)小鼠的急性毒性。方法：將足夠量的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞注射至裸鼠右側(cè)腋窩，建立裸鼠荷瘤模型，按瘤塊體積隨機(jī)分組，分別灌胃給予KLW的高、低劑量組，以替莫唑胺為陽(yáng)性對(duì)照，以溶媒為陰性對(duì)照，期間測(cè)量裸鼠體重、瘤體積并觀察給藥前后動(dòng)物癥狀；連續(xù)給藥15 d后，處死全部小鼠，稱(chēng)量裸鼠瘤重量；剝離瘤塊，采用Western Blot法檢測(cè)腫瘤組織Bcl-2，Bax蛋白。選用ICR(Institute of Cancer Research，ICR)小鼠1 d內(nèi)2次灌胃給藥KLW，肉眼觀察給藥前、每次給藥后連續(xù)4 h及14 d內(nèi)小鼠的一般情況，中毒反應(yīng)及死亡情況，結(jié)束觀察后解剖，肉眼觀察各組織臟器的變化。結(jié)果：裸鼠給藥期間全部存活，體重正常增長(zhǎng)，一般行為學(xué)觀察未見(jiàn)明顯異常。給藥15 d后，KLW低、高劑量組，瘤體積、瘤重量較模型對(duì)照組顯著減小；Bcl-2/Bax的比例較模型對(duì)照組顯著增加。急性毒性試驗(yàn)中所有給藥組小鼠在觀察期內(nèi)全部存活，一般行為學(xué)觀察未見(jiàn)明顯異常。供試品組2個(gè)性別的小鼠體重與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。剖檢各組小鼠，肉眼觀察各組織臟器未見(jiàn)病理改變。結(jié)論：KLW低、高劑量組對(duì)C6細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，該作用與誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)，與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。KLW小鼠灌胃40 mL/kg BW，最大給藥濃度(0.50 g/mL)，相當(dāng)于臨床人用劑量的107倍，未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng)，使用安全性高。

抗瘤丸；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；裸鼠；凋亡；小鼠；急性毒性

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的，惡性程度極高的一類(lèi)腫瘤[1]。放、化療不良反應(yīng)嚴(yán)重，有一定的局限性，且療效均不理想。中藥治療腫瘤具有一定的有效性，且安全性高，因此受到人們?cè)絹?lái)越多的重視[2]。醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑活血益氣方抗瘤丸(簡(jiǎn)稱(chēng)KLW)是針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的純中藥復(fù)方制劑。臨床使用30余年，經(jīng)驗(yàn)證明安全有效，價(jià)格低廉。然而作為醫(yī)院制劑，缺乏系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)支持其抑瘤療效及抑瘤機(jī)理，嚴(yán)重影響了該藥的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與使用。故本文通過(guò)裸鼠抑瘤實(shí)驗(yàn)，研究KLW在裸鼠荷瘤模型中的抑瘤作用，以及與誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)系，并通過(guò)小鼠急性毒性試驗(yàn)考察KLW的安全性，為KLW的進(jìn)一步應(yīng)用、研究、開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 ICR小鼠，雌雄各半，18～22 g；裸小鼠BALB/c，雄性，18～22 g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi))。

1.1.2 藥物 供試品醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑活血益氣方抗瘤丸，陽(yáng)性藥替莫唑胺膠囊(泰道)，簡(jiǎn)稱(chēng)TMZ(購(gòu)于北京宣武醫(yī)院)。

1.1.3 試劑與儀器 試劑：試劑胎牛血清(FBS)，DMEM培養(yǎng)基，胰蛋白酶，水合氯醛。儀器：CO2培養(yǎng)箱(NAPCO 6500型)，生物安全柜(CLASS TYPE B2型)，臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf centrifuge 5430R)，電子數(shù)顯卡尺(SF2000型)，倒置顯微鏡(Leica DM3000)，電子d平(PB602-N，TE2101-L)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 按瘤塊大小分組，使每組裸鼠的瘤塊體積和體重平均值相似。制備模型：1)細(xì)胞培養(yǎng)：C6細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中，置37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)。2)裸鼠荷瘤模型建立：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6細(xì)胞懸液注射于裸鼠右側(cè)腋下，5×106個(gè)細(xì)胞/只。小鼠急性毒性試驗(yàn)分組：將ICR小鼠按體重隨機(jī)分組，每組雌雄各半。

