GnIH對(duì)去卵巢兼予雌激素大鼠下丘腦POMC的調(diào)節(jié)作用*

魏 萌 ，司麗娜，陳 磊，楊松鶴，程露陽，喬躍兵、2△

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校）

GnIH對(duì)去卵巢兼予雌激素大鼠下丘腦POMC的調(diào)節(jié)作用*

魏 萌1，司麗娜1，陳 磊1，楊松鶴1，程露陽1，喬躍兵1、2△

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校）

目的:探討側(cè)腦室微量注射促性腺激素抑制激素（GnIH）對(duì)下丘腦阿片-促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原(POMC)蛋白表達(dá)的影響。方法：40只雌性SD大鼠建立卵巢摘除術(shù)補(bǔ)充雌激素（OEP）大鼠模型后隨機(jī)分為對(duì)照組（n=20）和實(shí)驗(yàn)組（n=20），分別于側(cè)腦室微量注射生理鹽水和GnIH 4μl；每組根據(jù)注射時(shí)間不同分為注射1h、2h、4h、6四個(gè)亞組（n=5）。采用蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)下丘腦POMC蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果：注射1h、2h、4h，實(shí)驗(yàn)組大鼠下丘腦POMC蛋白的表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。注射6h，實(shí)驗(yàn)組大鼠下丘腦POMC蛋白的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論：側(cè)腦室微量注射GnIH可以抑制下丘腦POMC蛋白的表達(dá)。

側(cè)腦室；GnIH；POMC；下丘腦-垂體-性腺軸

生殖功能作為包括人類在內(nèi)的諸多物種得以繁衍后代、延續(xù)種族的基礎(chǔ)，一直受到研究者的廣泛關(guān)注，而下丘腦-垂體-性腺軸是生殖功能的重要組成部分。近年的研究結(jié)果表明，促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone，GnRH）并不是調(diào)節(jié)促性腺激素的唯一激素，早在2000年日本研究者在鳥類的下丘腦中發(fā)現(xiàn)了一種新的神經(jīng)肽，它可以直接作用于GnRH神經(jīng)元從而抑制性腺激素的合成和釋放，因此被命名為促性腺激素抑制激素（gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH）[1]。阿片-促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原（Proopiomelanocortin，POMC）是一種厭食性相關(guān)肽，裂解產(chǎn)物較多，其神經(jīng)元廣泛存在于下丘腦弓狀核及鄰近核團(tuán)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，POMC神經(jīng)元與GnRH神經(jīng)元有突觸上的聯(lián)系，說明POMC可直接作用于GnRH來調(diào)節(jié)生殖功能[2]。而POMC神經(jīng)元是否可以作為GnIH抑制GnRH的途徑目前國內(nèi)外尚無此方面的研究。本研究旨在觀察大鼠側(cè)腦室注射GnIH后下丘腦POMC蛋白表達(dá)的變化，為探討GnIH是否可以通過POMC神經(jīng)元這一途徑間接影響GnRH提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立與分組 40只成年健康雌性SD大鼠（北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：11401300016009）行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)，術(shù)后第15d開始腹部皮下注射17β-雌二醇（0.1mg/kg/d）連續(xù)5d，以建立卵巢摘除術(shù)補(bǔ)充雌激素（OEP）大鼠模型。所有OEP模型大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，兩組再根據(jù)注射時(shí)間不同分為注射1h、2h、4h、6h四個(gè)亞組，每組5只。根據(jù)George Paxinos[3]的方法定位側(cè)腦室：前囟點(diǎn)后1.0mm，旁開1.5mm，進(jìn)針深度4.4mm。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組組大鼠分別向側(cè)腦室微量注射GnIH（PeproTech公司）和生理鹽水各4μl，于5min內(nèi)注射完畢。

1.2 蛋白樣品制備和Western blot分析 兩組大鼠分別微量注射GnIH和生理鹽水1h、2h、4h、6h后處死，迅速取出下丘腦稱重，加入裂解液后提取總蛋白，總蛋白含量用蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）測(cè)定，電泳時(shí)蛋白上樣量120μg。經(jīng)SDS-PAGE（12%分離膠，4%堆積膠）分離的蛋白電轉(zhuǎn)移（150mA，1.5h）至PVDF膜（Millipore）上，含5%脫脂奶粉的TBS緩沖液室溫封閉1h，一抗[兔抗POMC多克隆抗體(1：1000，Santa Cruz公司)，鼠抗β-actin單克隆抗體(1：1000，Abcam公司)]4℃孵育過夜，二抗[(HRP)結(jié)合的羊抗兔IgG(1：1000，Pierce公司)和羊抗小鼠IgG(1：1000，Pierce公司)]孵育1h，洗膜5次后，化學(xué)發(fā)光法顯色。圖像掃描后采用Quantity One 4.6.2分析軟件分析條帶的平均灰度值，以目的條帶灰度值與對(duì)應(yīng)β-actin條帶灰度值之比作為POMC蛋白表達(dá)量的相對(duì)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

