鳳尾草乙醇提取物體外抑菌試驗(yàn)方法的篩選

南蘋瑤 ， 王小鶯 ， 黃欣彥

(1江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 江西 南昌 330045 ； 2江西省寧都縣畜牧獸醫(yī)局 ， 江西 寧都 342800)

鳳尾草乙醇提取物體外抑菌試驗(yàn)方法的篩選

南蘋瑤1， 王小鶯1， 黃欣彥2

(1江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 江西 南昌 330045 ； 2江西省寧都縣畜牧獸醫(yī)局 ， 江西 寧都 342800)

為了篩選鳳尾草乙醇提取物體外抑菌試驗(yàn)最佳方法，通過打洞法、牛津杯法、干、濕紙片法、二倍稀釋法測定乙醇以及中藥鳳尾草乙醇提取物對大腸桿菌的體外抗菌效果。結(jié)果二倍稀釋法中乙醇的最低抑菌濃度為6.25%；無水乙醇在打洞法、牛津杯法、紙片法、二倍稀釋法中均無抑菌圈；鳳尾草乙醇提取物在打洞法、牛津杯法、濕紙片法中抑菌圈直徑分別為20±1 mm、14±1 mm、13±2 mm；鳳尾草乙醇提取物在干紙片法中無抑菌圈。 表明無水乙醇可作中藥提取物的溶劑用于打洞法、牛津杯法、濕紙片法；打洞法用于鳳尾草乙醇提取物的體外抑菌試驗(yàn)重復(fù)性好，抑菌圈質(zhì)量高。

鳳尾草 ； 乙醇 ； 瓊脂打洞法 ； 紙片法 ； 牛津杯法

體外抑菌研究方法廣泛應(yīng)用于藥物篩選、活性物質(zhì)追蹤、抗菌譜效價(jià)測定及臨床上藥敏試驗(yàn)等工作中，是直接評價(jià)藥物抗菌效能的經(jīng)典試驗(yàn)方法[1]。大量試驗(yàn)表明，許多的中藥都會使用有機(jī)溶劑提取其活性成分，且以水為溶劑的提取物劣于有機(jī)溶劑提取物的效果。鳳尾草乙醇提取物在水中溶解度低[2]，選擇乙醇作為溶劑進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，需考察溶劑乙醇是否對體外抑菌試驗(yàn)產(chǎn)生影響。本文通過比較試管二倍稀釋法、紙片法、打洞法、牛津杯法幾種常用方法，探討鳳尾草乙醇提取物體外抑菌試驗(yàn)的最佳方法，為鳳尾草有效成分的后續(xù)研究提供方法，也為中藥的體外抑菌試驗(yàn)提供參考。

鳳尾草是鳳尾蕨科鳳尾蕨屬中的一種，又稱雞尾草，鐵腳雞，井欄邊草等。一般在四月采挖帶根全草，洗凈曬干。具有涼血止血，清腫解毒，清熱利濕，抗菌消炎等功效?？梢灾委熈〖?，腸炎，黃疸型肝炎，胃腸炎，乳腺炎，扁桃體炎，便血，吐血，白帶，濕疹等疾病，外治出血，燒、燙傷等。具有廣譜抗菌，抗腫瘤，抗病毒的作用[3]。

1 試驗(yàn)材料

1.1 材料與方法 藥材： 鳳尾草全草采于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)(經(jīng)江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院教授鑒定)，清洗干凈，置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱60 ℃干燥備用。

菌種： 大腸埃希菌ATCC25922，購自廣東省微生物菌種保藏中心。

儀器與設(shè)備： 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE5298A,上海亞榮生化儀器廠)；循環(huán)水式真空泵(SHZ-DⅢ鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);粉碎機(jī)(DFT-100，溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；雙人單面凈化工作臺(SW-CJ-2D,蘇州凈化設(shè)備有限公司)；生化培養(yǎng)箱(韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司)；電子天平(ESJ220-4G,沈陽龍騰電子有限公司)；恒溫培養(yǎng)搖床(SKY-1102C,上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司)；超聲波清洗機(jī)(SB-5200DTDN,寧波新芝生物科技股份有限公司)；自動雙重純水蒸餾器(SZ-93，上海亞榮生化儀器廠)；立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KBS,上海申安醫(yī)療器械廠)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4，國華電器有限公司)；移液槍。

