喉癌、喉良性病變及聲帶息肉組織HPV-DNA及P16蛋白的表達(dá)差異

李 強(qiáng)，秦雪梅，葉宣光，顧立新，朱小平

復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，上海 201508

·短篇論著·

喉癌、喉良性病變及聲帶息肉組織HPV-DNA及P16蛋白的表達(dá)差異

李 強(qiáng)，秦雪梅，葉宣光，顧立新，朱小平*

復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，上海 201508

目的檢測喉癌、喉良性病變組織及聲帶息肉組織中HPV-DNA及P16蛋白的表達(dá)水平，探討HPV感染與喉癌發(fā)生的相關(guān)性。方法收集2011年5月至2015年7月就診于復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科的256例患者，其中喉鱗狀細(xì)胞癌34例、喉良性病變(非聲帶息肉)15例、聲帶息肉207例，男性184例、女性72例，中位年齡56歲。采用實時熒光PCR法檢測喉鱗狀細(xì)胞癌組織和喉良性病變組織HPV-DNA水平。采用免疫組化法觀察喉癌組織、喉良性病變及聲帶息肉中P16蛋白的表達(dá)。結(jié)果實時熒光PCR檢測發(fā)現(xiàn)34例喉鱗狀細(xì)胞癌組織中HPV-DNA陽性率為8.8%(3/34)，喉良性病變均為陰性(0/15)，兩組間HPV-DNA陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組化染色顯示喉鱗狀細(xì)胞癌、喉良性病變、聲帶息肉組織P16蛋白陽性表達(dá)率分別為32.4%(11/34)、46.7%(7/15)和47.8%(99/207)，其中聲帶息肉組織P16蛋白陽性率高于喉癌組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.046)。結(jié)論喉癌組織HPV-DNA陽性率略高于喉良性病變；P16蛋白在喉癌組織的表達(dá)略低于喉良性病變，明顯低于聲帶息肉。

喉癌；喉良性病變；聲帶息肉；人乳頭狀瘤病毒(HPV)；實時熒光PCR

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，與人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染存在一定關(guān)系。因此，HPV感染一直是喉癌病因?qū)W研究的熱點[1-2]。HPV亞型多達(dá)51種，其中HPV16E6、E7蛋白可促進(jìn)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系增殖，抑制其分化，使腫瘤細(xì)胞惡性增強(qiáng)，亦可引起蛋白酶體的降解和部分腫瘤抑制基因蛋白泛素化[3-4]。高危亞型HPV16/18被發(fā)現(xiàn)與喉癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但對于喉癌患者HPV16/18感染率的研究結(jié)果仍存在較大爭議[5-6]。頭頸腫瘤中P16蛋白表達(dá)水平與HPV-DNA陽性率有很好的一致性，是臨床上判斷是否感染HPV的重要生物學(xué)標(biāo)志物[7-8]。因此，本研究采用實時熒光PCR檢測人喉鱗癌組織和喉良性病變組織中HPV-DNA及P16的表達(dá)水平，探討它們與喉癌的關(guān)系，為HPV相關(guān)喉癌的預(yù)后研究及進(jìn)一步的基因診療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年5月至2015年7月就診于復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科的256例患者，其中喉癌34例、喉良性病變(非聲帶息肉)15例、聲帶息肉207例，男性184例、女性72例，中位年齡56歲。34例喉癌均經(jīng)病理確診為鱗狀細(xì)胞癌，其中聲門上型14例、聲門型18例、聲門下型2例；病理確診頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例。喉良性病變(非聲帶息肉)患者包括病理證實的囊腫9例，乳頭狀瘤5例，喉不典型增生1例。

1.2 主要試劑及儀器 固定組織基因組DNA提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司(試劑貨號：CW0547，試劑批號：00151507)。人乳頭瘤病毒核酸檢測定量試劑盒購自廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司(試劑批號：2016001)。P16蛋白免疫組化試劑盒為小鼠抗人p16INK4a蛋白單克隆抗體試劑盒(批號：16K70103)，購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實時熒光PCR檢測HPV-DNA水平 參照試劑盒說明書，提取標(biāo)本核酸，進(jìn)行濃度測定。對提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。分別加入提取后的待測樣本核酸5 μL，陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品各5 μL，蓋緊管蓋，瞬時離心后轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增檢測區(qū)。95℃，15 min；1 cycle 94℃，15 s；55℃，45 s；共40 cycles。55℃時采集熒光。反應(yīng)體積50 μL。結(jié)果判讀：根據(jù)Ct值及擴(kuò)增曲線判斷結(jié)果。

