中國南北方山楂葉UPLC指紋圖譜比較分析*

徐寶欣，楊明宇，李明臣，高 婧，李艷榮，潘海峰△

（1.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德 067000；2.河北省灤平縣中醫(yī)院）

中國南北方山楂葉UPLC指紋圖譜比較分析*

徐寶欣1，楊明宇1，李明臣2，高 婧1，李艷榮1，潘海峰1△

（1.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德 067000；2.河北省灤平縣中醫(yī)院）

目的:通過建立基于主成分分析（PCA）的山楂葉超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜對我國南北方山楂葉進行比較分析。方法：采用UPLC法對我國北方（10批）、南方（6批）共16批山楂葉進行分析，建立基于PCA的山楂葉UPLC指紋圖譜。結(jié)果：通過主成分分析篩選出9批樣品、6批樣品，分別建立北方和南方山楂葉UPLC指紋圖譜。北方山楂葉指紋圖譜得到16個共有峰，相似度為0.808-0.972；南方山楂葉指紋圖譜得到23個共有峰，相似度為0.923-0.979。結(jié)論：本研究構(gòu)建的基于PCA的山楂葉UPLC指紋圖譜能客觀評價我國南北方山楂葉藥材的差異，可為山楂葉的臨床應(yīng)用提供參考。

山楂葉；主成分分析；指紋圖譜

山楂葉是薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge.Var.Major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥葉，具有抗血栓、抗心肌缺血、降壓、降脂等藥理作用[1-3]，其制劑在臨床上具有療效顯著、不良反應(yīng)少的優(yōu)勢[4]。目前，山楂葉及其制劑已得到廣泛應(yīng)用[5-6]。但我國所用山楂葉藥材來源有所不同，北方部分省份習(xí)用藥典收錄的山楂葉，南方部分省份習(xí)用廣山楂葉the Leaves of Malus doumeri(Bois)Chev[7-8]。隨著我國對藥材質(zhì)量和來源問題的逐漸重視，有必要對南北不同產(chǎn)地山楂葉進行比較分析，以保證臨床療效。本研究采用超高效液相色譜（UPLC）法，對山楂葉黃酮類活性成分進行指紋圖譜研究，并采用主成分分析結(jié)合相似度評價，對南北不同產(chǎn)地山楂葉進行比較，以期為山楂葉的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters AcquityTM超高效液相色譜儀，KQ-700型超聲波清洗器，AG-245型十萬分之一電子分析天平，HC-2062高速離心機。

牡荊素（111687-200602）、金絲桃苷（111521-200303），中國藥品生物制品檢定所；綠原酸（120416）、牡荊素葡萄糖苷（151103）、牡荊素鼠李糖苷（151024），上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。甲醇、乙腈，色譜純；娃哈哈純凈水，其它試劑均為分析純。

16批山楂葉由承德民族師范學(xué)院董建新教授鑒定：S1-S10，薔薇科植物山里紅或山楂的干燥葉；S11-S16，薔薇科蘋果屬植物臺灣林檎Malus doumeri(Bois)Chev.或光萼林檎Malus leiocalyca S.Z.Huang.的干燥葉。藥材來源：北方：河北S1-S8，山東S9-S10；南方：廣東S11、S15，廣西S12-S13、S14、S16。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters CORTECS UPLC C18（3.0mm×100mm，1.6μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%乙酸水（B）；進樣量：3μl；流速：0.2ml/min；梯度洗脫：T：0min-3min-6min-13min-16min-24min-28min-30min，A：13%-13%-17%-17%-25%-40%-80%-80%；柱溫：30℃；檢測波長：320nm。

2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取牡荊素、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、綠原酸、金絲桃苷對照品適量，甲醇溶解，配制成每1ml含牡荊素0.020mg、牡荊素葡萄糖苷0.097mg、牡荊素鼠李糖苷0.196mg、綠原酸0.033mg、金絲桃苷0.038mg的混合溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取山楂葉藥材粉末（過60目篩）0.5g，置具塞錐形瓶中，加60%甲醇溶液25ml，稱重，超聲（700W，40kHz）提取30min；取出置室溫，60%甲醇補足失重，搖勻，12000r/min離心10min；0.20μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，備用。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗：取同一批藥材（S7）供試品溶液，按2.1 的色譜條件連續(xù)進樣5次。結(jié)果顯示各共有峰相對峰面積RSD＜2.5%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗：取同一藥材（S7）供試品溶液，分別于0h、2h、4h、8h、12h、24h，按2.1的色譜條件測定。結(jié)果顯示各共有峰相對峰面積RSD＜2.5%，說明供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗：取同一藥材（S7），平行制備供試品溶液6份，分別按2.1的色譜條件測定。結(jié)果顯示各共有峰相對峰面積RSD＜3%，表明實驗方法具有良好的重復(fù)性。

