甘蔗ScF-box基因cDNA全長(zhǎng)克隆和生物信息學(xué)分析

呂愛(ài)麗，劉洪博，李旭娟，吳才文，劉新龍*，曾千春

( 1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 開(kāi)遠(yuǎn) 651699；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

甘蔗ScF-box基因cDNA全長(zhǎng)克隆和生物信息學(xué)分析

呂愛(ài)麗1，2，劉洪博1，李旭娟1，吳才文1，劉新龍1*，曾千春2*

( 1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 開(kāi)遠(yuǎn) 651699；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

【目的】獨(dú)腳金內(nèi)酯是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型激素，能夠有效抑制植物分枝(蘗)，在其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中MAX2/RMS4/D3基因扮演著十分關(guān)鍵的作用。為了研究該基因在甘蔗分蘗性狀表現(xiàn)中的功能作用具有重要意義?！痉椒ā勘狙芯坷肦T-PCR和RACE技術(shù)克隆出其同源基因(ScF-box)的cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)其序列和編碼蛋白開(kāi)展生物信息學(xué)分析?！窘Y(jié)果】ScF-box基因的cDNA全長(zhǎng)為2642 bp(KR870233)，具2103 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF，113～2215 bp)，編碼700個(gè)氨基酸；蛋白質(zhì)分析表明，ScF-box為不穩(wěn)定的水溶性非分泌蛋白，主要在氨基酸生物合成和中央中介代謝中發(fā)揮作用。亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)，存在22個(gè)磷酸化位點(diǎn)，4個(gè)NES信號(hào)和1個(gè)NLS信號(hào)位點(diǎn)，不存在信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，保守結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)均表明該蛋白存在一個(gè)F-box結(jié)構(gòu)，能特異識(shí)別與之作用的底物?！窘Y(jié)論】推測(cè)ScF-box可能作為獨(dú)腳金內(nèi)酯調(diào)控甘蔗分蘗信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個(gè)具有特異性識(shí)別功能的組分而起作用。進(jìn)化樹分析表明該蛋白與高粱、玉米等單子葉植物進(jìn)化關(guān)系較近。

甘蔗；獨(dú)腳金內(nèi)酯；ScF-box；克?。簧镄畔W(xué)

【研究意義】甘蔗是一種多年生禾本科C4作物，是蔗糖生產(chǎn)的主要原料，也可作為能源材料用于酒精燃料的生產(chǎn)[1]。生產(chǎn)上主要靠收獲甘蔗的有效莖作為產(chǎn)品，有效莖數(shù)的多少和單莖重對(duì)于甘蔗最終產(chǎn)量的形成影響極大[2]。而甘蔗有效莖數(shù)的多少，主要受品種分蘗能力的大小的影響，因此分蘗性狀是影響品種最終產(chǎn)量的關(guān)鍵因素[3-5]，分蘗性狀是甘蔗品種十分重要的農(nóng)藝性狀，直接影響到甘蔗品種最終有效莖數(shù)的多少[3]，挖掘調(diào)控甘蔗分蘗性狀表現(xiàn)的優(yōu)異基因?qū)τ诶梅肿佑N技術(shù)改良甘蔗品種產(chǎn)量具有十分重要的意義。

【前人研究進(jìn)展】近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)一類新的植物激素-獨(dú)腳金內(nèi)酯能夠有效抑制植物分蘗[6-7]。該激素最先由cook等[8-9]對(duì)寄生植物種子萌發(fā)刺激物的研究中發(fā)現(xiàn)。鑒于其對(duì)禾本科植物分蘗性狀調(diào)控的重要性，其信號(hào)傳導(dǎo)途徑一些關(guān)鍵的調(diào)控基因已被相繼克隆，如D3/F-box[10]，D14/D88/HTD2[11-13]，D53[14-15]，它們之間可相互作用形成復(fù)合物，并使D53泛素化而被蛋白酶體特異降解，從而將獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)傳遞給下游基因抑制植物分枝(蘗)。

