細(xì)胞傳代致弱的禽偏肺病毒JC毒株致病性變化的研究

韋 莉 , 王 菁 , 朱珊珊 , 閻 旭 , 全 榮 , 李子璇 , 侯 磊 , 齊賓賓 , 姜海軍 , 劉 爵

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點實驗室 ， 北京 海淀 100097)

細(xì)胞傳代致弱的禽偏肺病毒JC毒株致病性變化的研究

韋 莉 , 王 菁 , 朱珊珊 , 閻 旭 , 全 榮 , 李子璇 , 侯 磊 , 齊賓賓 , 姜海軍 , 劉 爵

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點實驗室 ， 北京 海淀 100097)

將禽偏肺病毒(aMPV)JC株在Vero細(xì)胞上傳代傳至第50代時，細(xì)胞適應(yīng)毒株毒價為105.6TCID50/mL；雛雞致病性試驗結(jié)果顯示，aMPV JC株細(xì)胞傳代第50代與親本毒F0相比感染雛雞發(fā)病率降低，病理變化減輕，表明第F50細(xì)胞適應(yīng)毒的毒力減弱。

禽偏肺病毒 JC株 ； 細(xì)胞適應(yīng)病毒 ； 致病性

禽偏肺病毒(avianmetapneumovirus，aMPV)屬于副黏病毒科偏肺病毒屬，能夠引起火雞、雞、鴨以及野鳥等急性呼吸道感染以及產(chǎn)蛋的下降[1]?；痣u鼻氣管炎、禽鼻氣管炎和肉雞腫頭綜合征都與該病毒感染有關(guān)[2]。根據(jù)吸附糖蛋白G的核苷酸序列分析和用單克隆抗體中和試驗，將aMPV分為 A、B、C和D 4個亞型[3]。1978年aMPV感染首先在南非報道[4]，隨后在西班牙、英國、法國、以色列、德國、匈牙利都有該病發(fā)生的報道。我國于1998年在有腫頭綜合征的雞群中首次報道分離到禽肺病毒A亞型[5]。之后在山東、黑龍江、吉林、河北、湖北、新疆等地的部分雞場進(jìn)行aMPV血清學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)我國雞群中普遍存在aMPV感染[6-10]。2012年又陸續(xù)報道在雞群中分離到B和C亞型[11-12]。

aMPV可在多種原代細(xì)胞內(nèi)增殖，如雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)、雞胚肝細(xì)胞(CEL)、原代火雞雞胚成纖維細(xì)胞(TEF)和來自于鵪鶉成纖維細(xì)胞的QT-35細(xì)胞。Patnayak等[13]又證明了aMPV也可在多種傳代細(xì)胞系中增殖，如黑長尾猴腎細(xì)胞(BGM-70)、胎獼猴細(xì)胞(MA-104)、非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)、雞成纖維細(xì)胞(DF-1)、鼠源的McCoy細(xì)胞和敘利亞倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21)等，不同的aMPV毒株對不同細(xì)胞的適應(yīng)性存在差異。

本研究將分離到的禽偏肺病毒C亞型JC株[12]在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，觀察第50代細(xì)胞毒的動物致病性，為禽偏肺病毒細(xì)胞適應(yīng)弱毒苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞、抗體和實驗動物 禽偏肺病毒C亞型JC株[12]由本實驗室分離、鑒定并保存。Vero細(xì)胞本研究室保存。21日齡SPF雛雞，購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑和主要儀器 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基干粉、青鏈霉素雙抗、SuperScriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶，均購自Gibco公司；Qiagen RNeasy Mini Kit，購自Qiagen公司。

1.3 禽偏肺病毒在細(xì)胞上的傳代培養(yǎng) Vero細(xì)胞長成單層后，用PBS洗2次，將病雞組織研磨液接種于細(xì)胞，37C吸附1.5 h，棄吸附液，PBS洗2次，加入1%雙抗和2% FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。逐日觀察，培養(yǎng)7 d后，置于-20 ℃，反復(fù)凍融3次，作為1代病毒分離物。經(jīng)過5代盲傳后，出現(xiàn)細(xì)胞病變，收集70%～80%病變的細(xì)胞。如此反復(fù)，在Vero細(xì)胞上傳代培養(yǎng)至細(xì)胞適應(yīng)毒株第50代(F50)。

