中藥復(fù)方對小鼠免疫功能的影響

曹禮靜 ， 袁麗花 ， 廖開燕

(1.重慶市榮昌區(qū)職業(yè)教育中心 ， 重慶 榮昌 402460 ； 2.重慶市榮昌初級中學，重慶 榮昌 402460)

中藥復(fù)方對小鼠免疫功能的影響

曹禮靜1， 袁麗花1， 廖開燕2

(1.重慶市榮昌區(qū)職業(yè)教育中心 ， 重慶 榮昌 402460 ； 2.重慶市榮昌初級中學，重慶 榮昌 402460)

為了篩選能夠提高免疫抑制小鼠免疫水平的中藥復(fù)方。本試驗采用環(huán)磷酰胺人工建立小鼠免疫低下模型。將造模成功的小鼠隨機分為中藥復(fù)方高、中、低劑量組(40 g/kg體重、20 g/kg體重、10 g/kg體重)，模型組，陽性藥物組，設(shè)置空白對照組。檢測各組小鼠免疫器官指數(shù)、血清溶血素水平、腹腔巨噬細胞吞噬功能、血清中免疫球蛋白IgG、IgM含量。結(jié)果顯示：與模型組比較，復(fù)方中、低劑量組小鼠體重增長數(shù)較高，脾臟指數(shù)顯著性升高(P<0.05)；復(fù)方高、中、低劑量組小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬率、吞噬指數(shù)均顯著性升高(P<0.05)；復(fù)方中劑量組小鼠血清溶血素含量、血清中IgG、IgM含量極顯著性升高(P<0.01)。結(jié)果表明，中藥復(fù)方中劑量組能有效拮抗環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用，提高免疫抑制小鼠的免疫功能。

小鼠 ； 免疫力 ； 中藥復(fù)方

機體的免疫水平直接影響著動物的抗病力與生產(chǎn)力。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，如何通過增強動物的抵抗力從而降低其發(fā)病率，提高生產(chǎn)效益的問題己受到畜牧行業(yè)專家與養(yǎng)殖生產(chǎn)者越來越多的關(guān)注。前人研究發(fā)現(xiàn)，許多中藥中的糖類、有機酸類、生物堿類、苷類和揮發(fā)油類等，均有增強免疫的作用[1]。大多數(shù)滋補強壯類和部分祛邪類中藥也能提高機體免疫水平，對非特異性免疫、特異性免疫均有促進作用，部分補益類中藥如枸杞，還具有免疫增強或抑制的雙向調(diào)節(jié)作用[2]。中藥毒副作用小、使用安全、不易產(chǎn)生耐藥性、無有害殘留，既可殺菌又能增強動物機體的免疫力等優(yōu)點，在規(guī)?；B(yǎng)殖中受到越來越多的重視，因此研究具有增強機體免疫功能的中藥復(fù)方具有廣泛的應(yīng)用前景。

本試驗選用黃芪、當歸、白術(shù)、甘草、大棗、苦參、金銀花、魚腥草等組成中藥復(fù)方來改善免疫抑制小鼠的免疫功能，以探討該中藥復(fù)方對免疫抑制小鼠免疫功能的調(diào)控作用及機制。

1 材料與方法

1.1 中藥及試劑 黃芪、當歸、白術(shù)、甘草、大棗、苦參、金銀花、魚腥草；Mouse IgG ELISA kit，Mouse IgM ELISA kit試劑盒。

1.2 藥液的制備 按要求稱取藥材，粉碎并過12目篩，加入藥材總重量6.5倍量的水浸泡1.0 h，每次煎煮1.0 h，共煎煮3次，過濾并收集濾液，95 ℃～100 ℃下蒸發(fā)濃縮濾液至濃度為1.0 g/mL，即得所需藥液。

1.3 試驗動物 體重18～22 g昆明系小鼠90只，雌雄各半，購自西南大學榮昌校區(qū)動物科。

1.4 試驗方法

1.4.1 小鼠免疫抑制模型的建立[3-4]用無菌水配制濃度為10 mg/mL環(huán)磷酰胺溶液(CY)，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?0 只健康小鼠，雌雄各半，腹腔注射CY(每次100 mg/kg體重)，1次/d，連用3 d，構(gòu)建小鼠免疫抑制模型。另取20只小鼠為健康對照，腹腔注射生理鹽水(0.2 mL/10 g體重)。與正常組小鼠比較，若造模組小鼠出現(xiàn)嚴重脫毛、精神不振、食欲明顯下降等現(xiàn)象，隨機取其中幾只小鼠進行解剖檢查，若發(fā)現(xiàn)脾臟萎縮，肝臟發(fā)白，胸腺受損等，則表明免疫低下小鼠模型建立成功。