【本研究切入點(diǎn)】水稻D3屬F-box蛋白家族，含F(xiàn)-box結(jié)構(gòu)域，與擬南芥中的MAX2和豌豆中的RMS4屬于同源基因，主要在泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin proteasome pathway, UPP)中起作用。在UPP途徑中，F(xiàn)-box蛋白參與形成SCF復(fù)合體，通過(guò)泛素化-26S 蛋白酶體途徑介導(dǎo)底物蛋白的降解，該復(fù)合體對(duì)底物識(shí)別的特異性主要依靠F-box結(jié)構(gòu)[16]。而F-box結(jié)構(gòu)域的特異性又主要來(lái)自于其C端有與底物蛋白間相互作用的結(jié)構(gòu)，如LRR和鋅指結(jié)構(gòu)等[17]。

【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】雖然分蘗性狀對(duì)于甘蔗產(chǎn)量的形成十分重要，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于該性狀的分子機(jī)制研究還處于空白。鑒于此，本研究采用基因克隆技術(shù)從甘蔗品種中克隆出獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因ScF-box，并對(duì)其序列和結(jié)構(gòu)開(kāi)展生物信息學(xué)分析，以期為該基因的功能分析和后續(xù)的分子輔助育種奠定良好的前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

以中國(guó)蔗區(qū)種植面積最大的品種ROC22為研究材料，采集其幼嫩葉片用于總RNA的提取。

1.2 基因克隆

1.2.1 cDNA模板合成 先用液氮將采集的幼嫩葉片迅速研磨成粉末，然后使用全式金TransZolTM Plant RNA試劑盒提取葉片總RNA，RNA質(zhì)量和濃度使用1.0 %的瓊脂糖凝膠和Bio Drop Lite PC超微量可見(jiàn)紫外分光度計(jì)檢測(cè)，再用Trans Script One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因片段擴(kuò)增和轉(zhuǎn)化 參考前人報(bào)道的電子克隆技術(shù)[18-20]，以小米草(Setariaitalica)和高粱(Sorghumbicolor)等作物的D3同源基因序列為探針在GenBank數(shù)據(jù)檢索甘蔗EST文庫(kù)，拼接相似性大于90 %的EST序列，將拼接序列與玉米、高粱等作物的D3同源基因序列進(jìn)行比對(duì)校對(duì)分析。然后根據(jù)拼接序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)RT-PCR引物(表1)；使用TransTaqDNA Polymerase High Fidelity(HiFi) 擴(kuò)增基因片段序列，PCR體系按照說(shuō)明書進(jìn)行；擴(kuò)增產(chǎn)物回收后連接PEASY-T5 Zero Cloning Kit載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選取5個(gè)克隆交由深圳華大測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.3 'RACE實(shí)驗(yàn)和cDNA全長(zhǎng)序列獲得 以獲得的比對(duì)正確的基因片段序列為模板，設(shè)計(jì)RACE基因特異引物(表1)，使用SMARTERTMRACE cDNAAmplification Kit試劑盒進(jìn)行RACE產(chǎn)物的擴(kuò)增，相關(guān)實(shí)驗(yàn)體系參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，產(chǎn)物回收、連接轉(zhuǎn)化、測(cè)序和序列比對(duì)同上。使用Vector NTI 11.5軟件進(jìn)行基因片段和RACE產(chǎn)物序列的拼接，獲得所克隆基因的cDNA全長(zhǎng)序列。

表1 ScF-box基因克隆引物

1.3 ScF-box基因生物信息學(xué)分析

根據(jù)ScF-box基因的克隆結(jié)果，利用在線工具ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi) 找到ScF-box開(kāi)放閱讀框，推導(dǎo)出其氨基酸序列。利用NetPhos 2.0工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)、ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)、InterPro(http://www.ebi. ac. uk/ interpro/)分析預(yù)測(cè)ScF-box氨基酸序列的磷酸化位點(diǎn)、親水性、保守結(jié)構(gòu)域。利用NetNES 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetNES/)、cNLS Mapper(http://nls- mapper. iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)進(jìn)行核輸出信號(hào)(NES)和核定位信號(hào)(NLS)預(yù)測(cè)。利用TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)以及PSORT II Prediction、NetAcet 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetAcet/)、TMHMM2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)、SignalP4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、ProtParam 工具(http://web. expasy. org/protparam/)、Protfun(http://www.cbs. dtu.dk/services/ProtFun/)進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位、乙酰化位點(diǎn)、跨膜區(qū)、潛在信號(hào)肽剪切位點(diǎn)、蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)、功能分析。利用Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page= npsa_gor4.html)、swiss-model(http://swiss model. expasy.org)和Swiss PDB Viewer預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

