高壓氧預適應對高原缺氧大鼠血腦屏障的保護作用

周虎傳，吳麗華，郝 磊，鄒 璨，唐曉紅，劉 磊

中國人民解放軍第324醫(yī)院腦血管病中心，重慶 400020

·短篇論著·

高壓氧預適應對高原缺氧大鼠血腦屏障的保護作用

周虎傳，吳麗華，郝 磊，鄒 璨，唐曉紅，劉 磊*

中國人民解放軍第324醫(yī)院腦血管病中心，重慶 400020

目的探討高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)預處理對高原缺氧大鼠血腦屏障(blood brain barrier，BBB)的保護作用。方法SD大鼠隨機分為正常對照組、高原缺氧組、HBO預處理高原缺氧組，經(jīng)尾靜脈注射2%伊文思藍(Evans blue，EB)，采用熒光顯微鏡觀察腦組織EB光斑、紫外分光光度計檢測腦組織EB含量、干濕重法測定腦組織含水量來評定BBB通透性的變化。結(jié)果正常對照組大鼠腦組織紅色光斑數(shù)、EB含量、腦組織含水量低于高原缺氧組和HBO預處理高原缺氧組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；高原缺氧組大鼠腦組織紅色光斑數(shù)、EB含量、腦組織含水量高于HBO預處理高原缺氧組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。結(jié)論HBO預處理能明顯降低高原缺氧所致的大鼠BBB通透性增加，對高原缺氧導致BBB損傷具有保護作用。

高壓氧預處理；血腦屏障；高原缺氧

高原腦水腫是指從低海拔的平原快速進入高海拔的高原時，腦組織急性缺氧引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能嚴重障礙[1]。研究[1-3]證實低氧預適應可降低血腦屏障的通透性，減輕腦梗死體積。但低氧預適應有其局限性，不能應用于臨床。有研究[4]報道，高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)預處理能明顯改善短暫性大腦中動脈堵塞所致大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，減少梗死體積，降低出血轉(zhuǎn)化，用于人類臨床疾病的防治具有廣闊的應用前景。但目前缺乏高壓氧預處理對高原缺氧性血腦屏障損傷影響的相關(guān)研究。因此，本研究采用HBO預處理SD大鼠，然后迅速將HBO預處理后大鼠放入模擬海拔5 000 m高原的低壓缺氧環(huán)境中，通過測定腦組織紅色光斑數(shù)、伊文思藍(Evans blue, EB)含量、腦組織含水量，以明確HBO預處理對高原缺氧性血腦屏障損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試藥 雌性SD大鼠90只(陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院動物室購買)，體質(zhì)量200～250 g，隨機均分為3組：正常對照組、高原缺氧組、HBO預處理高原缺氧組，每組30只。高壓氧艙為煙臺冰輪氧艙廠生產(chǎn)。2%EB購自Gibco公司，進口分裝。

1.2 HBO預處理 將HBO預處理高原缺氧組30只SD大鼠放入動物用高壓氧艙，以5 L/min氧流量洗艙10 min，使艙內(nèi)氧濃度>98%，然后在15 min內(nèi)勻速升壓(氧流量約10 L/min)至2.5 atm(1 atm=101 325 Pa)，穩(wěn)壓吸氧1 h后，20 min勻速降壓至常壓。每天高壓氧處理1次，連續(xù)處理5 d。

1.3 高原缺氧處理 將高原缺氧組和HBO預處理高原缺氧組大鼠放入FLYDWC50-ⅡA型低壓低氧動物實驗艙(中航工業(yè)貴州風雷航空軍械有限責任公司生產(chǎn)，陸軍軍醫(yī)大學高原醫(yī)學系提供)，然后以10 m/s的速度減壓，模擬上升至海拔5 000 m，維持24 h后以20 m/s的速度緩慢降至正常海拔高度。

1.4 制作EB標準曲線 用二甲基甲酰胺配制EB標準溶液，濃度分別為0.75、1.5、2.5、3.25、4.5、6.5 μg/mL，用UV1902PC紫外分光光度計測定各濃度溶液在波長620 nm的光密度(D620)值，將溶液濃度和所得光密度值進行線性回歸處理，得出標準曲線方程。