1.2 方法

1.2.1 鳳尾草乙醇提取物的制備 采集于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)的鳳尾草全草，去雜清洗干凈，放置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱60 ℃干燥備用。用刀或剪刀將鳳尾草破碎成1～4 cm的碎片，粉碎成粉末。稱取鳳尾草粉末10 g，70%乙醇溶液，1∶30的料液比下，浸泡30 min后，在50 ℃溫度加熱回流提取3次，每次30 min，合并3次提取液。去濾渣后，50 ℃～60 ℃ 下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀物，得到的膏狀物為0.36 g。用7 mL無水乙醇在超聲波下溶解，配成生藥質(zhì)量濃度為1 429 mg/L，過濾除菌，置冰箱4 ℃冷藏保存。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基：取麥康凱瓊脂粉末12.5 g，加入裝有250 mL蒸餾水的錐形瓶中，加熱煮沸溶解并攪拌，121 ℃高溫滅菌20 min后備用。未冷卻凝固時(shí)分別倒入12個(gè)滅菌干燥的培養(yǎng)皿中，等待瓊脂冷卻凝固。冷卻后4 ℃冷藏備用。

普通營養(yǎng)瓊脂：取營養(yǎng)瓊脂粉8 g，加入裝有250 mL蒸餾水的錐形瓶中加熱煮沸溶解并攪拌，121 ℃高溫滅菌20 min后備用。未冷卻凝固時(shí)分別倒入12個(gè)滅菌干燥的培養(yǎng)皿中，等待瓊脂冷卻凝固。冷卻后4 ℃冷藏備用。

MH肉湯培養(yǎng)液：MH肉湯粉末7.5 g，加入裝有250 mL蒸餾水的錐形瓶中加熱煮沸溶解并攪拌，121 ℃高溫滅菌20 min后備用。冷卻后4 ℃冷藏備用。

1.2.3 菌液的制備 取冷凍保存的塑料凍存管，立即放置在38 ℃～40 ℃水浴中快速復(fù)蘇并適當(dāng)搖動。直到內(nèi)部結(jié)冰完全溶解為止，一般約50 s～100 s，開啟塑料凍存管，吸取菌液移植于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。挑取該麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落接種至另一麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行菌種復(fù)蘇。采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，勾取平板上菌落1～2個(gè)，置于MH肉湯中，37 ℃ 恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。菌液4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，臨用前稀釋為106CFU/mL。

1.2.4 濾紙片的制備 將定性濾紙用打孔器制成6 mm直徑的圓片，放入干燥的培養(yǎng)皿內(nèi)，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后，干燥保存?zhèn)溆肹4]。

1.2.5 體外抑菌試驗(yàn)

1.2.5.1 溶劑乙醇對大腸桿菌的抑制作用 試管二倍稀釋法：按劉佩沂等的試管稀釋法，取7支滅菌試管，每1管中均加入1 mL稀釋好的菌液，第1管中加入1 mL無水乙醇溶液，混合均勻后，從第1管移1 mL至第2管，做二倍稀釋后面依次重復(fù)稀釋直到第7管，第7管多余的1 mL棄去，再取1支試管加入1 mL稀釋好的菌液作為空白對照，做3組重復(fù)后，37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)18～24 h后，無細(xì)菌生長的最小藥物濃度即為乙醇的 MIC值[5]。

瓊脂打洞法：拿滅菌棉簽將稀釋好的菌液均勻地涂抹在麥康凱瓊脂上，室溫干燥5 min后，用無菌打孔器(直徑6 mm)在麥康凱瓊脂平板上打孔，以無菌針頭挑出孔內(nèi)瓊脂。滴少量的未凝固的瓊脂于孔內(nèi)封底，防止藥液從孔底流走。按梯度100%、90%、80%、70%、60%、50%乙醇溶液依次滴入孔內(nèi)，每個(gè)孔50 μL，每個(gè)梯度重復(fù)3次，放置 30 min 后，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察抑菌圈大小，求平均值。