在NCBI( http: //www.Ncbi.nlm.nih.gov /)中應(yīng)用在線程序BLASTn進(jìn)行同源比對(duì)，再在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)( http: //www.Uniprot.org /)中應(yīng)用BLASTp尋找并下載ScF-box同源蛋白序列，采用MEGA5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 ScF-box基因全長(zhǎng)cDNA 的克隆

以小米草(XM_004964760)和高粱(XM_002436454)等作物的D3同源基因序列為探針在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到14條相似性大于90 %的甘蔗EST序列(CA107162.1，CA111254.1，CA112741.1，CA113507.1， CA187813.1，CA261883.1，CA262824.1，CA271949.1，CA285304.1，CA287261.1，CF570958.1，DV636131.1，DV733122.1，JZ350146.1)，經(jīng)電子克隆可拼接成一條長(zhǎng)度為1834 bp序列，經(jīng)與水稻(AK065478)、二穗短柄草(XM_003564267)、小米草和高粱D3同源基因序列比對(duì)，具有高度的相似性。經(jīng)DNAMAN軟件比對(duì)分析，該序列包含1408 bp的部分編碼區(qū)序列和427 bp的3’端非編碼區(qū)序列。

使用RT-PCR引物D3-319-F和D3-1367-R成功獲得長(zhǎng)度為1049 bp的基因片段產(chǎn)物(圖1a)，經(jīng)比對(duì)分析與電子克隆序列一致，證實(shí)所拼接電子克隆序列正確。使用3’RACE引物D3-601-F和D3-866-F進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增，獲得略大于600 bp的序列(圖1b)，回收、測(cè)序、比對(duì)分析驗(yàn)證3’UTR序列正確，長(zhǎng)度為652 bp。用5’RACE基因特異引物D3-418-R和D3-350-R經(jīng)2輪PCR獲得一條長(zhǎng)度略大于1000 bp的片段(圖1c)，回收、測(cè)序、比對(duì)分析后為正確的5’RACE產(chǎn)物，長(zhǎng)度為1157 bp。將基因片段和RACE產(chǎn)物序列比對(duì)拼接獲得長(zhǎng)度為2 642 bp的cDNA全長(zhǎng)序列，所獲得的基因序列命名為ScF-box，其GenBank Accession Number為KR870233。

M為Marker, a為RT-PCR產(chǎn)物, b為3’RACE產(chǎn)物, c為5’RACE產(chǎn)物M, Marker; a, RT-PCR product; b, 3’RACE product; c, 5’RACE product圖1 ScF-box基因克隆電泳圖Fig.1 Arg tesing image of cloning ScF-box gene

一級(jí)結(jié)構(gòu)特性Primarystructurecharacteristics預(yù)測(cè)結(jié)果Predictionresults編碼氨基酸數(shù)(個(gè))700等電點(diǎn)(PI)5.17分子量(MW)/Da76342.9負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)89正電荷殘基(Arg+Lys)64分子式(kD)C3415H5381N925O991S34不穩(wěn)定系數(shù)(II)52.9平均疏水性(GRAVY)0.130脂肪系數(shù)(AI)100.76

使用ORF finder分析發(fā)現(xiàn)，該基因含有 1個(gè)2103 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF，113～2215 bp)，編碼700個(gè)氨基酸，具有112 bp的5’非編碼區(qū)序列和427 bp 3’非編碼區(qū)序列。

2.2 甘蔗ScF-box基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 甘蔗ScF-box基因編碼氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 根據(jù)在線工具ExPASy-ProtParam對(duì)甘蔗ScF-box基因進(jìn)行預(yù)測(cè)(表2)，可知該蛋白分子式為C3415H5381N925O991S34，編碼的氨基酸個(gè)數(shù)為700個(gè)，分子量MW為76 342.9 kDa，等電點(diǎn)(pI) 為5.17，負(fù)電荷殘基(Asp+Glu) 有89個(gè)，正電荷殘基 (Arg+Lys) 有64個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)(II) 為52.9，平均疏水性(GRAVY) 為0.130，脂肪系數(shù)(AI) 為100.76，由此可判斷ScF-box是一個(gè)不穩(wěn)定性蛋白。