2.5 樣品篩選

2.5.1 樣品測定：制備16批山楂葉供試品溶液，按2.1的色譜條件進樣分析。根據(jù)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》進行評價，共標(biāo)定8個共有峰，相似度（0.366-0.953）差異較大，需采用主成分分析（PCA）進一步分析。2.5.2 主成分分析：以8個共有峰峰面積為變量，運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計算16批山楂葉成分特征值、貢獻率、累計貢獻率，結(jié)果顯示有3個成分的特征值＞1，認(rèn)定為主成分。計算16批山楂葉主成分得分，繪制樣品主成分特征平面圖和三維圖（圖1），篩選出作為建立南北不同產(chǎn)地山楂葉UPLC指紋圖譜的樣品，北方9批（除S6）、南方6批（S11-S16）。

圖1 主成分特征圖

2.6 南北不同產(chǎn)地山楂葉指紋圖譜共有模式的建立 將2.5.2中篩選出的樣品導(dǎo)入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》，分別建立南北不同產(chǎn)地山楂葉指紋圖譜共有模式（疊加圖見圖2-3）。北方山楂葉指紋圖譜共標(biāo)定16個共有峰，相似度為0.808-0.972；南方山楂葉指紋圖譜共標(biāo)定23個共有峰，相似度為0.923-0.979。因此，基于主成分分析構(gòu)建的UPLC指紋圖譜科學(xué)合理，可為南北不同產(chǎn)地山楂葉的指紋圖譜研究提供依據(jù)。

圖2 北方山楂葉藥材UPLC指紋圖譜疊加圖

圖3 南方山楂葉藥材UPLC指紋圖譜疊加圖

3 討論

本研究基于主成分分析，分別對南北不同產(chǎn)地共16批山楂葉樣品UPLC指紋圖譜進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)北方山楂葉有16個共有峰，而南方山楂葉有23個。另外，在同一色譜條件下，出峰時間13.05min之前，南北方山楂葉指紋圖譜差異不明顯；17.39min以后，南方山楂葉出峰較多，可能所含成分種類上存在差異。因此，建議進行山楂葉的相關(guān)研究時應(yīng)注意南北方山楂葉成分種類的差異，仔細(xì)甄別篩選，以保證臨床療效。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.32.

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[3]Ku SK, Kwak S, Kwon OJ, et al. Hyperoside inhibits high-glucose-induced vascular inflammation in vitro and in vivo[J].In fl ammation, 2014, 37(5): 1389-1400.

[4]宋玉超，連超杰，李強，等.山楂葉及其制劑對心血管作用的研究進展[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2011，26(1)：25-28.

[5]俞潔瓊，張鍇，留萍，等.山楂葉總黃酮緩釋膠囊的研制及釋藥機制考察[J].中國新藥雜志，2016，25(15)：1758-1764.

[6]楊樺，楊麗美，俞維，等.山楂葉益心酮穴位注射對肥胖大鼠的減肥作用[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，32(2)：305-307.

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COMPARATIVE ANALYSIS OF UPLC FINGERPRINTS OF HAWTHORN LEAVES IN SOUTH AND NORTH CHINA

XU Bao-xin, YANG Ming-yu, LI Ming-chen, et al
(Institute of Chinese Materia Medica/Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine,Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To comparatively analyze thehawthorn leavesin south and north China by establishing HPLC fingerprints based on principal component analysis (PCA).Methods:HPLC was used to analyze 16 batches ofhawthorn leavesfrom south (6 batches) and north (10 batches) China, and established HPLC fingerprints based on PCA.Results:9 batches from north China and 6 batches from south China were selected to establish the UPLC fingerprints ofhawthorn leavesbased on PCA.The HPLC fingerprints ofhawthorn leavesfrom north China had 16 common peaks, and the similarity was 0.808-0.972; the HPLC fingerprints ofhawthorn leavesfrom south China had 23 common peaks, and the similarity was 0.923-0.979.Conclusions:The HPLC fingerprints ofhawthorn leavesbased on PCA in this study can objectively evaluate the differences ofhawthorn leavesin south and north China, so it can provide references for clinical application ofhawthorn leaves.

Hawthorn leaves; Principal component analysis; Fingerprint

R284.1

A

1004-6879（2017）06-0456-03

* 河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點項目（ZD2015097），承德市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目（201601A043），河北省高校重點學(xué)科建設(shè)項目資助

△ 通訊作者

2017-02-16）