絲膠對(duì)大鼠INS-1細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的影響*

孫一嬋，王丹丹，李東哲，劉美曉，王小杰，陳志宏

（承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

絲膠對(duì)大鼠INS-1細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的影響*

孫一嬋，王丹丹，李東哲，劉美曉，王小杰△，陳志宏△

（承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

目的:探討蠶繭提取物—絲膠對(duì)大鼠INS-1細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。方法INS-1細(xì)胞分為三組，正常對(duì)照組、鏈脲佐菌素（STZ）損傷組和絲膠處理組。正常對(duì)照組細(xì)胞用不含藥物的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；STZ損傷組細(xì)胞用完全培養(yǎng)基配制的STZ溶液（10mmol/L）培養(yǎng)24h；絲膠處理組細(xì)胞用完全培養(yǎng)基配制的同時(shí)含STZ（10mmol/L）和絲膠（300μg/ml）的溶液培養(yǎng)24h。采用Western Blotting法檢測(cè)各組INS-1細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，STZ損傷組INS-1細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)；與STZ損傷組比較，絲膠處理組細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。結(jié)論：絲膠可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)抑制β細(xì)胞凋亡。

絲膠；INS-1細(xì)胞；Bcl-2蛋白

自1972年Kerr提出細(xì)胞凋亡（apoptosis）的概念以來(lái)，人們對(duì)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象進(jìn)行了廣泛、深入的研究。在調(diào)控細(xì)胞凋亡的一系列原癌基因和抑制癌基因中，Bcl-2家族起著決定性的作用。Bcl-2（B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一種癌基因，具有抑制凋亡的作用，并且近年來(lái)的一些研究已開(kāi)始揭示其抑制凋亡的作用機(jī)制[1-2]。

絲膠（或稱絲膠蛋白）為蠶繭中的水溶性蛋白，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，絲膠可降低2型糖尿病大鼠的血糖水平，且能抑制模型大鼠血糖水平的升高[3]，但絲膠降血糖的作用機(jī)制尚未明了。為此，本研究選擇大鼠胰島素瘤細(xì)胞（INS-1細(xì)胞）為研究對(duì)象，以鏈脲佐菌素（STZ）處理INS-1細(xì)胞模擬高血糖損傷，探討了絲膠對(duì)INS-1細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的作用，以期為揭示絲膠降血糖的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 絲膠的制備 稱取一定量的蠶繭（黃色蠶繭，由承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供），浴比1：30，1%碳酸鈉浸泡30min，煮沸3h，提取兩次，兩次的提取液減壓濃縮，濃縮液經(jīng)8000nm-14000nm透析袋透析過(guò)夜，透析液冷凍干燥成粉末，-20℃冰箱保存。臨用時(shí)用完全培養(yǎng)基配制成溶液，0.22μm濾器過(guò)濾除菌。

1.2 INS-1細(xì)胞的培養(yǎng)和處理 大鼠INS-1細(xì)胞（購(gòu)自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司）用含F(xiàn)BS（10%）和β-巰基乙醇（50μmol/L）的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)2天-3天，至80%-90%融合后傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

INS-1細(xì)胞分為三組，正常對(duì)照組、STZ損傷組和絲膠處理組。正常對(duì)照組細(xì)胞用不含藥物的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；STZ損傷組細(xì)胞用完全培養(yǎng)基配制的STZ溶液培養(yǎng)24h，STZ（美國(guó)Sigma公司，-20℃冰箱保存）終濃度為10mmol/L；絲膠處理組細(xì)胞用完全培養(yǎng)基配制的同時(shí)含STZ（終濃度為10mmol/L）和絲膠（終濃度為300μg/ml）的溶液培養(yǎng)24h。

1.3 倒置顯微鏡觀察各組INS-1細(xì)胞的形態(tài) INS-1細(xì)胞按1×105個(gè)/ml接種于6孔板，貼壁培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用PBS清洗細(xì)胞，以換液的形式分別給予各組INS-1細(xì)胞不同的藥物處理，孵育24h后將6孔板置于倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)。

1.4 Bcl-2蛋白表達(dá)的檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，向各組INS-1細(xì)胞中加入蛋白裂解液，以反復(fù)凍融的方式提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶生物有限公司）定量。蛋白上樣量30μg，15% SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，一抗（艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，1：500）室溫孵育2h，二抗(1：5000，美國(guó)KPL公司)室溫?fù)u床孵育2h，Super ECL Plus超敏發(fā)光液顯影。掃描膠片后，應(yīng)用Quantity One-v 4.6.2軟件分析顯影條帶，以目的條帶與β-actin條帶的灰度比值，作為Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示，三組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組INS-1細(xì)胞的形態(tài) 正常對(duì)照組INS-1細(xì)胞數(shù)量較多，單層生長(zhǎng)，分布均勻，呈不規(guī)則多邊形，細(xì)胞有連接融合傾向；STZ損傷組INS-1細(xì)胞間隙增寬，出現(xiàn)漂浮、脫落現(xiàn)象，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變：細(xì)胞變圓，體積變?。慌cSTZ損傷組相比，絲膠處理組細(xì)胞間隙變窄，漂浮、脫落細(xì)胞減少，細(xì)胞形態(tài)趨于正常。見(jiàn)圖1：

圖1 各組INS-1細(xì)胞的形態(tài)（×200）

2.2 各組INS-1細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)情況 與正常對(duì)照組相比，STZ損傷組INS-1細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)；與STZ損傷組比較，絲膠處理組細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。見(jiàn)圖2、附表：