2.2.2 甘蔗ScF-box蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 根據(jù)Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(HNN)預(yù)測(cè)ScF-box蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2所示，上行為氨基酸序列，下行為其對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中h代表helix(α-螺旋)，e代表extended(鏈延伸)，c 代表coil(無(wú)規(guī)則卷曲)。從預(yù)測(cè)結(jié)果可知，ScF-box二級(jí)結(jié)構(gòu)組分中，α-螺旋(h)占35.57 %，鏈延伸(e)占12.86 %，無(wú)規(guī)則卷曲(c)占51.57 %。表明該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)是以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主。

老年人雌激素水平降低，陰道內(nèi)環(huán)境破壞，菌群失調(diào)，容易發(fā)生陰道炎。老年性陰道炎具有病情反復(fù)、病程長(zhǎng)、難以治愈等特點(diǎn)，而合并糖尿病患者細(xì)胞功能低下，給該病的治療更增加了難度[1]。病情反復(fù)發(fā)作，給老年糖尿病性陰道炎患者帶來(lái)了很大困擾，嚴(yán)重降低其降低生活質(zhì)量[2]。該院2016年7月—2018年1月間對(duì)52例老年糖尿病陰道炎患者給予保婦康栓聯(lián)合雌激素軟膏治療，效果滿意。報(bào)道如下。

2.2.3 甘蔗ScF-box蛋白疏水性/親水性的預(yù)測(cè)分析 利用ExPASy的Protscale分析表明(圖3)：該蛋白疏水性最大值為2.522，親水性最小值為-2.589。由預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)和圖7(零點(diǎn)以上為疏水區(qū)，零點(diǎn)以下為親水區(qū))可知，該氨基酸序列內(nèi)絕大多數(shù)為親水性殘基，表明甘蔗ScF-box為水溶性蛋白。

2.2.4 甘蔗ScF-box蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析 SignalP4.0預(yù)測(cè)ScF-box蛋白跨膜區(qū)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，最大Y值為0.155，最大C值為0.186，最大S值為0.313都沒(méi)超過(guò)閾值線，表明在ScF-box氨基酸序列中不存在信號(hào)肽或者可能性小。同時(shí)S-mean值為0.234，D值0.197，小于0.5，故可知該蛋白屬于非分泌蛋白(圖4)。

圖2 ScF-box蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Secondary structure prediction of ScF-box

圖3 ScF-box氨基酸親水性分析結(jié)果Fig.3 The hydropathy profile of ScF-box amino acids

2.2.5 甘蔗ScF-box蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用ScF-box編碼蛋白在Uniprot中搜索比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ScF-box編碼蛋白與高粱，玉米，小米(Setariaitalica)，水稻(Oryzasativa)，短穗二柄草(Brachypodiumdistachyon)等單子葉禾本科植物一致性較高，分別是96 %，94 %，89 %，77 %，80 %。選取相似性最高的高粱蛋白模型(PDB ID：3C6O)，其三維結(jié)構(gòu)由Cn3D觀察如圖5a所示，整個(gè)模型像一個(gè)鉆頭一樣，在其中間有2個(gè)球棍結(jié)構(gòu)，四周由α螺旋環(huán)繞呈圓形，其一端存在4個(gè)α螺旋組成的尖頭結(jié)構(gòu)。推測(cè)該蛋白可能是通過(guò)這個(gè)尖頭結(jié)構(gòu)而與底物特異結(jié)合。該蛋白由2個(gè)肽段組成，一個(gè)是SKP1-like protein 1A(包含BTB和SKP1 2個(gè)超家族)，另一個(gè)是Transport Inhibitor Response 1(包含1個(gè)F-BOX和2個(gè)AMN1超家族)，其中存在1個(gè)特異位點(diǎn)F-BOX，其功能是作為泛素化目標(biāo)底物的受體。再由Swiss-Model預(yù)測(cè)存在3個(gè)可能的三維結(jié)構(gòu)模型，選取相似性最高的(30 %)模型3C6O.1.B，相似度>30 %一般認(rèn)為模型可靠。用Swiss PDB Viewer觀察其結(jié)構(gòu)如圖5b所示，Ramachandran[圖(5c)]顯示多數(shù)殘基落在穩(wěn)定區(qū)域和最大允許范圍內(nèi)，可知該結(jié)構(gòu)穩(wěn)定可靠。