牛津杯法：用滅菌棉簽將稀釋好的菌液均勻地涂抹在麥康凱瓊脂上，室溫干燥5 min后，在標(biāo)記的位置上分別放牛津杯6個(gè)，按梯度100%、90%、80%、70%、60%、50%乙醇溶液依次滴入牛津杯內(nèi)，每個(gè) 50 μL，每個(gè)梯度重復(fù)3次，放置30 min后，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察抑菌圈大小，求平均值。

紙片法：用滅菌棉簽將稀釋好的菌液均勻地涂抹在麥康凱瓊脂上，室溫干燥5 min后，按梯度100%、90%、80%、70%、60%、50%取滅菌的紙片依次用滅菌鑷子夾起，并分別滴5 μL乙醇溶液后依次沾到瓊脂上，放置30 min后，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18～24 h后觀察抑菌圈大小，求平均值。

1.2.5.2 鳳尾草乙醇提取物的體外抑菌效果 (1)瓊脂打洞法：瓊脂平板涂菌、打洞、封底后，其中3個(gè)孔每個(gè)孔滴加50 μL藥液，無水乙醇作溶劑對照， 靜置40 min后，置37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h后觀察抑菌圈大小，計(jì)算平均值;(2)牛津杯法：瓊脂平板涂菌、放置牛津杯后，選3個(gè)杯每個(gè)滴50 μL藥液，其余3個(gè)杯每個(gè)滴50 μL無水乙醇作溶劑對照，靜置45 min后，置37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h后觀察抑菌圈大小，計(jì)算平均值;(3)干紙片法：取滅菌的濾紙片放入滅菌離心管中，每片紙片滴5 μL藥液，置干燥箱干燥備用。用滅菌棉簽均勻的涂抹稀釋好的菌液于麥康凱瓊脂平板上，室溫干燥5 min后，將干燥好的藥物紙片依次放到瓊脂上，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察抑菌圈大小，求平均值;(4)濕紙片法：瓊脂平板涂菌，取3片滅菌的紙片依次用滅菌鑷子夾起，分別滴5 μL藥液滲透紙片，依次放在標(biāo)記的位置，另取無菌干燥的空白濾紙片滴5 μL無水乙醇作溶劑對照放置于瓊脂上，靜置40 min后，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察抑菌圈大小，求平均值。

2 結(jié)果

2.1 溶劑乙醇對大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn) 試管二倍稀釋法中溶劑乙醇對大腸桿菌的MIC值為6.25%。瓊脂打洞法、牛津杯法、紙片法測定100%、90%、80%、70%、60%、50% 6個(gè)梯度的乙醇溶液對大腸桿菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果均無抑菌圈。因此在研究中藥提取物的體外抑菌試驗(yàn)時(shí)，用無水乙醇溶解提取物在瓊脂打洞法、牛津杯法、紙片法試驗(yàn)中不會對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

由于在試管法中乙醇對大腸桿菌的抑菌濃度較低，如果用無水乙醇溶解鳳尾草提取物，則使用試管二倍稀釋法測定鳳尾草體外抑菌活性時(shí)，乙醇的濃度會對大腸桿菌產(chǎn)生抑菌作用，必須注意乙醇的濃度。

2.2 鳳尾草乙醇提取物對大腸桿菌的體外抑菌效果 干紙片法中鳳尾草提取物對大腸桿菌幾乎無抑菌圈，表明鳳尾草乙醇提取物水溶性差，很難在瓊脂中擴(kuò)散；濕紙片法、牛津杯法所得平均抑菌圈直徑分別為13 mm、14 mm；濕紙片法所用藥液量為牛津杯法的十分之一，但濕紙片法重復(fù)性不好。瓊脂打洞法平均抑菌圈直徑達(dá)到20 mm，抑菌圈質(zhì)量高、重復(fù)性好，操作簡單、方便快捷, 可優(yōu)先選用為鳳尾草乙醇提取物的體外抑菌試驗(yàn)方法。結(jié)果見表1。