1.2.2 給藥方法 1)裸鼠抑瘤實(shí)驗(yàn)：分別灌胃給予不同濃度KLW：低劑量組0.85 g生藥/kg，高劑量組3.4 g生藥/kg，陽(yáng)性對(duì)照組給予替莫唑胺43 mg/kg，模型對(duì)照組給予同體積溶媒(蒸餾水)。1次/d，連續(xù)給藥15 d。2)小鼠急性毒性試驗(yàn)：分組后1 d內(nèi)給藥2次，給藥間隔4 h。給藥前禁食12～16 h，按分組時(shí)體重計(jì)算給藥量，口服灌胃給藥按40 mL/kg BW計(jì)算。實(shí)驗(yàn)組給予抗瘤丸最大給藥濃度(0.50 g/mL)，陰性對(duì)照組灌胃給予等體積溶媒(蒸餾水)。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 裸鼠抑瘤實(shí)驗(yàn):1)腫瘤體積及瘤重：測(cè)量分別在給藥第0、3、6、9、12、15 d測(cè)量裸鼠體重、腫瘤最大直徑L(cm)和最小直徑D(cm)，計(jì)算腫瘤體積V(cm3)的大小(腫瘤體積=1/2×L2×D)，觀察裸鼠一般狀態(tài)。并于給藥15 d后處死，剝離瘤塊稱(chēng)重。2)腫瘤組織Bcl-2，Bax蛋白Western Blot檢測(cè)：每組隨機(jī)取5個(gè)瘤塊，剪碎組織，加入蛋白裂解液和PMSF，離心，所得上清液使用BCA法檢測(cè)總蛋白濃度，調(diào)平。加入上樣緩沖液，取等量蛋白上樣，10%的電泳分離膠和5%的電泳濃縮膠中電泳。200 mA電流下轉(zhuǎn)膜約2 h，0.1%脫脂奶粉-TBST封閉1 h，加Bcl-2或Bax一抗(1∶200稀釋)，4 ℃過(guò)夜孵育后，漂洗6次，5 min/次，加入二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h后漂洗,在暗室用顯色液顯影，成像。3)一般狀態(tài)觀察：分別于給藥前、每次給藥后連續(xù)4 h、給藥1次/d后連續(xù)觀察14 d。觀察給藥當(dāng)日對(duì)動(dòng)物外觀體征、行為活動(dòng)、腺體分泌、呼吸、糞便及死亡等進(jìn)行觀察[3]。分別于給藥當(dāng)日給藥前稱(chēng)體重，給藥后第1、4、7、11、14 d稱(chēng)體重(以給藥當(dāng)d為D0d)。飼料加入量每次為150 g/籠，D0d首次給藥后7～29 min內(nèi)每籠加入約50 g飼料。分別于給藥后第1、7、14 d收集飼料盒內(nèi)的剩余飼料，用d平稱(chēng)重。

24 h攝食量=[(飼料給予量-飼料剩余量)/籠內(nèi)動(dòng)物體重的總和]×10 g

每日平均攝食量(g/10 gBW)=[(飼料給予量-飼料剩余量)/(d數(shù)×籠內(nèi)動(dòng)物體重的總和)]×10 g

4)剖檢及觀察：腹腔注射4%水合氯醛將小鼠麻醉，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行外觀檢查，并對(duì)小鼠主要臟器，包括心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸、氣管、腎上腺、睪丸及附睪(雄性)、子宮及卵巢(雌性)、胸腺，進(jìn)行剖檢，肉眼觀察有無(wú)明顯的組織器官異常。對(duì)肉眼觀察異常器官進(jìn)行病理學(xué)檢查。

表1 給藥后各組裸鼠瘤體積

注：與模型組比較*P<0.05

2 結(jié)果

2.1 裸鼠抑瘤實(shí)驗(yàn)

2.1.1 行為學(xué)觀察 裸鼠給藥期間全部存活，一般狀態(tài)未見(jiàn)明顯異常，且組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.1.2 瘤體積 給藥15 d后，動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示，KLW低、高劑量組，TMZ組能顯著抑制C6細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)，與模型對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.1.3 瘤體重量 給藥15 d處死動(dòng)物后，剝?nèi)「鹘M動(dòng)物瘤塊稱(chēng)重進(jìn)行比較，KLW-1低、高劑量組，陽(yáng)性藥對(duì)照組移植瘤的重量明顯<模型對(duì)照組，差異具有顯著性意義。見(jiàn)表2。