1.5 腦組織EB含量的測定 將高原缺氧處理后的高原缺氧組、HBO預處理高原缺氧組和未處理的正常對照組每組分出10只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉；然后經(jīng)尾靜脈注射2%EB(0.3 mL/100 g)，1 h后從左心室灌注0.9%氯化鈉溶液，直至清亮液體從右心耳流出。斷頭取腦，去掉硬腦膜、軟腦膜，稱質(zhì)量，搗碎腦組織放入50 mL離心管中，加入10 mL二甲基甲酰胺，放入50℃水浴箱孵育60 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液，應用UV1902PC紫外分光光度計檢測波長620 nm處光密度(D620) 值。

1.6 腦組織含水量的測定 將高原缺氧處理后的高原缺氧組、HBO預處理高原缺氧組和未處理的正常對照組每組分出10只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉；從左心室灌注0.9%氯化鈉溶液，直至清亮液體從右心耳流出。斷頭取腦，用濾紙將腦表面水分吸干，在電子秤稱濕質(zhì)量，然后將腦組織放入110℃電子恒溫烘箱烘烤48 h，然后稱取干質(zhì)量。腦組織含水量通過公式計算：腦組織含水量(%)=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)÷濕質(zhì)量×100%。

1.7 熒光顯微鏡觀察紅色光斑 將3組大鼠每組分出10只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉；然后經(jīng)尾靜脈注射2%EB(0.3 mL/100 g)，1 h后從左心室灌注0.9%氯化鈉溶液，直到清亮液體從右心耳流出。再從左心室灌注4%多聚甲醛150 mL。斷頭取腦，去掉硬腦膜、軟腦膜，將腦組織放入4%多聚甲醛浸泡72 h，再放入30%蔗糖溶液脫水24 h。然后行冰凍切片，片厚10 μm，熒光顯微鏡(Olympus BX51)在CY3激發(fā)狀態(tài)下觀察EB熒光光斑，每張切片選10個高倍鏡視野計算光斑數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 腦組織EB含量的比較 正常對照組、高原缺氧組、HBO預處理高原缺氧組腦組織內(nèi)EB含量分別為(3.40±0.26)、(43.47±4.27)、(28.49±1.13) μg/g。與對照組相比，高原缺氧組和HBO預處理組腦組織EB含量明顯升高(P<0.01)；HBO預處理組腦組織EB含量明顯低于高原缺氧組(P<0.01，圖1)。結(jié)果表明HBO預處理降低了高原缺氧導致的BBB通透性增加。

圖1 各組大鼠腦組織EB含量的比較

2.2 腦組織含水量的比較 正常對照組、高原缺氧組、HBO預處理高原缺氧組腦組織含水量分別為(77.03±0.30)%、(82.11±0.26)%、(79.40±0.32)%。高原缺氧組和HBO預處理高原缺氧組腦組織含水量明顯高于正常對照組(P<0.01)，HBO預處理高原缺氧組腦組織含水量明顯小于高原缺氧組(P<0.01，圖2)。結(jié)果表明HBO預處理能減輕高原缺氧所致腦水腫。

2.3 EB熒光光斑計數(shù)結(jié)果 結(jié)果(圖3)表明：正常對照組除在BBB缺乏的松果體、垂體、后聯(lián)合見到較多紅色熒光光斑，其余腦組織極少見到紅色光斑；高原缺氧組、HBO預處理高原缺氧組雙側(cè)腦組織均可見到較多紅色熒光光斑。3組每10個高倍鏡視野熒光光斑計數(shù)分別為1.00±0.82、70.71±2.87、41.57±2.64。與正常對照組相比，高原缺氧組和HBO預處理高原缺氧組腦組織紅色熒光光斑計數(shù)明顯上升(P<0.01)，HBO預處理高原缺氧組腦組織紅色熒光光斑計數(shù)明顯小于高原缺氧組(P<0.01，圖4)。結(jié)果表明HBO預處理降低了高原缺氧導致BBB通透性的增加。

