雞源乳酸菌細菌素的分離篩選及鑒定

黃奕雯, 劉悅欣, 陶 政, 張學良 , 王 萍

(1.江西農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院 ， 江西 南昌 330045 ; 2.南昌市農(nóng)村綜合產(chǎn)權交易中心 ， 江西 南昌 330038)

雞源乳酸菌細菌素的分離篩選及鑒定

黃奕雯1, 劉悅欣1, 陶 政1, 張學良2, 王 萍1

(1.江西農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院 ， 江西 南昌 330045 ; 2.南昌市農(nóng)村綜合產(chǎn)權交易中心 ， 江西 南昌 330038)

為了分離鑒定產(chǎn)乳酸菌細菌素，采用雙層瓊脂擴散法，對從健康雞腸道內(nèi)容物分離到的68株乳酸菌進行篩選，獲得對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門菌均有抑制作用的17株乳酸菌，在排除酸、過氧化氫等因素作用后仍具有較強抑菌活性，表明發(fā)酵液中還有其他抑菌活性物質(zhì)的存在，用蛋白酶處理上清液后有6株菌的抑菌效果消失，表明抑菌物質(zhì)具有蛋白質(zhì)性質(zhì)，是一種細菌素類物質(zhì)。篩選出的菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)是一種廣譜細菌素，它們對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均具有較強抑制效果。結(jié)合形態(tài)鑒定、生理生化特性試驗以及16S rRNA 序列同源性分析鑒定菌株 LABJN02、LABJN05、LABJN06和LABJN14 分離菌為唾液乳桿菌，LABJN16 為約氏乳桿菌，LABJN31為卷曲乳桿菌。細菌素作為潛在的抑菌物質(zhì)，與其產(chǎn)生菌一起在平衡腸道菌群中具有重要意義。

乳酸菌 ； 細菌素 ； 16S rRNA ； 鑒定

抗生素的使用在全世界的養(yǎng)殖業(yè)都是較為普遍的，在動物疾病防治、提高飼料利用率、促進畜禽生長等方面發(fā)揮了重要作用。但隨著抗生素的濫用，特別是在飼料中添加亞治療劑量的抗生素，導致動物細菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性，并通過食物鏈將耐藥性轉(zhuǎn)移給人類。人們迫切需要探尋一種能改變這種現(xiàn)狀的途徑，于是細菌素便成為近年來研究的熱點。

細菌素是由某些細菌在代謝過程中通過核糖體合成的一類具有抑(殺)菌作用的蛋白質(zhì)、多肽或前體多肽[1]。乳酸菌作為動物腸道的優(yōu)勢菌群，具有耐膽鹽、耐酸及耐高溫等微生物學特征[2]，乳酸菌細菌素是乳酸菌在代謝過程中通過核糖體機制合成并分泌到環(huán)境中的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白類物質(zhì)，具有高效、無抗藥性、無毒、無殘留、耐酸、耐高溫、大部分基因位于質(zhì)粒上、相對分子質(zhì)量小、含修飾氨基酸、結(jié)構(gòu)復雜等特點。能抑制或殺死食物中多數(shù)革蘭陽性致病菌和腐敗菌，少數(shù)乳酸菌素對革蘭陰性菌也有抑菌效果。乳酸菌細菌素以其良好的抑菌性和來自于被FDA認定的食品級安全微生物(GRAS)而受到越來越多的關注[3-5]。在過去幾年中細菌素激發(fā)了人們的研究熱情，然而雞源乳酸菌細菌素的研究仍較少，更未見替代抗生素作為飼料添加劑的報道。

本試驗從江西優(yōu)良地方品種寧都三黃雞的胃腸道分離篩選對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門菌、納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌均具有抑菌活性的細菌素產(chǎn)生菌，采用微生物學和分子生物學方法綜合鑒定分離菌株，以期獲得可應用動物生產(chǎn)和活菌生物制劑的優(yōu)良菌種，為產(chǎn)細菌素菌株在飼料添加劑中的應用提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 乳酸菌從健康雞胃腸道中分離篩選；指示菌：致病性大腸埃希菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、雞白痢沙門菌(Salmonellapullorum)、納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，及雞巴氏桿菌(Pasteurellagallinarum)均由本實驗自保菌種。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 乳酸菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基。乳酸菌分離篩選用培養(yǎng)基：MRS 固體培養(yǎng)基(加0.5%碳酸鈣)。芽孢桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等指示菌選用培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基；胰蛋白酶、蛋白酶K為 Sigama 公司產(chǎn)品；rTaqDNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker、瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒，均為寶生物工程(大連) 有限公司的產(chǎn)品。其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化 無菌采取健康雞的腸黏膜及內(nèi)容物，稱取1 g樣品于5 mL滅菌生理鹽水中混懸，以10倍系列稀釋，分別取不同稀釋度于平皿中，以 MRS(含0.5%碳酸鈣)培養(yǎng)基倒平板，37 ℃培養(yǎng) 48 h。挑取具有溶鈣圈，形狀不同的單個菌落進行革蘭染色，選取革蘭陽性菌，分別接種于 MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃ 培養(yǎng)，將篩選得到的乳酸菌編號后于 MRS 固體培養(yǎng)基上畫線純化，用50%甘油保存，并分別保存于4 ℃ 和-20 ℃冰箱中備用。