1.4 免疫組化染色檢測P16蛋白的表達(dá) 切取石蠟標(biāo)本5～10 μm數(shù)片，70℃烤片2 h后二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5 min；無水乙醇5 min；80%乙醇5 min；蒸餾水中洗3 min；pH值6.0檸檬酸鹽緩沖液置于高壓鍋內(nèi)，電磁爐最高火力2 100 W加熱至沸騰后放入切片，蓋上蓋、加上壓力閥，待開始沖氣時計時并將火力調(diào)整到1 300 W，2 min 30 s后關(guān)閉電源，打開鍋蓋讓其自然冷卻至室溫。切片置蒸餾水中洗 3 min。3%過氧化氫中室溫放置10 min，去除內(nèi)源性過氧化物酶。蒸餾水洗3 min去除3%過氧化氫，PBS洗3 min。逐一將組織周圍水分擦干，逐一滴加相應(yīng)第一抗體，37℃孵育45 min。PBS沖洗，PBS放置3 min，將組織周圍水分擦干滴加適量二抗，37℃孵育30 min。PBS沖洗，PBS放置3 min，將組織周圍水分擦干滴加適量DAB顯色液，顯微鏡下觀察3～10 min至顯色完全。自來水沖洗 1 min，蘇木精染液染1 min，自來水沖洗3 min，1%鹽酸乙醇分化1～3 s，自來水沖洗10 min。85%乙醇5 min。95%乙醇5 min。無水乙醇5 min，2次。二甲苯5 min，3次。中性樹膠封片，貼上標(biāo)簽。采用雙盲法由2位高年資病理科醫(yī)師閱片，以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核棕色染色為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較和相關(guān)性分析采用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 喉癌、喉良性病變組織HPV-DNA的表達(dá) 結(jié)果表明：34例喉鱗癌組織HPV-DNA陽性3例，陽性率8.8%；喉良性病變組織HPV-DNA均為陰性，陽性率為0，兩組間陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.235)。

2.2 喉癌、喉良性病變及聲帶息肉組織P16蛋白的表達(dá) 結(jié)果(圖1)表明：P16蛋白陽性染色位于胞核或胞質(zhì)內(nèi)。34例喉鱗癌組織P16蛋白陽性11例，陽性率32.4%；15例喉良性病變P16蛋白陽性為7例，陽性率46.7%；207例聲帶息肉組織P16蛋白陽性99例，陽性率47.8%。喉癌組織P16蛋白陽性率低于聲帶息肉組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.997,P=0.046)。

圖1 免疫組化染色測定喉組織P16蛋白表達(dá)

3 討 論

HPV感染可能是喉癌發(fā)生的獨立危險因素。HPV的致癌作用是目前喉癌病毒病因?qū)W研究的重要內(nèi)容之一，特別是HPV16和HPV18，被認(rèn)為是與喉癌發(fā)生密切相關(guān)的高危類型，提示高危型HPV感染是喉癌發(fā)病學(xué)中不容忽視的致病因子[9]，但目前關(guān)于喉癌與HPV感染間的關(guān)系仍存在較多爭議，喉癌患者HPV感染率為3%～100%。樣本量、樣本保存方法、檢測手段和檢測HPV的分型是導(dǎo)致檢測結(jié)果差異較大的主要原因，其中檢測方法影響最大[4-9]。PCR是目前檢測HPV基因組最敏感的方法，能從100 000個細(xì)胞中檢測出1個受感染細(xì)胞，因此本研究采用PCR法進(jìn)行檢測。

HPV16和HPV18是最常見的高危類型，而HPV16感染占所有HPV陽性頭頸腫瘤的86%～95%[5]。本研究發(fā)現(xiàn)34例喉癌組織中僅3例(8.8%)患者HPV陽性，與國內(nèi)其他研究[10-11]結(jié)果基本一致。但Xu等[12]回顧分析673例喉癌患者病理資料顯示HPV感染率為4.9%(33/674)，而且3年的總生存率和無病生存率在HPV陽性和陰性組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提出HPV感染不是喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病及預(yù)后的參考因素。本研究僅3例喉癌組織表現(xiàn)HPV-DNA陽性，考慮到病例數(shù)太少且分布不均，因此沒有針對生存結(jié)果進(jìn)行分組隨訪分析。Matsuzaki等[13]回顧性分析144例喉癌、癌前病變、喉乳頭狀瘤和非腫瘤性病變組織中高危和低危的HPV-DNA狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)HPV感染狀態(tài)與喉癌、癌前病變及非腫瘤性疾病無相關(guān)性。Hernandez等[14]報道在非侵襲性喉癌患者中HPV-DNA陽性率21%(31/148)，最多見的亞型為HPV16和HPV22，且女性患者的陽性率略高，為33%(9/27)，校準(zhǔn)年齡和就診時間等因素后發(fā)現(xiàn)女性喉癌患者HPV感染的風(fēng)險更高。