表2 給藥15 d各組裸鼠瘤重量比較

注：與模型組比較*P<0.05

2.1.4 腫瘤組織Bcl-2，Bax蛋白 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組能明顯下調(diào)Bax的表達(dá)，KLW低、高劑量組和TMZ組，能明顯上調(diào)Bax的表達(dá)，各組的Bcl-2都低表達(dá)，因此模型對(duì)照組Bcl-2/Bax的比例降低，各給藥組Bcl-2/Bax的比例升高，各給藥組都具有促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。見(jiàn)圖1。

圖1 C6裸鼠移植瘤中Bax，Bcl-2的表達(dá)

注：1.模型對(duì)照組；2.KLW低劑量組；3.KLW高劑量組；4.陽(yáng)性對(duì)照組

2.2 小鼠急性毒性試驗(yàn)

2.2.1 小鼠一般狀態(tài) 小鼠灌胃給藥2次/d，在每次給藥后4 h內(nèi)，狀態(tài)觀察未見(jiàn)明顯異常反應(yīng)。給藥后連續(xù)觀察14 d，小鼠全部存活一般狀態(tài)未見(jiàn)明顯異常。KLW組與陰性對(duì)照組小鼠攝食量相近。見(jiàn)表3。

表3 抗瘤丸小鼠口服給藥急性毒性試驗(yàn)攝食量結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

圖2 抗瘤丸對(duì)雄性小鼠體重的影響

圖3 抗瘤丸對(duì)雌性小鼠體重的影響

2.2.2 體重測(cè)定 KLW組2個(gè)性別的小鼠在14 d觀察期內(nèi)體重均正常增長(zhǎng)，與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。體重統(tǒng)計(jì)結(jié)果與體重增長(zhǎng)見(jiàn)圖2、3。

2.2.3 剖檢結(jié)果 對(duì)陰性對(duì)照組和KLW組小鼠進(jìn)行剖檢，主要器官均未見(jiàn)異常。由于在剖檢過(guò)程中，肉眼觀察未見(jiàn)有病變的組織，器官，故未進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。在本實(shí)驗(yàn)中，給予小鼠抗瘤丸0.50 g/mL，40 mL/kg BW時(shí)，相當(dāng)于臨床劑量的107倍，未見(jiàn)毒副反應(yīng)。

3 討論

膠質(zhì)瘤是起源于腦部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，臨床常表現(xiàn)為頭痛、惡心、嘔吐、視力減退、復(fù)視、癲癇發(fā)作和精神癥狀等。本病屬中醫(yī)學(xué)“頭痛”“真頭痛”等疾病范疇。中醫(yī)認(rèn)為腫瘤的發(fā)生病理機(jī)制多由于人體正氣不足,感受毒邪所致。膠質(zhì)瘤毒邪內(nèi)侵，痰瘀互阻證，日久化熱，痰瘀熱毒隨風(fēng)流注，善行數(shù)變，因此膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)難以切除干凈，容易復(fù)發(fā)，因此藥物治療在抗膠質(zhì)瘤中十分重要。

抗瘤丸清熱解毒,活血化瘀,化痰散結(jié)，為治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的中藥復(fù)方制劑，國(guó)家“六五”重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目，獲北京科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)。北京軍區(qū)總醫(yī)院、天津醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、北京大學(xué)第一附屬醫(yī)院等多中心臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，153例腦膠質(zhì)瘤的平均有效率為64.7%[4]。回顧性研究表明，院內(nèi)制劑KLW可以延長(zhǎng)惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生存時(shí)間，具有肯定療效[5]。然而，作為醫(yī)院制劑缺乏有效性及安全性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，限制其使用與發(fā)展。

惡性腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)的增殖異常、凋亡抑制等特性在腫瘤的形成與轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。大量研究證明，KLW主要抗瘤成分包括三七、白花蛇舌草、半枝蓮、白英、山楂、何首烏等抑瘤機(jī)理與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)[6-14]。前期裸鼠荷瘤預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KLW具有良好的抑瘤作用。經(jīng)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證明KLW的作用與抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6、U87、U251的增殖作用有關(guān)[15-17]。

荷瘤裸鼠模型是經(jīng)典模型，在腫瘤的前瞻性研究、抗癌藥藥理研究和抗癌藥早期療效評(píng)估中占據(jù)十分重要的地位。膠質(zhì)瘤裸鼠異位移植模型水平的研究，比腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)水平的研究，更能模擬人體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)情況及藥物吸收代謝情況，故在該模型中驗(yàn)證KLW的抑瘤效果能夠很好的模擬臨床治療，結(jié)果可靠。研究結(jié)果顯示，KLW高、低2個(gè)劑量組均能顯著減小膠質(zhì)瘤體積、降低瘤重量，與模型對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證明KLW可在一定程度上抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)，從而起到治療作用。