圖2 各組大鼠腦組織含水量的比較

圖3 熒光顯微鏡觀察腦組織EB分布

圖4 各組大鼠腦組織EB熒光光斑數(shù)的比較

3 討 論

預處理為預先給予機體某種刺激，機體器官系統(tǒng)為維持機體內(nèi)環(huán)境相對恒定而發(fā)生的積極反應，可以使機體對以后的有害因素產(chǎn)生耐受或適應，從而發(fā)揮預防作用[6]。Wada等[7]首次發(fā)現(xiàn)HBO預處理可誘導腦組織產(chǎn)生缺血缺氧耐受。隨后，眾多研究[8-10]均證實反復HBO處理可減輕腦水腫程度，縮小局灶性腦梗死體積，對腦缺血具有明顯的保護作用。Guo等[11]研究發(fā)現(xiàn)，2.5 atm的高壓氧1 h，1次/d，連續(xù)處理5 d，能明顯改善短暫性大腦中動脈堵塞大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，降低BBB的通透性，減少梗死體積，降低出血轉(zhuǎn)化。因此，本研究選擇HBO預處理(2.5 atm，98%O2，每天處理1 h，1次/d，連續(xù)處理5 d)作為高原缺氧的保護性預處理因素。

EB是一種偶氮染料制劑，其相對分子質(zhì)量與血漿清蛋白相近，在血液中與血漿清蛋白有很高的親和力。正常狀態(tài)下血漿清蛋白無法透過BBB，染色時如神經(jīng)系統(tǒng)是完整的，與血漿清蛋白結(jié)合的EB無法使其著色。相反，如BBB被破壞，EB就可進入神經(jīng)系統(tǒng)并使其著色。在熒光波長470 nm與540 nm各有1條強峰，680 nm處有1條弱峰[12]。因此，本研究通過熒光顯微鏡觀察EB在腦組織中的紅色熒光光斑，通過比色法測定EB在腦組織中的含量，以反映BBB通透性的強弱。

本研究觀察HBO預處理對模擬海拔5 000 m高原缺氧時BBB的保護作用，發(fā)現(xiàn)其可以降低高原缺氧時大鼠BBB的通透性，減輕腦水腫。但HBO預處理對高原缺氧BBB保護作用的分子機制尚不清楚[13]。有研究[14]認為，ROS可通過上調(diào)抗氧化酶、介導ATP敏感性鉀通道，(KATP)開放、激活蛋白激酶C(PKC)、誘導一氧化氮合酶(NOS)和熱休克蛋白(HSP)生成而產(chǎn)生保護作用。有研究報道高壓氧預處理后過氧化氫酶(catalase, CAT)活性明顯增加，說明高壓氧預處理后CAT活性增強可能是高壓氧預處理誘導缺血缺氧耐受的另一因素[15]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)高壓氧預處理可降低高原缺氧大鼠腦水腫及血腦屏障的通過性，提高其對高原缺氧的耐受性，具有廣泛的臨床應用前景，但具體分子機制有待進一步研究。

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Protection of hyperbaric oxygen preconditioning on blood-brain barrier of plateau hypoxia in rats

ZHOU Hu-chuan, WU Li-hua, HAO Lei, ZOU Can, TANG Xiao-hong, LIU Lei*

Cerebrovascular Center of No.324 Hospital of PLA, Chongqing 400020, China

Objective： To explore the protection of hyperbaric oxygen (HBO) preconditioning on blood-brain barrier of plateau hypoxia in Rats.MethodsSD rats were randomly divided into three groups including normal control group (group A), high altitude hypoxia group (group B) and HBO preconditioning treatment of high altitude hypoxia group (group C), by tail vein injection of 2% Evans blue (EB), and by fluorescence microscopy to observe brain EB spot, we evaluated the changes of BBB permeability by detecting the contents of EB and water in brain tissue through UV spectrophotometer and dry wet weight method, respectively.ResultsThe number of red spots, EB content and brain water content of brain tissues in group A were significantly lower than those in group B and group C (P<0.001). The number of red spots, EB content and brain water content in group B were significantly higher than those in group C (P<0.001).ConclusionsHBO pretreatment can significantly reduce the increase of BBB permeability caused by high altitude hypoxia, and has obvious protective effect on the damage of BBB caused by high altitude hypoxia.

hyperbaric oxygen preconditioning; blood brain barrier; high altitude hypoxia

2016-10-15接受日期2017-08-13

重慶市自然科學基金(CSTC 2014jcyjA 10077)，成都軍區(qū)應用基礎(chǔ)研究面上項目(C12024). Supported by Chongqing Natural Science Foundation (CSTC 2014jcyjA 10077) and Application Basic Research Project of Chengdu Military Area (C12024).

周虎傳，碩士，主治醫(yī)師. E-mail: zhcsjnk120@163.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 023-68762056,E-mail: shenjingneike324@126.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20160955

R -332

A

[本文編輯] 廖曉瑜， 賈澤軍