1.3.2 抑菌試驗 采用雙層瓊脂平板擴散法檢測待檢菌發(fā)酵上清液中是否含有抑菌物質(zhì)。即在滅菌平皿內(nèi)倒入 10 mL 2% 滅菌水瓊脂，待瓊脂冷卻凝固后放入滅菌的牛津杯，將 100 μL 含菌約 106CFU/mL 的指示菌懸液加入到 20 mL 50 ℃ 的指示菌軟瓊脂培養(yǎng)基中，混勻后傾注滅菌的平皿內(nèi)，待培養(yǎng)基凝固后，用無菌鑷子取出牛津杯，在孔中加200 μL無細胞上清液，室溫擴散 3～5 h ，37 ℃ 培養(yǎng)24 h，設3個重復，以未接菌的 MRS 液體培養(yǎng)基作對照，測量抑菌圈直徑。

1.3.3 乳酸菌產(chǎn)細菌素的確定 乳酸菌在生長過程中產(chǎn)生的許多物質(zhì)均具有抑菌能力，如有機酸、過氧化氫等，因此在細菌素產(chǎn)生菌的篩選中要排除這些干擾因素。選擇大腸埃希菌為指示菌。

任何革命者、創(chuàng)業(yè)者，沒有信仰，肯定走不遠。贛東北蘇區(qū)的斗爭是在敵我力量對比極為懸殊，處在白色政權嚴密包圍之下進行的。是何等力量支撐著根據(jù)地軍民在嚴酷的環(huán)境下同敵人血戰(zhàn)到底呢？那就是共產(chǎn)主義的理想和革命必勝的信念！革命斗爭的歷史表明，沒有堅定的共產(chǎn)主義理想和赤誠的愛國之心，就不會有“方志敏式”革命道路的開辟。

1.3.3.1 排除有機酸的干擾 將純化后的菌株在液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，采用NaOH中和法排除細菌發(fā)酵產(chǎn)物中酸性物質(zhì)，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)細菌發(fā)酵上清液至pH值至6.0，以未調(diào)節(jié)pH值發(fā)酵原液及pH值為6.0的乳酸、鹽酸和醋酸作為對照，進行指示菌抑菌試驗，37 ℃培養(yǎng)24 h測量抑菌圈直徑。

1.3.3.2 過氧化氫檢測與排除 取2 mL 排除酸作用后仍有抑菌效果的菌株發(fā)酵液。采用H2O2酶法進行H2O2檢測。同時將H2O2酶處理前后的發(fā)酵上清液進行抑菌試驗，比較抑菌活性。

1.3.3.3 蛋白酶處理 將胰蛋白酶和蛋白酶K分別溶解于 pH值=6 和 pH值=7磷酸鹽緩沖液中，加入已經(jīng)調(diào)好相應 pH值的發(fā)酵上清液中，使酶的終濃度為 1 mg/L，37 ℃溫浴4 h，然后再將處理后的發(fā)酵液上清 pH值調(diào)至 6～7，做相應處理但未加酶的進行對照。進行抑菌試驗，測定抑菌圈的大小。

1.3.4 抑菌譜的測定 將活化好的各指示菌活菌數(shù)調(diào)整為106CFU/mL，檢測抑菌物質(zhì)對各指示菌的抑制作用，根據(jù)抑菌圈的大小確定產(chǎn)抑菌物質(zhì)菌株的抑菌譜。

1.3.5 產(chǎn)細菌素菌株的鑒定

1.3.5.1 菌體形態(tài)及生理生化試驗 MRS固體平板上觀察菌落形態(tài)；革蘭染色后顯微鏡下觀察菌體形態(tài)；做各項生理生化試驗，包括：H2O2酶、明膠液化試驗、硝酸鹽還原試驗、精氨酸產(chǎn)氨試驗、H2S試驗以及接種各類糖醇發(fā)酵試驗等。