表1 鳳尾草無水乙醇提取物體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

注：抑菌圈直徑包括孔徑、牛津杯直徑和濾紙片直徑

圖1 擴(kuò)散法體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

注：A:瓊脂打洞法; B:牛津杯法; C:濕紙片法； ①、②、③均為鳳尾草提取物，④、⑤、⑥均為無水乙醇

3 討論

3.1 各種體外抑菌試驗(yàn)方法具有一定的適應(yīng)性 試管二倍稀釋法作為定量測定法，結(jié)果較為準(zhǔn)確、但操作繁瑣，具有局限性。對于用乙醇、二甲基亞砜等有機(jī)溶劑溶解中藥提取物用于試管二倍稀釋法測定MIC時(shí)，應(yīng)考慮溶劑對細(xì)菌的作用；本次試驗(yàn)中乙醇對大腸桿菌的MIC值為6.25%。如用乙醇溶解鳳尾草提取物，則在試管二倍稀釋法中第一支試管的乙醇濃度高達(dá)50%，建議試管二倍稀釋法測定MIC時(shí)，一定要考慮溶劑對細(xì)菌的抗菌活性。

牛津杯法測定鳳尾草抑菌作用，具有直觀、重復(fù)性好、載藥量多等優(yōu)點(diǎn)，但結(jié)果擴(kuò)散效果一般，且操作需要非常小心，否則容易致牛津杯法在瓊脂表面滑落，藥物在菌群中滲透不均勻，所得抑菌圈不規(guī)則；瓊脂打洞法要求熟練掌握打洞技術(shù)，封底用的瓊脂要趁熱防止凝固，藥液需加夠量防止抑菌圈不明顯。在本試驗(yàn)中瓊脂打洞法與牛津杯法中所用等量的鳳尾草乙醇提取物50 μL，打洞法的抑菌圈大于牛津杯法；濕紙片法載藥量較少、精確度不高。因此，瓊脂打洞法可用于鳳尾草體外抑菌試驗(yàn)的研究。

3.2 影響各種體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果判定的因素多 影響結(jié)果判定的因素有很多，如藥物的濃度、用量、藥物對細(xì)菌的培養(yǎng)時(shí)間、敏感程度、培養(yǎng)溫度、菌液濃度，或瓊脂上水分多少；紙片法中紙片的大小、保存時(shí)間、干燥程度、紙片質(zhì)量、載藥量都會影響結(jié)果；打洞法時(shí)瓊脂的厚薄均勻程度、封底是否做好；稀釋法是否混合均勻程度，牛津杯的選擇等[6]。

3.3 現(xiàn)用中藥體外抑菌試驗(yàn)方法存在不足 中藥鳳尾草純天然、毒副作用小、功能諸多、療效好、不容易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，但鳳尾草成分復(fù)雜，使用歷史悠久，提取條件、助溶劑的選擇、分離方法的選擇都會影響結(jié)果。對于有些中藥，其煎液在高壓121 ℃蒸汽滅菌時(shí)，會導(dǎo)致中藥某些藥理活性降低，中藥的部分有效成分被破壞[7]，有效成分被破壞使體內(nèi)外抑菌試驗(yàn)結(jié)果有大不同。因此，開始中藥的抑菌研究時(shí)，應(yīng)對中藥的劑型、提取條件、方法、有效組分分離等作充分考慮，且提高操作水平，設(shè)置對照組和重復(fù)組，以保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和真實(shí)性。

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S853.74

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0529-6005(2017)09-0062-03

2017-04-01

江西省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(20161BBF60088)

南蘋瑤(1995-)，女，碩士生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)藥理學(xué)及毒理學(xué)，E-mail:2280425155@qq.com

王小鶯，E-mail:wangxiaoying6969@126.com