圖4 ScF-box 跨膜信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of ScF-box transmembrane signal peptide

2.2.6 甘蔗ScF-box蛋白的功能預(yù)測(cè) 利用CBS的Protfun軟件分析并預(yù)測(cè)ScF-box蛋白結(jié)構(gòu)功能域及功能分類。從分析結(jié)果可知，該蛋白具有氨基酸生物合成(Amino acid biosynthesis)、生物合成的輔助因子( Biosynthesis of cofactors)、中央中介代謝(Central intermediarymetabolism)、能量代謝(Energy metabolism)、嘌呤和嘧啶(Purines and pyrimidines)、脂肪酸代謝(Fattyacid metabolism)、翻譯(Translation)功能的可能性分別為12.863、4.943、6.754、3.977、2.303、2.508、3.140(表3)，說(shuō)明ScF-box在氨基酸生物合成中很可能有重要作用，因?yàn)槠浞g的功能，可能對(duì)于某些蛋白質(zhì)的合成有作用，也可能在蛋白質(zhì)或者其他物質(zhì)生物合成中作為輔助因子；同時(shí)，預(yù)測(cè)出該蛋白作為酶類起作用的的概率是2.772，具體可能是連接核酸中斷裂的磷酸二酯鍵的連接酶，概率是3.007。

a為Cn3D結(jié)構(gòu)圖；b為PDB Viewer結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖；c為Swiss-Model建模Ramachandran圖a.Structure observed inCn3D; b. Structure observed inPDB Viewer; c.Ramachandran map of 3c6o.1.B in Swiss-Model圖5 ScF-box蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Predicted three-dimensional structure of ScF-box

功能分類Functionalcategory概率Odds氨基酸生物合成Aminoacidbiosynthesis12.863生物合成的輔助因子Biosynthesisofcofactors4.943中央中介代謝Centralintermediarymetabolism6.754能量代謝Energymetabolism3.977嘌呤和嘧啶Purinesandpyrimidines2.303脂肪酸代謝Fattyacidmetabolism2.508翻譯Translation3.140酶Enzyme2.772連接酶Ligase3.007

a為TargetP 預(yù)測(cè) b為K-NN預(yù)測(cè)法預(yù)測(cè)a: Predicted by TargetP; b:Predicted by K-NN圖6 ScF-box的亞細(xì)胞定位Fig.6 Sub-cellular localization prediction of ScF-box

2.2.7 甘蔗ScF-box蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) TargetP 1.1Server預(yù)測(cè)結(jié)果表明ScF-box有少量葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，線粒體靶向肽，幾乎沒(méi)有分泌途徑中的信號(hào)肽(圖6a)。K-NN算法預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞質(zhì)所占比例最高為60.9 %，其次是線粒體為21.7 %，細(xì)胞外(包括細(xì)胞壁)，高爾基體，細(xì)胞骨架，以及細(xì)胞核所占比例均為4.3 %(圖6b)。表明ScF-box可能定位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.2.8 甘蔗ScF-box蛋白信號(hào)位點(diǎn)分析 磷酸化位點(diǎn)分析表明該蛋白總共存在22個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括12個(gè)絲氨酸，4個(gè)蘇氨酸和6個(gè)酪氨酸(圖7)。

圖7 ScF-box磷酸化位點(diǎn)分析Fig.7 ScF-box phosphorylation site analyses

NES信號(hào)分析可知ScF-box蛋白存在4個(gè)潛在的NES信號(hào)(圖8)，分別出現(xiàn)在第82、84、317、319這幾個(gè)氨基酸殘基的位置(表4)?？梢越閷?dǎo)細(xì)胞核內(nèi)的蛋白輸出到細(xì)胞質(zhì)中，使輸出蛋白在細(xì)胞質(zhì)中起作用或者被特異降解。NLS信號(hào)分析得出在其第485個(gè)氨基酸開(kāi)始存在一段”YESASKKCRYM”NLS信號(hào)，score值為4.5?？芍摰鞍卓赡苁且粋€(gè)協(xié)同運(yùn)輸?shù)鞍?，可以將其他的蛋白在?xì)胞核內(nèi)運(yùn)進(jìn)運(yùn)出。因此可以推測(cè)該蛋白能與某些蛋白特異結(jié)合而運(yùn)出細(xì)胞核，最終運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)進(jìn)而運(yùn)到其他部位起作用或者就在細(xì)胞質(zhì)中被降解。