應(yīng)注意的是，并不是所有P16陽性的頭頸腫瘤都為HPV陽性。Hong等[15]對647例口咽癌患者組織中HPV-DNA與P16陽性率進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)以P16 50%作為節(jié)點，有25%的患者HPV-DNA陽性但P16陰性，1%的患者HPV-DNA陰性但P16陽性。因此，目前HPV檢測首選P16免疫組化作為篩選，P16陽性者建議進(jìn)一步行HPV-DNA檢測。P16基因的失活可以由基因缺失、突變或5′端啟動子區(qū)域的高度甲基化引起。免疫組化檢測只能反映P16蛋白表達(dá)情況，不能反映出基因水平的異常，故本組所檢測到的P16蛋白的缺失是由哪一種基因異常所致尚不清楚。本研究結(jié)果顯示喉癌組織P16蛋白陽性率32.4%，低于聲帶息肉組47.8%(P=0.046)，同樣低于喉良性病變組46.7%，提示抑癌基因P16的失活與喉癌的發(fā)生可能有一定的關(guān)系。Young等[16]報道P16在喉癌組織中陽性率僅6.5%(20/307)，且隨訪數(shù)據(jù)表明P16陽性組和P16陰性組之間的2年總生存率和無治療失敗生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示喉癌組織中HPV-DNA的陽性率略高于喉良性病變，喉癌組織P16蛋白表達(dá)略低于喉良性病變，明顯低于聲帶息肉組織，提示HPV感染與喉癌發(fā)生的關(guān)系并不明確，仍有待進(jìn)一步大樣本研究證實。

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Expression of HPV-DNA and P16 protein in laryngeal cancer, benign laryngeal lesions, and vocal cord polyps

LI Qiang, QIN Xue-mei,YE Xuan-guang,GU Li-xin,ZHU Xiao-ping*

Department of ENT, Jinshan Hospital, Fudan University, Shanghai 201508, China

Objective： To detect the expression of HPV-DNA and P16 protein in laryngeal cancer, laryngeal benign lesion tissue, and vocal cord polyp tissue, and to explore the correlation between HPV infection and laryngeal cancer.MethodsThe clinical data of 256 patients who had been treated in Department of Otorhinolaryngology & Head and Neck Surgery of Jinshan Hospital, Fudan University from May 2011 to July 2015 were collected. There were 34 cases of laryngeal squamous cell carcinoma, 15 cases of benign laryngeal lesions (non-vocal cord polyps), 207 cases of vocal cord polyps, 184 males and 72 females, with a median age of 56 years. The levels of HPV-DNA in laryngeal squamous cell carcinoma tissues and benign laryngeal lesions were detected by real-time fluorescence PCR. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of P16 protein in laryngeal cancer tissues, laryngeal benign lesions and vocal cord polyps.ResultsReal time fluorescence PCR detection showed that the HPV-DNA positive rate in 34 cases of laryngeal squamous cell carcinoma was 8.8% (3/34), and it was all negative (0/15) in benign laryngeal lesions. There was no significant difference in the HPV-DNA positive rate between the two groups. Immunohistochemical staining showed that the positive expression rate of P16 protein in laryngeal squamous cell carcinoma, benign laryngeal lesions and vocal cord polyp tissues was 32.4% (11/34), 46.7% (7/15), and 47.8% (99/207). The positive rate of P16 protein in vocal cord polyp tissues was higher than that of laryngeal cancer tissues, and the difference was statistically significant (P=0.046).ConclusionsThe positive rate of HPV-DNA in laryngeal cancer tissues is slightly higher than that in benign laryngeal lesions. The expression of P16 protein in laryngeal cancer tissues is slightly lower than that in benign laryngeal lesions, and is significantly lower than that in vocal cord polyps.

laryngeal cancer; benign laryngeal lesions; vocal cord polyp; human papillomavirus (HPV); real-time fluorescence PCR

2017-06-29接受日期2017-08-02

上海市金山區(qū)科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新基金項目(2014-3-20). Supported by Science and Technology Innovation Fund of Jinshan District of Shanghai(2014-3-20).

李 強(qiáng)，主治醫(yī)師. E-mail: stronglee2000@foxmail.com

*通信作者(Corresponding author).Tel:021-34189990-5342,E-mail: yggan65@hotmail.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170552

R 739.65

A

[本文編輯] 廖曉瑜， 賈澤軍