人乳頭狀瘤病毒核酸檢測試劑盒用于宮頸癌及癌前病變篩查的臨床價值

尚樂樂, 胡杰鋒, 王月清, 朱茵茵, 蒯守剛

(1. 江蘇省無錫市惠山區(qū)人民醫(yī)院, 江蘇 無錫, 214000;2. 杭州德同生物技術(shù)有限公司, 浙江 杭州, 310053)

人乳頭狀瘤病毒核酸檢測試劑盒用于宮頸癌及癌前病變篩查的臨床價值

尚樂樂1, 胡杰鋒2, 王月清1, 朱茵茵1, 蒯守剛1

(1. 江蘇省無錫市惠山區(qū)人民醫(yī)院, 江蘇 無錫, 214000;2. 杭州德同生物技術(shù)有限公司, 浙江 杭州, 310053)

目的分析人乳頭狀瘤病毒(HPV)雜交捕獲-化學(xué)發(fā)光法核酸檢測試劑盒(DH3)用于宮頸癌及癌前病變篩查的臨床價值。方法收集480例婦科門診婦女宮頸脫落細(xì)胞樣本，分別采用DH3、TCT和HPV-PCR檢測，對TCT≥ASC-US者行陰道鏡下病理檢測，以病理學(xué)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分析DH3診斷價值。結(jié)果病理學(xué)結(jié)果顯示，正常者370例(77.08%), 良性病變者(≤CINⅠ)59例(12.29%), 高危者(≥CINⅡ)51例(10.63%); TCT、HPV-PCR和DH3診斷陽性率分別為26.04%、32.08%和27.08%; DH3與TCT檢測一致率為94.79%(P<0.01), 與HPV-PCR檢測一致率為93.13%(P<0.01); DH3靈敏度98.18%, 特異度87.57%, 陽性預(yù)測值70.13%, 陰性預(yù)測值99.39%, 準(zhǔn)確率為90%, 檢出高危型(≥CINⅡ)的ROC曲線面積Z=0.887(95%CI為0.785～0.918,P<0.01)。結(jié)論DH3試劑盒與TCT、HPV-PCR在檢出HPV宮頸癌及癌前病變具有高度一致性，靈敏度、特異度和準(zhǔn)確率高，操作便捷，臨床篩查意義顯著。

人乳頭狀瘤病毒; 癌前病變; 宮頸癌; 篩查

人乳頭瘤狀病毒(HPV)持續(xù)感染是誘發(fā)宮頸癌和癌前病變的關(guān)鍵致病因素，幾乎全部宮頸癌切除標(biāo)本均檢測出HPV感染[1-3]。薄層液基細(xì)胞學(xué)(TCT)、HPV-PCR檢測等為篩查宮頸癌及癌前病變的常用技術(shù)[4-5], 但TCT檢測以細(xì)胞學(xué)為基礎(chǔ)，對檢驗人員和醫(yī)療設(shè)備要求嚴(yán)格, HPV-PCR需要PCR檢測專用實驗室，對于衛(wèi)生資源相對匱乏的地區(qū)，不適于進(jìn)行大規(guī)模普及和篩查[6-7]。DH3為HPV核酸檢測試劑盒，采用雜交捕獲-化學(xué)發(fā)光法可對HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68共14種亞型進(jìn)行篩查，具有操作簡便、無需PCR實驗室、對操作人員無特殊資質(zhì)要求的特點，適于各級醫(yī)療機(jī)構(gòu)廣泛展開篩查工作[8]。本研究針對本院獲得的480份婦女宮頸脫落細(xì)胞樣本，分析DH3試劑盒在宮頸癌及癌前病變中的篩查價值，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年11月—2016年11月本院婦科門診480例婦女宮頸脫落細(xì)胞樣本。納入標(biāo)準(zhǔn): 年齡25～60歲，有性生活史3年以上者; 無宮頸、子宮手術(shù)史，無急性生殖道炎癥者; 未接受過盆腔放療治療者; 自愿參加本篩查研究者。排除標(biāo)準(zhǔn): 處于月經(jīng)期者; 近1周內(nèi)使用抗生素類藥物治療者; 不配合診斷者; 重要資料不全者; 合并其他器質(zhì)性疾病者; 合并其他惡性腫瘤者; 妊娠及哺乳期者。480例婦女年齡30～59歲，平均年齡(38.53±7.51)歲。本研究符合倫理學(xué)考量，經(jīng)本院倫理委員會特批，所有患者均簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集: 所有受檢者處于非月經(jīng)期，檢查前3 d不行陰道沖洗或陰道內(nèi)用藥，檢查前1 d無性生活，采用專用宮頸細(xì)胞采集毛刷采集宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本待檢。