1.4.2 試驗分組與處理[5]將建模成功且體重在18～22 g之間的小鼠隨機分為陽性藥物組(黃芪多糖，30 mg/kg體重)、中藥復(fù)方高、中、低劑量組(分別按40 g/kg體重、20 g/kg體重、10 g/kg體重給藥)，模型組(生理鹽水，0.2 mL/10 g體重)；注射生理鹽水的小鼠設(shè)為空白對照組(生理鹽水，0.2 mL/10 g體重)，每組10只，連續(xù)灌胃給藥7 d，每天1次。同時每天定時觀察并記錄小鼠的精神狀況、飲食、死亡等臨床表現(xiàn)，并于試驗前后記錄小鼠體重、死亡數(shù)等。

1.4.3 免疫器官指數(shù)測定 各組小鼠分別于試驗結(jié)束后稱取體重及脾臟、胸腺重量，臟器重量比上體重分別計算各組每只小鼠脾臟及胸腺指數(shù)。

1.4.4 血清溶血素的測定 參照文獻[6]的方法，在給藥第3天時，各組取5只小鼠腹腔注射5% 雞紅細胞懸液0.2 mL，連續(xù)5 d，末次給藥24 h后，稱取各組小鼠重量后摘眼球采血，3 500 r/min分離血清，4 ℃冷藏備用。取部分血清加生理鹽水稀釋100倍，取1 mL稀釋好的血清與0.5 mL 5%雞紅細胞懸液和0.5 mL 10%豚鼠補體混勻，同時設(shè)置空白對照管。將上述樣品放置于37 ℃恒溫箱中孵育0.5 h后于4 ℃冰箱終止反應(yīng)，最后2 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL放置10 min后，以對照管作為空白調(diào)零，于540 nm處測樣品A值。

稀釋倍數(shù)

1.4.5 腹腔巨噬細胞吞噬功能的測定[7]每組剩余的5只小鼠于給藥7 d 后稱重，在腹腔注射0.5 mL 5%雞紅細胞后8 h處死，腹腔注入2 mL PBS(緩沖液)，輕揉腹部1 min，用注射器抽取0.5 mL腹腔液滴體于載玻片上，37 ℃ 孵育30 min，用甲醇固定5 min后進行Giemsa染色，每張涂片計數(shù)200個巨噬細胞，按以下公式計算各組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率及吞噬指數(shù)。

1.4.6 中藥復(fù)方對免疫抑制小鼠血清中IgG、IgM含量的影響 取1.4.4中分離所得血清用ELISA法測定其中IgG、IgM的含量，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。最后用全自動酶標儀在450 nm波長處測定吸光度(OD值)。

2 試驗結(jié)果

2.1 小鼠免疫抑制模型的建立 與空白組比較觀察發(fā)現(xiàn)：腹腔注射環(huán)磷酰胺組小鼠表現(xiàn)精神不振、被毛逆立、脫毛、食欲下降、體重減輕等現(xiàn)象；隨機抽取其中幾只小鼠進行解剖檢查發(fā)現(xiàn)：小鼠胸腺、脾臟出現(xiàn)萎縮，肝臟發(fā)白等，表明免疫功能低下小鼠模型造模成功。

2.2 臨床表現(xiàn)及死亡率 給藥前，與空白組比較，其他試驗組小鼠均出現(xiàn)精神不振、被毛逆立、脫毛、食欲下降等臨床癥狀。給藥第4天發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中劑量組小鼠較其他給藥組小鼠精神好轉(zhuǎn)，活動量增加，被毛光滑，無掉毛，食欲開始恢復(fù)等現(xiàn)象。與給藥組比較，模型組小鼠精神較沉郁，聚堆，被毛逆立，掉毛現(xiàn)象嚴重，食欲減退。據(jù)圖1可知：空白組、陽性藥物組、復(fù)方高、中劑量組小鼠死亡率均低于模型組小鼠死亡率；據(jù)圖2可知：試驗期間，各試驗組小鼠體重均增加，與模型組比較，復(fù)方中、低劑量組體重增長數(shù)較高。