1.4 禽偏肺病毒細(xì)胞適應(yīng)毒對易感SPF雞的致病性 30只21日齡SPF雛雞隨機分為3組，滴鼻點眼分別接種禽偏肺病毒 JC株親代毒株和第50代細(xì)胞適應(yīng)毒株，0.2mL/只，標(biāo)記為F0和F50組；剩余1組接種PBS，為陰性對照。隔離器中飼養(yǎng)2周，記錄各組的發(fā)病情況。采集咽拭子和鼻甲、喉頭、氣管和肺臟等組織，觀察組織病理變化，并提取咽拭子中總RNA，進(jìn)行RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 禽偏肺病毒在細(xì)胞上的適應(yīng)性生長 將禽偏肺病毒JC株在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，F(xiàn)1代至F5代，感染細(xì)胞未見明顯的細(xì)胞病變；F6代以后，出現(xiàn)細(xì)胞聚集成團(tuán)、圓縮、脫落、其間隙增寬等現(xiàn)象。產(chǎn)生的CPE與Cook[2]報道的感染特征基本一致。隨著傳代次數(shù)的增加，病毒滴度逐漸升高，F(xiàn)40～F50代病毒的滴度穩(wěn)定在104.3-4.6TCID50/ 0.1mL。說明aMPV-JC株能夠在Vero細(xì)胞上適應(yīng)性生長。

2.2 aMPV JC株F50對雞的致病性

2.2.1 臨床表現(xiàn) F0組雛雞在感染后第3天陸續(xù)出現(xiàn)打噴嚏、鼻孔有分泌物流出等癥狀；攻毒后第5天，大部分雞只甩頭、打噴嚏，鼻部有半透明的黏液分泌出來(見中插彩版圖1A)。感染后第7天F0組雛雞發(fā)病率為100%。F50組感染后第5天1只雛雞出現(xiàn)輕微流涕(見中插彩版圖1B)，發(fā)病率為10%。而對照組未見任何臨床癥狀。表明aMPV細(xì)胞適應(yīng)毒F50與其親代毒F0相比，發(fā)病率大幅降低。

2.2.2 剖檢變化和病理變化 剖檢發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)0組中鼻甲有大量分泌物，或有干酪樣物質(zhì)，氣管有大量黏液；F50組除1只發(fā)病雞鼻甲有分泌物和氣管有輕度黏液外，未發(fā)病雞只與陰性對照雞只一樣無改變(見中插彩版圖2)。

病理檢查發(fā)現(xiàn)F0組鼻甲黏膜增厚，黏膜下血管擴張，充血；氣管黏膜增厚，固有膜內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤；肺泡壁有炎性細(xì)胞浸潤，腔內(nèi)有出血和滲出物；F50組發(fā)病雞只出現(xiàn)與F0組病理變化相同，程度略輕，在肺泡腔內(nèi)未見到出血和滲出物；未發(fā)病雞只除氣管黏膜有輕度增厚外與正常對照無明顯差別(見中插彩版圖3)。這些結(jié)果進(jìn)一步說明aMPV細(xì)胞適應(yīng)毒F50與其親代毒F0相比，毒力明顯減弱。

2.2.3 發(fā)病雛雞實驗室診斷 利用本實驗室建立的aMPV RT-PCR檢測方法對F0和F50感染的發(fā)病雞咽拭子進(jìn)行病毒檢測，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在800 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期aMPV目標(biāo)條帶大小一致(圖4)，表明F0和F50組的發(fā)病雞是由aMPV感染所引起。

圖4 F0和F50感染雞咽拭子病毒RNA檢測M：M:DL-2 000 Marker(bp)； 1: F0； 2:F50； 3:未感染；4:陽性對照； 5：陰性對照

3 討論

禽偏肺病毒是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一[2]，也是導(dǎo)致肉雞腫頭綜合征的重要誘因之一[14]。在火雞養(yǎng)殖業(yè)，aMPV引起的呼吸道疾病所造成的危害僅次于禽流感病毒，造成巨大的經(jīng)濟損失[15]，但其對雞的影響卻知之甚少[2]。