1.2.2 宮頸組織病理學(xué)檢測: 于陰道鏡下對可疑部位進(jìn)行宮頸管騷刮術(shù)或多點取宮頸活檢組織，所取標(biāo)本需達(dá)一定深度，用1%甲醛固定后送去病理科檢測。依據(jù)WHO子宮頸腫瘤病理診斷和分類標(biāo)準(zhǔn)[9], 將檢測結(jié)果分為陰性結(jié)果、慢性炎癥、輕度不典型增生(CIN Ⅰ)、中度不典型增生(CINⅡ)、重度典型增生(CIN Ⅲ)和宮頸磷狀細(xì)胞癌(SCC); 活檢結(jié)果為慢性炎癥、CINⅠ者歸為良性病變者, ≥CINⅡ歸為高危型病變。

1.2.3 TCT檢測: 將預(yù)先處理好的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本采用全自動制片機(jī)(美國新柏氏公司，型號ThinPrep 2000)制片，染色采取人工巴氏染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果，依據(jù)細(xì)胞學(xué)癌癥檢測TBS分析系統(tǒng)[10], 對檢測結(jié)果進(jìn)行分類，包括陰性、意義不明顯的非典型鱗狀細(xì)胞(ASC-US)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)和宮頸磷狀細(xì)胞癌(SCC)，TCT結(jié)果≥LSIL者為高危型病變。

1.2.4 HPV-PCR檢測: 將處理好的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本經(jīng)分離、沉淀、萃取等步驟提取DNA后，采用熒光定量PCR技術(shù)，對HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68共14種亞型進(jìn)行篩查，試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因，每次擴(kuò)增均設(shè)置空白對照和陽性對照，診斷結(jié)果以相對光單位(RLU)/最小陽性對照RLU均值(RLU/CO)表示，當(dāng)RLU/CO≥1.0, 則對應(yīng)檢出結(jié)果為陽性, <1.0結(jié)果則為陰性。

1.2.5 DH3檢測: DH3為快速HPV-DNA檢出試劑盒，宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本收集后，經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后，暴露HPV-DNA，將其解鏈，單鏈DNA與HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68共14種亞型HPV全長互補(bǔ)RNA雜交，形成HPV-DNA/RNA雜交物，使用含有單克隆抗體的磁珠與雜交物混合，再依次加入堿性磷酸酶和相應(yīng)顯色第五，依據(jù)底物光強(qiáng)度反應(yīng)HPV-DNA數(shù)量，當(dāng)RLU/CO≥1.0, 則對應(yīng)檢出結(jié)果為陽性, <1.0結(jié)果則為陰性，檢測過程進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)量控制。

1.3 觀察指標(biāo)

① 病理學(xué)診斷結(jié)果與DH3、TCT、HPV-PCR診斷結(jié)果對比; ② 分析DH3與TCT檢測一致性; ③ 分析DH3與HPV-PCR檢測一致性; ④ 分析DH3的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值; ⑤ 分析DH3檢出高危型(≥CINⅡ)的ROC曲線。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件，計數(shù)資料以例(n)或百分比率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗, DH3與TCT和HPV-PCR采用Kappa一致性檢驗, DH3診斷高危型HPV感染特異度采用ROC曲線分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DH3、TCT、HPV-PCR檢測結(jié)果與病理學(xué)結(jié)果比較