正常情況下，細(xì)胞增殖與凋亡保持動(dòng)態(tài)平衡，而惡性腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)的增殖異常、凋亡抑制等特性在腫瘤的形成與轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤抑制機(jī)理的重要方向[18]，在眾多的凋亡調(diào)控基因中，Bcl-2蛋白家族備受關(guān)注，其中Bcl-2、Bax發(fā)揮重要作用，尤其是Bcl-2/Bax比率是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的“分子開(kāi)關(guān)”[19]。研究結(jié)果顯示，KLW能明顯上調(diào)Bax的表達(dá)，導(dǎo)致Bcl-2/Bax的比例增加，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。研究證明，KLW的抑瘤作用與促進(jìn)膠質(zhì)瘤凋亡相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示KLW具有一定的抑制膠質(zhì)瘤作用，該作用與促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)。為進(jìn)一步研究抗瘤丸作用機(jī)理指明方向。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示KLW具有較高的安全性，小鼠在臨床劑量107倍時(shí)未能檢測(cè)到毒性。同時(shí)，與膠質(zhì)瘤指南推薦藥替莫唑胺比較，醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑抗瘤丸作用較為緩慢，單日服藥劑量較大，體現(xiàn)中藥需較大劑量、長(zhǎng)期服用，但安全性高的特點(diǎn)，為今后臨床使用提供依據(jù)，為該藥的進(jìn)一步研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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ExperimentalStudyonEffectsofHuoxueYiqiFangPreparedbyTCMHospitalinTumorInhibitedEffectsofNudeMiceandAcuteToxicityofMice

Chen Fei，F(xiàn)eng Yingnan，Zhuang Wei，Zhang Peng，Lin Xiaolan

(DepartmentofPharmacy，XuanwuHospitalofCapitalMedicalUniversity，Beijing100053，China)

Objective:To investigate the tumor inhibited effect and acute toxicity to mice by Huoxue Yiqi Fang Kangliu Wan (KLW) prepared by hospital.MethodsA plenty of glioma C6 cells were injected into right side of nude mice to establish nude mice model of bearing cancer.According to tumor volume，the nude mice were randomly divided into two groups，and separately to irrigate mice with high or low dose KLW.The temozolomide was as positive group and solvents (pure water) was as negative group.The weight and tumor volume of mice were investigated and symptoms were observed before and after medication.After continuous administration for 15 days，the mice were killed and tumors were weighted，and Western blot was used to detect Bcl-2，Bax.ICR mice were irrigated with KLW twice a day，then the general conditions，toxic reaction and death condition before administration and after administration 4 h and 14 days was reviewed with naked eyes.At last the mice were anatomized and organ changes of mice were observed.ResultsAll nude mice were alive in medication session with weight added，and there was no significant abnormality in general behavioral observation.After administration for 15 days，the tumor volume and weight were significantly declined in both high and low dose group.The scale model of Bcl-2/Bax of control group significantly grew.All administration group mice were alive and there was no significant abnormality in general behavioral observation in the period under observation.There was no significant difference between the two sexes of mice and the negative control group (P<0.05).Anatomical observation on each mice′s organ found no abnormality.ConclusionBoth high and low dose KLW have significant inhibiting effect on the growth of xenograft of C6 cells，and this effect was related to induced glioma apoptosis.It also has statistical significance compared with negative control group.KLW dose is 40 mL/kg BW and maximum dose is 0.50 g/mL，which are 107 times of human clinical dose.There is no significant toxicity effect，so it is safe.

Kangliu Wan; Glioma; Nude Mouse; Apoptosis; Mouse; Acute Toxicity

北京市科委十病十藥研發(fā)專(zhuān)項(xiàng)(Z20141100002214016)；首都中醫(yī)藥研究專(zhuān)項(xiàng)(17Z13)

陳菲(1984.11—)，女，碩士，主管藥師，研究方向：中藥學(xué)中藥新藥研發(fā)方向，E-mail：chenfeijill@163.com

林曉蘭(1963.08—)，女，學(xué)士，主任藥師，行政副主任，研究方向：中藥學(xué)中藥制劑研發(fā)與醫(yī)院藥學(xué)管理方向，E-mail：xllin83@163.com

R285.5

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10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.037

(2016-06-13收稿 責(zé)任編輯：張文婷)