1.3.5.2 乳酸菌16S rDNA基因序列測定和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 引物參照文獻的通用引物序列，由上海華大生物科技有限公司合成。預期擴增片段大小為1 500 bp。引物序列如下：27F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′,1492R:5′-TACGGYTACCTTGTT ACGACTT- 3′。依照細菌基因組 DNA提取試劑盒提取 DNA模板，PCR 反應體系(25 μL)：模板DNA 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 μL， dNTPs(25 mmol/mL)1μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，加去離子水至25 μL。反應程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，共33個循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min。用去離子水作為陰性對照。取5 μL PCR 擴增產(chǎn)物于1% 瓊脂糖凝膠中進行電泳，于凝膠成像系統(tǒng)觀察和記錄結(jié)果。用DNA膠回收試劑盒收取鑒定正確的PCR產(chǎn)物。

將純化回收的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。利用 NCBI 工作站的 Blast 程序，將所測序列與 GenBank 中核酸序列數(shù)據(jù)庫進行比對分析，并基于相關屬菌 株的16S rDNA 序列，利用軟件MEGA 6 軟件繪制系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與討論

2.1.1 有機酸和過氧化氫的排除 將培養(yǎng)過夜后的乳酸菌上清液，用1 mol/L NaOH將上清液pH值調(diào)整到6.0左右，以大腸桿菌為指示菌，有6株菌的上清液仍具有抑菌活性，而且作為對照的pH值為6.0的乳酸、鹽酸和醋酸均無抑菌活性，說明發(fā)酵上清液的抑菌效果不是由有機酸引起的。在用過氧化有機酸的排除氫酶處理發(fā)酵上清液后，以大腸桿菌為指示菌，抑菌效果也未見明顯變化(表1)，由此排除過氧化氫的影響。發(fā)酵上清液中存在其他的抑菌活性物質(zhì)。

2.1.2 蛋白酶對發(fā)酵上清液的敏感性 將培養(yǎng)過夜后的乳酸菌上清液，經(jīng)過胰蛋白酶、蛋白酶K處理以后，以大腸桿菌為指示菌，發(fā)酵上清液的抑菌活性消失(表1)，因此可初步確定發(fā)酵上清液中的抑菌活性物質(zhì)是蛋白質(zhì)類物質(zhì)，為細菌素。

表1 發(fā)酵上清液的抑菌活性變化

2.2 乳酸菌所產(chǎn)細菌素抑菌譜的測定 分別選取 8 株具有代表性的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌為指示菌，進行抑菌試驗。 6株乳酸菌產(chǎn)生的細菌素對 8 株菌都有不同程度的抑制作用，能抑制革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌、納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌)，又對革蘭陰性菌(致病性大腸埃希菌、雞白痢沙門菌、嗜水氣單胞菌、雞巴氏桿菌)有抑制作用，表明這6株乳酸菌所產(chǎn)細菌素是 1 類具有廣譜抑菌活性的細菌素，結(jié)果見表2。

表2 乳酸菌素的抑菌譜

2.3 產(chǎn)細菌素乳酸菌的鑒定

2.3.1 菌株形態(tài)學特征 菌株LABJN02、LABJN05、LABJN06和LABJN14在MRS培養(yǎng)基上菌落表現(xiàn)為白色圓形不透明表面光滑，鏡檢為革蘭陽性菌，菌體呈短桿狀，二端呈圓形，通常單獨出現(xiàn)，成對短鏈狀。

菌株LABJN16在MRS培養(yǎng)基上菌落凸起，表面光滑，邊緣整齊，乳白色不透明，鏡檢為革蘭陽性菌，無芽孢，菌體呈長桿狀，但有時幾乎是球狀，通常成短鏈狀。

菌株LABJN31在MRS培養(yǎng)基上菌落白色，邊緣不整齊，片狀，中央凸起，鏡檢為革蘭陽性菌，無芽孢，菌體細長桿，微彎成鏈出現(xiàn)，無鞭毛。

2.3.2 生理生化試驗 結(jié)果見表3。

表3 乳酸菌的生理生化特性

2.3.3 16S rRNA基因序列分子生物學鑒定 以篩選到的6株產(chǎn)細菌素的乳酸菌基因組 DNA 為模板，進行 16S rRNA 基因序列的 PCR擴增，得到的約 1 500 bp 產(chǎn)物，將純化回收的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。將測序后得到的序列進行 BLAST 比對，通過比對發(fā)現(xiàn)LABJN02、LABJN05、LABJN06和LABJN14與Lactobacillus salivarius有超過99%的同源性，LABJN16與Lactobacillus johnsonii有超過99%的同源性，LABJN31與Lactobacillus crispatus 有超過99%的同源性。選取相似度達 99%的部分序列和其他乳酸菌16S rDNA 序列，經(jīng)多重序列對比，用軟件 MAGE 6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，結(jié)合生理生化試驗。結(jié)果，可以鑒定篩選的LABJN02、LABJN05、LABJN06和LABJN14為唾液乳桿菌，LABJN16為約氏乳桿菌，LABJN31為卷曲乳桿菌。