病理學(xué)結(jié)果顯示，正常者370例(77.08%), 良性病變者(≤CINⅠ)59例(12.29%), 高危者(≥CINⅡ)51例(10.63%), 陽性率為22.92%; TCT診斷陽性率為26.04%(125/480), HVP-DNA診斷陽性率為32.08%(154/480), DH3診斷陽性率為27.08%(130/480)。見表1。

表1 DH3、TCT、HPV-PCR檢測結(jié)果與病理學(xué)結(jié)果比較

2.2 DH3與TCT檢測一致性分析

Kappa=86.65%(P<0.001), DH3與TCT檢測一致率為94.79%(455/480)。見表2。

表2 DH3與TCT檢測一致性分析

2.3 DH3與HPV-PCR檢測一致性分析

Kappa=0.8314(P<0.001), DH3與HPV-PCR檢測一致率為93.13%(447/480)。見表3。

表3 DH3與HPV-PCR檢測一致性分析

2.4 DH3的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分析

DH3的靈敏度為98.18%(108/110), 特異度為87.57%(324/370), 陽性預(yù)測值為70.13%, 陰性預(yù)測值為99.39%, 準(zhǔn)確率為90%。見表4。

表4 DH3的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分析

2.5 DH3檢出高危型(≥CINⅡ)的ROC曲線分析

DH3檢出高危型(≥CINⅡ)的ROC曲線分析面積Z=0.887(95%CI為0.785～0.918,P<0.001)。

3 討 論

宮頸輕度-中度-重度不典型增生是發(fā)生宮頸癌必經(jīng)癌前病變階段，對癌前病變和早期宮頸癌進(jìn)行有效篩查和診斷，及早開展手術(shù)、放化療等方式治療，可有效預(yù)防宮頸癌發(fā)生發(fā)展[11]。HPV持續(xù)感染是宮頸癌誘發(fā)原因，傳統(tǒng)巴氏涂片細(xì)胞學(xué)檢測假陰性率高，存在一定局限性，目前TCT和HPV-DNA檢測應(yīng)用較為廣泛[12]。TCT作為一種新興技術(shù)，其制作的單層細(xì)胞涂片具有閱片容易、高質(zhì)、高效、清晰等特點，結(jié)果更加可靠[13]。HPV-DNA檢測為WHO最新宮頸癌前病變指南推薦初篩方法, 2015年《美國宮頸癌篩查過渡期指南》指出, HPV-DNA初篩高危型HPV感染與細(xì)胞學(xué)方法比較，可保證更低罹患宮頸癌概率，提示以HPV-DNA為基礎(chǔ)的宮頸癌篩查具有更加廣闊應(yīng)用前景[14-15]。

HPV-PCR和二代雜交捕獲法(HC2)為HPV核酸檢測常用方法，但HPV-PCR檢測需專用實驗室檢測，對檢測人員要求較高，而HC2也需先進(jìn)設(shè)備，費用昂貴，不易開展廣泛普查[16-17]。DH3核酸檢測試劑盒，采用雜交捕獲-化學(xué)發(fā)光法，在65 ℃環(huán)境下，其特異性RNA探針可與HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68共14種亞型分別結(jié)合為DNA-RNA雜合體，可有效避免假陰性和假陽性，并可將HPV-16/18型與其他12種高危型HPV型區(qū)別開來，可用于宮頸疾病初篩和處理后定性監(jiān)測，與HPV-PCR和HC2比較，具有操作簡便、無需PCR實驗室、對操作人員無特殊資質(zhì)要求、價格相對低廉的特點，適于各級醫(yī)療機(jī)構(gòu)廣泛開展研究，便于醫(yī)院風(fēng)險分層管理，臨床指導(dǎo)意義重大。