圖8 ScF-boxNES信號(hào)分析Fig.8 ScF-boxNES signals analyses

序列-位置-殘基Serial-location-residueNES預(yù)測(cè)結(jié)果PredictresultsScF-box-82-L0.687YESScF-box-84-L0.825YESScF-box-317-L0.582YESScF-box-319-L0.580YES

2.2.9 甘蔗ScF-box蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析 InterPro預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ScF-box包含1個(gè)F-Box domain(4～44 aa)保守結(jié)構(gòu)域，以及3個(gè)富含亮氨酸重復(fù)域，含半胱氨酸的亞型(240～271 aa，365～390 aa，391～ 416 aa)(圖9a)。還包含一些InterPro未整合署名的結(jié)構(gòu)，分別是GENE3D (6～45 aa，137～434 aa)、PANTHER(F-Box/LEUCINE RICH REPEAT PROTEIN，SF241：PROTEIN GADR-6-RELATED，9～700 aa)、RNI-like超家族(175～436 aa)(圖9b)。

2.2.10 甘蔗ScF-box蛋白的氨基酸同源性分析 通過(guò)BlastP,選取與ScF-box同源的單子葉植物：高粱，玉米，小米，水稻，短穗二柄草，粳稻(OryzasativajaponicaGroup)，短花野生稻,Oryzabrachyantha)秈稻(Oryzasativaindica)。雙子葉植物：油棕(Elaeisguineensis)，海棗(Phoenixdactylifera)，中國(guó)蓮(Nelumbonucifera)，梅(Prunusmume)，菊花(Chrysanthemumxmorifolium)，芝麻(Sesamumindicum)，馬鈴薯(Solanumtuberosum)和番茄(Solanumlycopersicum)的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖10顯示ScF-box在單子葉和雙子葉植物中大致保守， ScF-box與高粱等單子葉植物進(jìn)化關(guān)系較近，而與油棕，番茄等雙子葉植物進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

3 討 論

甘蔗作為一種重要的糖料和能源作物，在世界食糖產(chǎn)業(yè)和能源產(chǎn)業(yè)中具有十分重要的地位。高產(chǎn)是甘蔗品種選育的重要目標(biāo)，品種改良是一個(gè)重要的發(fā)展方向。分蘗是影響甘蔗品種最終產(chǎn)量形成的一個(gè)重要因素，利用生物技術(shù)挖掘其相關(guān)基因，對(duì)于后續(xù)利用分蘗性狀改良品種具有重要意義[21]。

a為InterPro已整合結(jié)構(gòu)域；b為InterPro未整合結(jié)構(gòu)域a: Intergrated in InterPro; b: Unintergrated in InterPro圖9 ScF-box的保守結(jié)構(gòu)域Fig.9 Conservative domains of ScF-box

圖10 ScF-box同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.10 Phylogenetic tree analysis of ScF-box

目前水稻是禾本科植物中分蘗性狀相關(guān)基因發(fā)掘研究進(jìn)行的較好的作物。研究表明獨(dú)腳金內(nèi)酯是調(diào)控植物分枝(蘗)一類重要的植物激素[6,22]，在獨(dú)腳金內(nèi)酯調(diào)控水稻分蘗信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，從水稻多蘗矮化突變體d3中克隆得到D3基因，其編碼的D3蛋白能夠與SCF泛素復(fù)合體和D14-SLs復(fù)合體結(jié)合，從而抑制水稻分蘗[15,23]。D3作為該信號(hào)途徑中重要的組分，具有特異識(shí)別底物的功能[15]。

本研究通過(guò)RT-PCR和RACE技術(shù)從甘蔗中克隆出D3的同源基因，命名為ScF-box，該基因具2103 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼700個(gè)氨基酸，包含1個(gè)F-box結(jié)構(gòu)域和3個(gè)富含亮氨酸重復(fù)域。生物信息學(xué)分析表明甘蔗ScF-box在單子葉植物和雙子葉植物中整體保守，與玉米、高粱等單子葉植物進(jìn)化關(guān)系較近，符合進(jìn)化規(guī)律。亞細(xì)胞定位分析表明該基因蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，與水稻OsMAX2定位于細(xì)胞核不同[24]，這種定位的差異可能是二者存在不同的定位信號(hào)所致。另外蛋白分析表明該蛋白屬親水性，非分泌蛋白，在氨基酸生物合成和中央中介代謝調(diào)節(jié)中具重要作用。

蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)分析表明該基因蛋白有22個(gè)磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)NES信號(hào)和1個(gè)NLS信號(hào)，磷酸化位點(diǎn)可將ATP和GTP上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物蛋白，NES 和NLS信號(hào)位點(diǎn)，可將底物蛋白通過(guò)核孔運(yùn)進(jìn)運(yùn)出。蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可知該蛋白有像鉆頭一樣的尖頭結(jié)構(gòu)，推測(cè)這個(gè)尖頭結(jié)構(gòu)可能是由4個(gè)NES信號(hào)位點(diǎn)附近富含亮氨酸的重復(fù)序列組成的，能夠特異識(shí)別與其相互作用的底物。萬(wàn)建民等研究表明D3識(shí)別底物的特異性正是源于其C端的特殊結(jié)構(gòu)[15]，通過(guò)以上生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析以及前人研究結(jié)果，推測(cè)ScF-box有相同的功能，在甘蔗獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)著中，起到特異識(shí)別底物的作用。

4 結(jié) 論

克隆獲得1個(gè)cDNA全長(zhǎng)為2642 bp，ORF框?yàn)?103 bp，可編碼700個(gè)氨基酸的ScF-box基因，該基因?yàn)椴环€(wěn)定的水溶性非分泌蛋白，不存在信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，具有1個(gè)F-box結(jié)構(gòu)，與高粱、玉米同源基因具有較近的進(jìn)化關(guān)系。

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CloningandBioinformaticsAnalysisofFull-LengthcDNASequenceofScF-boxGeneinSugarcane

LV Ai-li1，2, LIU Hong-bo1, LI Xu-juan1, WU Cai-wen1, LIU Xin-long1*, ZENG Qian-chun2*

( 1.Institute of Sugarcane/Key Labortory of genetic Improvement of Sugarcane, YAAS, Yunnan Kaiyuan 651699, China；Institute of Agriculture and Biotechnology , Yunnan Agricultural University, Yunnan Kunming 650201, China; 2. Institute of Agriculture and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Yunnan Kunming 650201, China)

【Objective】As a novel hormone, strigolactones can repress plant tillering effectively. In its signal transduction pathways,MAX2/RMS4/D3 plays a crucial role in transferring signal. The present paper aims to know the function characteristic of MAX2 homolog of sugarcane in tillering trait regulation.【Method】The cDNA of this gene namedScF-boxwas cloned from sugarcane variety by using RT-PCR and RACE technology. Then the structure and function ofScF-boxwere analyzed using bioinformatics technology. 【Result】The sequence analysis showed thatScF-boxhad a length of 2642 bp containing the open reading frame (ORF, 113-2215 bp), which encoded 700 amino acid residues. The characters predicted based on the bioinformatics analysis revealed that ScF-box was an unstable soluble, non-secreted protein, which mainly played role in amino acid biosynthesis and central intermediary metabolism. And its protein was located in cytoplasmic, and had no signal peptide but contained 22 phosphorylation sites with 4 NES and 1 NLS. The secondary structure of ScF-box protein mainly encoded α-helix and random coil. With a conserved F-box which could specifically recognizes the interaction substrate. 【Conclusion】The results mentioned above presumed that ScF-box might be as the composition of specific recognition in the strigolactones signal transduction pathways in regulating sugarcane tillering. Phylogenetic analysis showed that it had a closer evolutionary relationship with monocotyledon such as sorghum and maize.

Strigolactones; Sugarcane;ScF-box; Cloning; Bioinformatics analysis

1001-4829(2017)5-0981-08

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.001

2015-06-09

國(guó)家自然科學(xué)基金(31360359，31660421)；云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才(2014HB038)

呂愛(ài)麗(1990-)，女，在讀碩士研究生，專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué),E-mail: lvaili525@163.com,*為通訊作者：曾千春，E-mail: zengqianchun@qq.com,劉新龍， E-mail: lxlgood868@163.com。

S566.1

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(責(zé)任編輯 王家銀)