3 討論

乳酸菌種類繁多，分布廣泛，長期用于干酪、酸奶的生產(chǎn)，其產(chǎn)生的乳酸菌素已被廣泛 用于食品的保鮮防腐等方面，細菌素在動物生產(chǎn)中應用前景也是非常廣闊的[6]。產(chǎn)細菌素的乳酸菌種屬主要有乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、腸球菌屬、片球菌屬等。

本研究從健康雞腸道內(nèi)容物中篩選出68株乳酸菌，篩選出具有一定抑菌能力的乳酸菌，乳酸菌的抑菌作用由多種因素構(gòu)成，包括甲酸、乙酸等有機酸、過氧化氫和細菌素等物質(zhì) 。 篩選產(chǎn)細菌素乳酸菌，一般采用有機酸和過氧化氫排除抑菌試驗后，發(fā)酵液仍具有抑菌活性， 可以初步確定菌株產(chǎn)生細菌素。本試驗排除發(fā)酵上清液中有機酸、過氧化氫的影響后篩選得到6株具有較強抑菌活性的乳酸菌；結(jié)合蛋白酶酶解等試驗，證實分離到的6株乳酸菌能產(chǎn)生細菌素。通過蛋白酶敏感性試驗確定該菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)為具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的細菌素，根據(jù)16S rDNA序列的測定，結(jié)合生理生化試驗和形態(tài)學觀察，確定乳酸菌LABJN02、LABJN05、LABJN06和LABJN14為唾液乳桿菌，LABJN16為約氏乳桿菌，LABJN31為卷曲乳桿菌。目前，對所篩選出的6株乳酸菌產(chǎn)細菌素的報道很少。

目前，細菌素大多僅僅抑制同種的或親緣關系較近的細菌，Stevens theorized 理論認為，革蘭陰性菌存在外膜，細菌素很難到達細胞膜上的作用位點[7]，即一般細菌素不對革蘭陰性菌有抑制作用，而本試驗篩選的乳酸菌產(chǎn)生的細菌素，不僅可以抑制革蘭陽性菌，如金黃色葡萄球菌、納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，而且還對革蘭陰性菌有抑制作用，如致病性大腸埃希菌、雞白痢沙門菌、嗜水氣單胞菌、雞巴氏桿菌，所產(chǎn)細菌素的抑菌譜較廣，并且對動物體安全無毒，能夠被消化系統(tǒng)的蛋白酶分解成各種氨基酸而被動物體吸收，所以它作為一種天然、高效、安全的飼料添加劑，有著廣闊的應用前景。

圖1 乳酸菌的 16S rRNA 基因序列系統(tǒng)進化樹

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IsolationandIdentificationofBacteriocinProducingLactobacillusfromChicken

HUANG Yi-wen1， LIU Yue-xin1， TAO Zheng1， ZHANG Xue-liang2, WANG Ping1

(1.College of Animal Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 2.Nanchang Rural Comprehensive Property Rights Exchange Center , Nanchang 330038 , China)

To characterize lactic acid bacteria produced by bacteriocin, we isolated 68 strainsLactobacillusfrom the digestive tracts of healthy chicken.A double-layer agar plate proliferation experiment was used screen 17 strains which had antibacterial activity to Salmonella- lmonellapullorum Staphylococcu saureus andEscherichiacoli. After eliminating the interference factors such as the organic acids,hydrogen peroxides,6 strains still had the inhibitory activity. But inhibitory activity was lost after treatment with trypsin and proteinase K.Therefore the inhibitory substance was classed as bacteriocin. In addition，the bacteriocin had a broad inhibitory spectrum and showed inhibitory activity against gram-positive bacterium and gram-nagetive bacterium.Through detection of its appearance，physiological and biochemical character-istics and 16 SrRNA gene sequence homology analysis,LABJN02,LABJN05,LABJN06 and LABJN14 were identified as Lactobacillus salivarius,LABJN16 as Lactobacillus johnsonii,and LABJN31 as Lactobacillus crispatus.The bacteriocins are potential antimicrobial agents, and in conj unction with their producers，they might contribute a positive effect on the balance of intestinal microflora.

Lactobacillus ; Bacteriocin ; 16S rRNA

WANG Ping

S852.61

A

0529-6005(2017)09-0023-05

2016-11-02

江西省科技廳基金項目(20142BBF 60004)

黃奕雯(1992-)，女，碩士生，研究方向為動物免疫學基礎理論與運用,E-mail: Hywsuny. yun@qq.com

王萍,E-mail: jxjs6263wplm@163.com