2.3 免疫器官指數(shù)測定 由表1可知，各試驗組小鼠胸腺指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)，無統(tǒng)計學意義；模型組小鼠脾臟指數(shù)為2.49，與空白組比較有顯著性差異(P<0.05)；與模型組比較，復(fù)方中、低劑量組小鼠脾臟指數(shù)分別為2.90、5.55， 呈顯著性升高(P<0.05)。

圖1 各試驗組小鼠死亡率

圖2 各試驗組小鼠體重變化

表1 中藥復(fù)方對免疫功能低下小鼠胸腺及脾臟指數(shù)的影響

注：同一列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) ；同一列數(shù)據(jù)肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01),下表同

2.4 血清溶血素的測定 由表2可知，與模型組相比復(fù)方中劑量組小鼠血清溶血素含量極顯著性升高(P<0.01)，與空白組比較沒有顯著性差異(P>0.05)。

表2 中藥復(fù)方對免疫功能低下小鼠血清溶血素的影響

2.5 腹腔巨噬細胞吞噬功能的測定 由表3可知，模型組小鼠吞噬率、吞噬指數(shù)分別為15.67、0.19，與空白組比較具有顯著性差異(P<0.05)；與模型組比較，復(fù)方高、中、低劑量組小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬率、吞噬指數(shù)均顯著升高(P<0.05)。

表3 中藥復(fù)方對免疫功能低下小鼠腹腔巨噬細胞吞噬指數(shù)的影響

2.6 小鼠血清免疫球蛋白IgM、IgG含量的測定 圖3、圖5為小鼠血清IgM、IgG含量測定的標準曲線圖，通過標準曲線可計算各組小鼠血清免疫球蛋白的含量。由圖4可知：與空白組比較，模型組小鼠血清IgM含量極顯著性降低(P<0.000 1)；與模型組比較，復(fù)方高、低劑量組血清中IgM含量升高，有極顯著性差異(P<0.01)，復(fù)方中劑量組血清中IgM含量升高，有極顯著性差異(P<0.000 1)。由圖6可知：與空白組比較，模型組小鼠血清IgG含量極顯著性降低(P<0.000 1)；與模型組比較，復(fù)方中劑量組血清中IgG含量升高，有極顯著性差異(P<0.000 1)。

3 分析與討論

大部分中藥具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用，可使動物的免疫水平恢復(fù)正常，其體現(xiàn)了中獸醫(yī)理論的“整體觀念”與“ 陰陽平衡”理論，機體的免疫功能就是機體的抗病防病能力，屬于中獸醫(yī)學“正氣”的范疇。機體正氣旺盛時，防病抗病能力增強，即“正氣存內(nèi)、邪不可干”；機體正氣低下時，防病抗病能力日益下降，邪氣攻其不備，即“邪之所湊，其氣必虛”[8]。本試驗所用中藥復(fù)方由黃芪、當歸、白術(shù)、甘草、大棗、苦參、金銀花、魚腥草等組成，據(jù)現(xiàn)代藥理學研究表明，黃芪多糖、苦參堿、白術(shù)多糖、當歸多糖對機體的特異性及非特異性免疫功能均有一定的調(diào)節(jié)作用，所以諸藥合用可調(diào)節(jié)機體的免疫力。

在免疫調(diào)節(jié)藥物的研究中，環(huán)磷酰胺對多種癌細胞均有殺傷作用，但對細胞的選擇性不高，在殺傷腫瘤細胞的同時也殺傷機體正常細胞，最終導(dǎo)致動物機體免疫能力的下降[8]。所以本文采用環(huán)磷酰胺來制備小鼠免疫功能低下模型。根據(jù)文獻[6、9-10]進行預(yù)試驗，發(fā)現(xiàn)當注射量為100 mg/kg體重，注射2次后，小鼠出現(xiàn)精神不振、被毛逆立、脫毛、食欲下降、體重下降等癥狀，隨機抽取其中小鼠進行解剖檢查發(fā)現(xiàn)：小鼠胸腺、脾臟萎縮，肝臟發(fā)白等，證明造模成功。免疫器官是免疫細胞產(chǎn)生、發(fā)育、成熟及機體發(fā)揮免疫作用的主要場所，其生長發(fā)育情況直接影響到機體的免疫功能，在一定程度上其指數(shù)的大小可清楚地反映機體的非特異性免疫能力[11]，所以常采用測定小鼠免疫臟器指數(shù)來評價免疫力的強弱。本試驗中復(fù)方中、低劑量組小鼠脾臟指數(shù)和模型組比較顯著性升高(P<0.05)，而胸腺指數(shù)沒有顯著性變化。說明試驗所選中藥復(fù)方提取液對免疫抑制小鼠脾臟指數(shù)有明顯的提升作用，提示該中藥復(fù)方可能對被破壞的脾臟細胞與組織有修復(fù)作用，從而提高機體的免疫功能。