注射1h、2h、4h，實(shí)驗(yàn)組大鼠下丘腦POMC蛋白的表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。注射6h，實(shí)驗(yàn)組大鼠下丘腦POMC蛋白的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。見附圖、附表：

附圖 大鼠下丘腦POMC蛋白的表達(dá)

附表 側(cè)腦室注射GnIH對(duì)OEP大鼠下丘腦POMC蛋白表達(dá)的影響（n=5）

3 討論

生殖功能是各種生物繁衍生息的基礎(chǔ)，而下丘腦-垂體-性腺軸是調(diào)控哺乳動(dòng)物生殖功能的主要系統(tǒng)之一。GnRH是1971年發(fā)現(xiàn)的一種下丘腦神經(jīng)肽，可以通過垂體門脈系統(tǒng)，刺激垂體前葉分泌促性腺激素，即黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和卵泡雌激素（folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH），二者又可以作用于性腺，促進(jìn)精子和卵子的發(fā)生[3]。在過去的30年里，GnRH被認(rèn)為是下丘腦唯一的調(diào)節(jié)激素。直到研究者于2000年在鳥類的下丘腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種新的神經(jīng)肽，它可以通過抑制促性腺激素的合成和釋放來影響鳥類的生殖功能，因此被命名為GnIH[1]。GnIH最早被發(fā)現(xiàn)于鳥類的下丘腦，可以抑制促性腺激素的合成和釋放[4]。而近年的研究結(jié)果證明，在哺乳動(dòng)物下丘腦的背內(nèi)側(cè)核及背內(nèi)側(cè)核與下丘腦腹內(nèi)側(cè)核中間的區(qū)域也發(fā)現(xiàn)了GnIH神經(jīng)元[5-7]。2012年，研究者在GnRH神經(jīng)元上發(fā)現(xiàn)了GnIH受體的表達(dá)，說明GnIH可以直接作用于GnRH來完成對(duì)生殖功能的抑制作用[7]。POMC是一種厭食性相關(guān)肽[8]，其神經(jīng)元主要表達(dá)在下丘腦的弓狀核及相近核團(tuán)。POMC裂解后的β內(nèi)啡肽可調(diào)節(jié)機(jī)體的生殖功能。相關(guān)的研究證明，POMC神經(jīng)元可直接作用于GnRH神經(jīng)元，進(jìn)而促進(jìn)生殖功能[2]。而GnIH是否可以通過POMC這一途徑來調(diào)控GnRH神經(jīng)元進(jìn)而調(diào)節(jié)促性腺激素的合成和釋放，國內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。

本研究建立了OEP大鼠模型，消除雌激素對(duì)GnRH的影響，采用蛋白印跡技術(shù)觀察了大鼠側(cè)腦室微量注射GnIH 1h、2h、4h、6h后，下丘腦POMC蛋白表達(dá)的變化情況。結(jié)果顯示，側(cè)腦室微量注射GnIH 1h、2h、4h后，下丘腦POMC蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯變化；而側(cè)腦室注射GnIH 6h后，下丘腦POMC蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比明顯降低，說明側(cè)腦室注射GnIH在一定時(shí)間內(nèi)可抑制下丘腦POMC蛋白的表達(dá)。

本研究表明，側(cè)腦室注射GnIH可抑制大鼠下丘腦POMC蛋白的表達(dá)，同時(shí)提示GnIH除了直接作用于GnRH神經(jīng)元外，還可能通過POMC這一途徑間接影響GnRH，確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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REGULATING EFFECTS OF GNIH ON POMC IN HYPOTHALAMUS OF OEP RATS

WEI Meng, SI Li-na, CHEN Lei, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To explore the e ff ects of microinjection of gonadotropin releasing hormone (GnIH) intolateral ventricle on proopiomelanocortin (POMC) expression in hypothalamus of ovariectomized and estrogen-primed(OEP) rats.Methods:40 female SD rats were established OEP rat’s model and then randomly divided into control group and experimental group with 20 rats in each group. The rats in 2 groups were injected 4μl normal saline and 4μl GnIH into the lateral ventricle respectively; and the rats in each group were further divided into 1h, 2h, 4h, 6h 4 subgroups according to the time after injection (n=5). Western blot was used to detect the POMC protein expression in hypothalamus of rats in each group.Results:1h, 2h, 4h after injection, there was no statistically signi fi cant di ff erence about POMC expression in hypothalamus of rats in experimental group compared with that of rats in control group(P＞0.05). 6h after injection, the POMC expression in hypothalamus of rats in experimental group was obviously lower than that of rats in control group (P＜0.05).Conclusions:Microinjection of GnIH into the lateral ventricle can inhibit expression of POMC in hypothalamus.

Lateral ventricle; GnIH; POMC; Hypothalamic-pituitary-gonadal axis

R338.2

A

1004-6879（2017）06-0458-03

* 河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（H2013406115），河北省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目（08276101D-20），河北省高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（QN2015121），河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究項(xiàng)目（20130012）

△ 通訊作者

（收稿日期：2017-01-18）

(基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)欄目編輯：陳志宏)

（收稿日期：2017-01-18）

(基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)欄目編輯：陳志宏)