本研究中, 480例婦科門診患者經(jīng)病理學(xué)診斷后，宮頸良性病變率12.29%, 高危型病變率10.63%, 總病變率22.92%, 與方婧等[18]的22.77%接近，而高于謝珊艷等[19]的10.7%和宛麗梅[20]的3.71%, 說明本地區(qū)宮頸癌及癌前病變患者比率略高，需加以重視。本研究中, DH3診斷宮頸癌及癌前病變陽性率為27.08%, TCT為26.04%, HPV-PCR為32.08%, DH3與TCT檢測一致率為94.79%, 與HPV-PCR檢測一致率為93.13%, 說明DH3具有與TCT和HPV-PCR診斷宮頸癌及癌前病變具有高度一致性。但無論是DH3、TCT還是HPV-PCR, 其診斷陽性率均高于病理學(xué)診斷，說明三種檢測方法均存在一定假陽性率，后期還需進(jìn)一步優(yōu)化。本研究中, DH3檢測靈敏度為98.18%, 特異度為87.57%, 陽性預(yù)測值為70.13%, 陰性預(yù)測值為99.39%, 準(zhǔn)確率為90%, 說明DH3診斷價值較高。通過繪制DH3檢測高危型(≥CINⅡ)宮頸病變的ROC曲線，發(fā)現(xiàn)ROC曲線下面積為0.887(95%CI為0.785～0.918,P<0.001), 說明DH3對高危型(≥CINⅡ)宮頸病變具有較高診斷價值。

綜上所述, DH3試劑盒與TCT、HPV-PCR在檢出HPV宮頸癌及癌前病變具有高度一致性，靈敏度、特異度和準(zhǔn)確率高，操作便捷，對高危型宮頸病變有較高診斷價值。

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Clinicalvalueofhumanpapillomavirusnucleicaciddetectionkitinscreeningcervicalcancerandprecancerouslesions

SHANGLele1,HUJiefeng2,WANGYueqing1,ZHUYinyin1,KUAIShougang1

(1.WuxiHuishanDistrictHospital,Wuxi,Jiangsu, 214000; 2.HangzhouDeTongBiologicalTechnologyCorporationLimited,Hangzhou,Zhejiang, 310053)

ObjectiveTo analyze the clinical value of the second generation hybrid capture nucleic acid detection kit (DH3) of human papillomavirus (HPV) in screening cervical cancer and precancerous lesions.MethodsThe cervical exfoliated cell samples of 480 women in gynecologic clinic were collected and detected by DH3, TCT and HPV-PCR. Colposcopic pathological examination was performed in women with TCT≥ASC-US. With the pathological results as the golden standard, the diagnostic value of DH3 was analyzed.ResultsThe pathological results showed that 370 cases were normal (77.08%), 59 cases had benign lesions (≤CIN Ⅰ) (12.29%) and 51 were high-risk cases (≥CIN Ⅱ) (10.63%). The positive diagnostic rates of TCT, HPV-PCR and DH3 were 26.04%, 32.08% and 27.08%, respectively. The concordancerate of DH3 and TCT was 94.79% (P<0.01), and the concordance rate with HPV-PCR was 93.13% (P<0.01). The sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and accuracy rate of DH3 were 98.18%, 87.57%, 70.13%, 99.39% and 90%, respectively. The ROC area of detection of high-risk (CIN Ⅱ) wasZ=0.887 (95%CI 0.785～0.918,P<0.01).ConclusionDH3 kit has a high degree of consistency with TCT and HPV-PCR in the detection of HPV cervical cancer and precancerous lesions. The sensitivity, specificity and accuracy are high, and it is easy to operate.

human papillomavirus; human papillomavirus; cervical cancer; screening

R 737.33

A

1672-2353(2017)19-099-04

10.7619/jcmp.201719028

2017-03-21

江蘇省自然科學(xué)基金項目(BK2012564)

蒯守剛