本研究通過對細(xì)胞適應(yīng)毒致病性的研究，發(fā)現(xiàn)aMPV JC株在Vero細(xì)胞連續(xù)傳代過程中，隨著傳代次數(shù)的增加，病毒滴度逐漸升高；傳至第50代時，病毒滴度達(dá)104.6TCID50/0.1mL。用第50代細(xì)胞適應(yīng)毒與其親本毒感染21日齡SPF雞，發(fā)現(xiàn)F50代病毒與親本毒相比出現(xiàn)臨床癥狀的雞只大幅度減少，發(fā)病率只有10%，且發(fā)病雞只病理改變減輕，說明F50與親本毒相比毒力明顯減弱，為今后弱毒苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

[1] McDougall J S, Cook J K A. Turkey rhinotracheitis: preliminary investigations[J]. Vet Rec, 1986, 118:206-207.

[2] Cook J K. Avian pneumovirus infections of turkeys and chickens[J]. Vet J，2000，160:118-125.

[3] Velayudhan B T, Lopes V C, Noll S L,etal. Avian pneumovirus and its survival in poultry litter[J]. Avian Dis，2003，47: 764-768.

[4] Buys S B, Du Preez J H. A preliminary report on the isolation of a virus causing sinusitis in turkeys in South African and attempts attenuate the virus[J]. Turkeys， 11980，28:36-46.

[5] 沈瑞忠，曲立新，于康震，等.禽肺病毒的分離鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，1999，21(1)：76-77.

[6] 郭龍宗, 曲立新.種雞禽肺病毒感染的血清學(xué)調(diào)查[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009，36(4)：149-150.

[7] 王菁，韋莉，朱珊珊，等.禽APV感染情況初步調(diào)查[C].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集. 重慶：中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會，2010：141-142.

[8] 贠炳嶺，劉在斯，吳關(guān)，等.我國部分地區(qū)種雞禽肺病毒感染的血清學(xué)調(diào)查[J].中國家禽，2012，34(12):64-65.

[9] 李亞林，段曉琴.新疆昌吉地區(qū)規(guī)?；N雞場禽偏肺病毒感染情況的血清學(xué)調(diào)查[J].當(dāng)代畜牧，2013(4月中旬刊):72-73.

[10] 徐仕忠，秦云，于鵬，等.中國雞群禽偏肺病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查報告.中國家禽，2013，35(6):59-60.

[11] 薛聰，唐熠，陳琳，等.1株B亞型禽偏肺病毒的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2014，34(1):39-44.

[12] Wei L, Zhu S, Yan X,etal. Avian metapneumovirus subgroup C infection in chickens, China[J]. Emerg Infect Dis，2013，19(7)：1 092-1 094.

[13] Patnayak D P, Tiwari A, Goyal S M. Growth of vaccine strains of avian pneumovirus in different cell lines[J]. Avian Pathol，2005，34(2):123-126.

[14] Banet-Noach C, Simanov L, Perk S. Characterization of Israeli avian metapneumovirus strains in turkeys and chickens[J]. Avian Pathol，2005，34(3):220-226.

[15] Saif Y M.禽病學(xué)[M].蘇敬良，高福，索勛，譯. 12版．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012：110-122.

PathogenicityChangesofCellAttenuatedAvianMetapneumovirusJCStrain

WEI Li , WANG Jing , ZHU Shan-shan , YAN Xu , QUAN Rong , LI Zi-xuan ,HOU Lei , QI Bin-bin , JIANG Hai-jun ，LIU Jue

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Municipal Academy of Agriculture and Forestry Sciences；Beijing Key Laboratory for Prevention and Control of Infectious Diseases in Livestock and Poultry, Beijing 100097，China)

Avianmetapneumovirus(aMPV) JC strain was propagated in Vero cells. The virus titer reached to 105.6TCID50/mL after 50 passages. Compared to parental virus, the morbidity rate decreased and the pathological changes were alleviated in chicken after being challenged with passage 50 virus. It indicated that the virulence of F50 cell adapted strain was attenuated.

avianmetapneumovirusJC strain ； cell adaptive virus ； pathogenicity

LIU Jue

S852.65 文獻(xiàn)杯志碼：A

0529-6005(2017)09-0006-02

2016-12-15

北京市科技計劃項目(Z141100002314013)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-42)

韋莉(1966-)，女，研究員，博士，從事動物病毒學(xué)研究,E-mail：w_lyx2008@126.com

劉爵，E-mail:liujue@263.net