蘆筍提取液對α—葡萄糖苷酶抑制作用的研究

趙琳琪+黃嬛+劉紫薇+汪淑貞

摘 要：目的 研究蘆筍提取液對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，探索總多酚類化合物在治療糖尿病方面的價值。方法 以蘆筍為原料，將粉碎、提取及大孔吸附樹脂處理得到的蘆筍提取液用Folin- 酚法進(jìn)行總多酚含量測定及 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定。 結(jié)果 蘆筍提取液對α-葡萄糖苷酶有抑制作用，半數(shù)抑制量（ IC50 ）為mg /mL。 結(jié)論 蘆筍提取液對α-葡萄糖苷酶有一定抑制作用。

關(guān)鍵詞：蘆筍 α-葡萄糖苷酶 總多酚 糖尿病

Study on the Inhibitory Effect ofAsparagus Extract on α - Glucosidase

Abstract： Objective To study the inhibitory effect of asparagus extract on α-glucosidase and to explore the value of total polyphenols in the treatment of diabetes mellitus. Methods Asparagus was used as raw material， the extraction of polyphenols and the determination of α-glucosidase inhibitory activity were determined by Folin-phenol method， which was obtained by pulverization， extraction and macroporous adsorption resin. Results The asparagus extract had inhibitory effect on α-glucosidase， and the half inhibitory dose （IC50） was mg / mL. Conclusion Asparagus extract has a certain inhibitory effect on α-glucosidase.

Keywords： Asparagus； α-glucosidase； Total polyphenols； Diabetes mellitus

中圖分類號：R151 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1003-9082（2017）09-0-02

蘆筍，學(xué)名石刁柏，是百合科天門冬屬多年生宿根性草本植物，原產(chǎn)于地中海沿岸和小亞細(xì)亞一帶，現(xiàn)在全國各地均有栽培?！吨腥A本草》記載，蘆筍含有皂苷類、黃酮類及各種氨基酸[3]。蘆筍中含有豐富的各類營養(yǎng)和功能成分而越來越受人們的歡迎。目前，蘆筍的生物學(xué)功能的研究受到廣泛關(guān)注，因含有豐富的黃酮和多酚化合物而具有很強的抗氧化活性，在抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖血脂[4-7]等方面也有相關(guān)研究報道。

α-葡萄糖苷酶抑制劑是一類新型的口服降血糖藥物，可有效抑制小腸體內(nèi)的 α-葡萄糖苷酶活性，使攝取寡糖、多糖等消化后變成葡萄糖、果糖等單糖的過程受到阻礙，從而降低血糖水平[5-7]，但是，目前用于臨床的 α-葡萄糖苷酶抑制劑（阿卡波糖等）都存在一定的副作用[5]，因此，更安全和有效的天然 α-葡萄糖苷酶抑制劑有待人們進(jìn)一步探索研究開發(fā)。

據(jù)報道，服用新鮮蘆筍能夠降低患者血糖[6]，而抑制小腸α一葡萄糖苷酶活性是藥物降血糖機理之一。本實驗以蘆筍嫩莖為原料，采用正交試驗優(yōu)化多酚提取的工藝條件[8]，研究蘆筍提取液中多酚對α一葡萄糖苷酶活性的影響從而探尋其對α-葡萄糖苷酶抑制作用，初步探究蘆筍提取液中的多酚對降血糖的作用功效。

一、材料和方法

1.材料與儀器

蘆筍粉 蘆筍（購自蔬菜批發(fā)市場）洗凈，烘干，磨成粉后過60目篩。

對硝基苯酚（PNP，山東西亞化學(xué)有限公司），對硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG，上海金穗生物科技有限公司），沒食子酸對照品（上海金穗生物科技有），α-葡萄糖苷酶（源葉生物），福林酚，（上海金穗生物科技有限公司），阿卡波糖片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司·中國北京，國藥準(zhǔn)字H19990205，批號BJ31754），其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

電熱恒溫水浴鍋 上海百典儀器設(shè)備有限公司；紫外分光光度計 濟南海能儀器股份有限公司；電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；全波長酶標(biāo)儀 Thermo Fisher；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph

2.實驗方法

2.1樣品制備

蘆筍細(xì)粉（過60目篩）與50%乙醇在料液比1：15， 80℃水浴條件下提取60min[4]。

醇沉法按樣品、乙醇體積比1：10加入乙醇，靜置24小時，離心后，過濾取濾液。濾液過AB-8色譜柱。

2.2總多酚含量測定

稱取 3.75 gNa2CO3， 溶于25 mL 溫水， 混勻， 冷卻， 定容至50mL ，得7.5%Na2CO3溶液。稱取 0.110 g沒食子酸對照品， 用蒸餾水溶解、定容至 100 mL ， 得溶液質(zhì)量濃度為 1 000 mg/L得母液 。分別吸取此溶液 0.0、1.0、2.0、3.0 、 4.0 、 5.0 mL 至 100 mL 容量瓶中， 用蒸餾水定容， 所得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別為0.0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 。

吸取0.5ml不同濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加2.5ml福林酚顯色劑，反應(yīng)5min，再加2.0ml7.5% Na2CO3溶液，搖勻，顯色，在765nm波長下測定OD值，得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=11.886x+0.0055（R2=0.9997），其中y為吸光度，x為濃度。endprint