圖3 小鼠血清IgM含量測定標準曲線

圖4 小鼠血清IgM含量測定

圖5 小鼠血清IgG含量測定標準曲線

圖6 小鼠血清IgG含量測定

(注：與空白對照組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.000 1；與模型組比較，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.0001)

巨噬細胞是動物機體主要的免疫細胞之一，本試驗利用小鼠腹腔巨噬細胞吞噬和消化雞紅細胞數(shù)量的試驗觀察到，復(fù)方高、中、低劑量組小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)較模型組均顯著性升高，說明試驗所選中藥復(fù)方可通過增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力來加強小鼠的非特異性免疫的功能，可能是復(fù)方中的當歸發(fā)揮了相應(yīng)的作用。

血清溶血素的測定可以計算出血清中的抗體含量，OD值越大，抗體含量越高，說明機體的體液免疫功能越強[12]。本試驗中采用雞紅細胞腹腔注射小鼠，試驗結(jié)果表明，中藥復(fù)方中劑量組小鼠血清溶血素含量極顯著性高于模型組，與文獻報道一致，說明所篩選的中藥復(fù)方當以中劑量灌胃試驗小鼠時可促進小鼠機體溶血素抗體的生成，從而提高小鼠體液免疫功能。

免疫細胞產(chǎn)生的免疫球蛋白是免疫細胞相互作用的重要信號及物質(zhì)基礎(chǔ)，在機體免疫過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。本試驗中與模型組比較，復(fù)方中劑量組血清中IgG、IgM含量均極顯著升高，說明該中藥復(fù)方可通過增加血清中IgG、IgM含量來提高機體的免疫水平。

綜上所述，試驗中藥復(fù)方當以20 g/kg體重灌胃小鼠時可通過增加小鼠脾臟指數(shù)，增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力、機體血清溶血素水平和提高血清中免疫球蛋白含量來增強小鼠的免疫力。

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EffectofChineseherbalmedicinecompoundontheimmunefuctionofmice

CAO Li-jing1， YUAN Li-hua1， LIAO Kai-yan2

(1.Rongchang Vocational Education Center of Chongqing，Rongchang ，Chongqing 402460，China 2.Rongchang junior school of Chongqing，Rongchang，Chongqing 402460，China)

In order to screen out the traditional Chinese medicine compounds which can improve the immunity level of immunosuppressive mice, models were established artificially with cyclophosphamide. After the mouse models were established, mice with similar weight were randomly divided into five groups, including Chinese medicine compound high dose，medium dose and low dose(the immunosuppressive mice were treated with 40g/kg, 20g/kg and 10g/kg traditional Chinese medicine compound,repectively)， immunodepression model group, positive group，and blank control group. In this study, the indexes of thymus and spleen, peritoneal macrophage phagocytic function, serum hemolysin content and serum levels of IgG，and IgM in mice were analyzed. The results showed that when compared with model group, the body weight of mice was higher, the spleen index significantly increased(P<0.05) in the compound low and high dose groups.The peritoneal macrophage phagocytic rate and phagocytic index were significantly higher (P<0.05) of compound high, medium and low dose groups; the levels of serum hemolysin content and serum IgG，and IgM were significantly increased (P<0.01) of Chinese medicine compound medium dose group. It is concluded that the middle dose group of Chinese medicine could effectively inhibit the immunosuppressive effect of cyclophosphamide and improve the immune function of immunosuppressed mice.

Mice ； Immunity ； Chinese herbal medicine compound

S853.72

A

0529-6005(2017)09-0058-04

2017-02-17

曹禮靜(1972-)，男，中專研究員，碩士，主要從事中職畜牧獸醫(yī)教學研究及教育管理研究，E-maiL：caoLij888@126.com