測定樣品中總多酚含量，按上訴方法測定樣品OD值，根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中的多酚含量[8]。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

2.3.1PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取0.0695g對硝基苯酚（PNP），用0.01mol/L磷酸緩沖液（pH為6.8）溶解并定容至25mL，即得20mmol/L母液。用蒸餾水將母液稀釋成濃度分別為1、5、10、20、40、80和100μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1.0mL上述標(biāo)準(zhǔn)液，各加入1.5mL 7.5%的Na2CO3溶液，混勻 1 min ，在405 nm處測定其吸光度[7]，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.1146x-0.0232（R2 =0.9995），其中y 為吸光度，x為濃度。

2.3.2蘆筍提取液對α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

探索最佳反應(yīng)體系，條件優(yōu)化后為：加入7 U·mL -1 的α-葡萄糖苷酶200μL，樣品溶液100μL， 37 ℃恒溫10 min，加入2.5 mmol·L -1 的PNPG 200μL， 37 ℃恒溫反應(yīng)20min，再加入800μL 0.2 mol·L -1 的Na 2 CO 3 溶液，于405nm波長下測OD值。實驗共設(shè)3個組，分別為：A1（酶+樣品），A2（PBS+樣品），A3（酶+PBS），每組做三組平行。計算其抑制率及IC50值[9-11]。

3.酶促動力學(xué)分析

在其他反應(yīng)條件不變，改變底物濃度，分別為2.5mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L，加或不加蘆筍提取液的條件下測定酶促反應(yīng)速度 ，以1/V為縱坐標(biāo)，1/[S]為橫坐標(biāo)作圖 ，得到Lineweaver‐Burk曲線。

二、結(jié)果與討論

1.結(jié)果

1.1蘆筍提取液中多酚含量

經(jīng)處理后得到的蘆筍提取液用Folin- 酚法測得其中多酚的含量為3.46mg/g。

1.2 蘆筍提取液對 α‐葡萄糖苷酶的抑制效果

在試驗濃度（0.025～0.116mg/mL）范圍內(nèi) ，蘆筍提取液對α-葡萄糖苷酶有明顯的抑制作用，且兩者呈一定的量效關(guān)系，即隨著提取液中多酚含量的升高抑制效果也隨之變大。蘆筍提取液對α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度為0.042mg/mL。（圖1）

1.4石榴花多酚對 α-葡萄糖苷酶抑制作用的動力學(xué)分析

α-葡萄糖苷酶的濃度不變 ，在添加或不添加蘆筍提取液（0.061mg/mL）條件下 ，改變底物PNPG 的濃度（2.5～10mmol/L），測定不同PNPG 濃度下反應(yīng)體系的反應(yīng)速率，得到 α-葡萄糖苷酶在有無蘆筍提取液存在時的 Lineweaver‐Burk 曲線 。 和未添加蘆筍提取液時相比 ，當(dāng)蘆筍提取液存在時 ，α-葡萄糖苷酶酶催化的酶促反應(yīng)的 Km變大 ，但 Vmax 基本不變 ，因此推測蘆筍提取液對α-葡萄糖苷酶為競爭性抑制作用類型[12]（圖2）

2.討論

相關(guān)性分析表明，蘆筍提取液對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，在底物濃度為5mmol/L 條件下 ，0.116mg/mL濃度的蘆筍提取液對α-葡萄糖苷酶的抑制率可達(dá)到94.62%。。 Lineweaver‐Burk 曲線顯示其為競爭性抑制作用類型。同時，蘆筍提取液中多酚含量與α-葡萄糖苷酶抑制活性呈較明顯的正相關(guān)關(guān)系，因此蘆筍提取液中的多酚可能具有較強的抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用?？梢詫υ撎崛∥镒鲞M(jìn)一步的研究。本實驗表明蘆筍提取物在降血糖等方面具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景，對糖尿病的治療和預(yù)防有積極有效的作用，可將蘆筍制成易儲藏的蘆筍汁作為糖尿病患者的保健食品等，同時也為開發(fā)天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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[3]Editor Committee of National Chinese Medical Manage Bu-reau“Chinese Herb”（國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會）.Traditional Chinese Medicine Volume 8（中華本草，第8卷）.Shanghai：Shanghai Science Technology），House，1999.7.

[4]Sun T，Powers JR，Tang J.Evaluation of the antioxidant activity of asparagus，broccoli and their juices.Food chem，2007，105：101-106

[5] Xia J（夏俊），Chen ZW（陳治文），Shi Y（石瑩）.Green asparagus extracts induce the inhibition of nucleic acid biosynthesis in tumour cells.Terat CarcinMutag （癌變·畸變·突變），2003，15：212-214

[4]Mei HS（梅慧生），Wu YQMG（烏云其木格），Wu ZY（吳仲燕）.The effects by eating asparagus spears on blood lipid levels of human body. Acta Sci Nat Univ Pek （北京大學(xué)學(xué)報，自科版），1990，26：369-373

[6]朱素英.正交實驗設(shè)計優(yōu)化蘆筍嫩莖多酚的提取工藝[J].食品工業(yè)科技，2013.21.072endprint