附表 各組INS-1細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)情況（±s ）

附表 各組INS-1細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)情況（±s ）

與正常對(duì)照組比較：1)P＜0.05；與STZ損傷組比較：2)P＜0.05

組別 n B c l-2蛋白正常對(duì)照組 3 0.9 6±0.0 1 S T Z損傷組 3 0.7 8±0.0 1 1)絲膠處理組 3 0.8 4±0.0 1 2)

圖2 各組INS-1細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)

3 討論

2型糖尿病發(fā)病的主要原因是胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能缺陷，但誰(shuí)處于主導(dǎo)地位尚存在爭(zhēng)議。有尸檢發(fā)現(xiàn)，肥胖的2型糖尿病患者胰島β細(xì)胞數(shù)量?jī)H是非糖尿?。ǚ逝郑┱叩?0%，提示β細(xì)胞凋亡參與了2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展[4-5]；也因此提示，有效抑制β細(xì)胞凋亡可能對(duì)于控制2型糖尿病的進(jìn)展具有重要意義。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中具有重要意義，在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及多系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。凋亡具有復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制，是多基因嚴(yán)格控制的過(guò)程，雖然目前凋亡過(guò)程的確切機(jī)制尚不完全清楚，但凋亡過(guò)程的紊亂可能與多種病變相關(guān)，如腫瘤、自身免疫性疾病等。Bcl-2家族是眾多調(diào)控細(xì)胞凋亡的因子之一，其抑制細(xì)胞凋亡的作用可能與以下因素有關(guān)：Bcl-2可以抑制細(xì)胞色素c（Cyt c）的釋放，從而抑制超氧陰離子的產(chǎn)生，通過(guò)抗氧化作用抑制細(xì)胞凋亡[6]；Bcl-2具有抑制Ca2+跨膜流動(dòng)的作用，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度調(diào)節(jié)凋亡[7]；過(guò)度表達(dá)的Bcl-2能抑制線粒體通透性的改變，并影響巨孔的形成，從而抑制凋亡[8]。

我國(guó)最早將糖尿病成書(shū)的是《黃帝內(nèi)經(jīng)》，《素問(wèn)》提及了“消渴病”（即糖尿?。┑牟∶嗅t(yī)辯證觀點(diǎn)認(rèn)為糖尿病是一種氣陰兩虛的慢性代謝紊亂疾病，符合中醫(yī)“多虛、多瘀”的觀點(diǎn)，治療原則是生精清熱、潤(rùn)燥養(yǎng)陰等。蠶繭，別名蠶衣、繭黃、綿蠶等，為蠶蛾科昆蟲(chóng)家蠶蛾的繭殼，具有滋陰潤(rùn)燥、生精止渴的作用，主治腸風(fēng)便血、淋痛尿血、消渴飲引等，且民間亦有蠶繭泡水輔助降糖的用法[9]。本研究前期研究發(fā)現(xiàn)絲膠具有明顯的降血糖作用，但具體機(jī)制不明。為此，本研究以大鼠胰島素瘤INS-1細(xì)胞為研究對(duì)象，采用STZ損傷INS-1細(xì)胞建立模型，結(jié)果顯示，絲膠處理INS-1細(xì)胞可明顯升高Bcl-2蛋白的表達(dá)。本研究提示，絲膠可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)抑制β細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮降低血糖的作用，但仍需其它研究進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果，為豐富絲膠降血糖的作用機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)資料。

[1]Khazaei S, Ramachandran V, Abdul Hamid R,et al.Flower extract of Allium atroviolaceum triggered apoptosis, activated caspase-3 and down-regulated antiapoptotic Bcl-2 gene in HeLa cancer cell line[J].Biomed Pharmacother, 2017,89:1216-1226.

[2]V erma S,Singh A,Kumari A,et al.Natural polyphenolic inhibitors against the antiapoptotic BCL-2[J].J Recept Signal Transduct Res,2017,3（74）：391-400.

[3]付秀美，鐘美蓉，付文亮，等.絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠血糖和血脂的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2011，3（11）：103-105.

[4]Lee D,Kim KH,Lee J,et al. Protective effect of cirsimaritin against streptozotocin-induced apoptosis in pancreatic beta cells[J].J Pharm Pharmacol,2017,69(7):875-883.

[5]陳香，田浩明.糖尿病胰島β細(xì)胞凋亡病因?qū)W機(jī)制[J].中國(guó)糖尿病雜志，2002，1（03）：175-177.

[6]Zhang Y,Zhao L, Li X,et al. V8,a newly synthetic flavonoid, induces apoptosis through ROS-mediated ER stress pathway in hepatocellular carcinoma[J]. Arch Toxicol, 2014,88(1): 97-107.

[7]Song S, Jacobson KN, McDermott KM, et al. ATP promotes cell survival via regulation of cytosolic [Ca2+]and Bcl-2/Bax ratio in lung cancer cells[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2016, 310(2): C99-114.

[8]Nalluri S, Ghoshal-Gupta S, Kutiyanawalla A, et al. TIMP-1 Inhibits Apoptosisin Lung Adenocarcinoma Cells via Interaction with Bcl-2[J]. PLoS One, 2015, 10(9): e0137673.

[9]李時(shí)珍.本草綱目[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1985.1045-1052.

EFFECTS OF SERICIN ON EXPRESSION OF BCL-2 PROTEIN IN RATS’ INS-1 CELLS

SUN Yi-chan, WANG Dan-dan, LI Dong-zhe, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the e ff ects of sericin on expression of Bcl-2 protein in rats’ INS-1 cells.Methods:INS-1 cells were divided into normal control group, streptozotocin (STZ)-injuried group and sericin-treatment group. The INS-1 cells in normal control group were cultured with complete medium without any medicine; the INS-1 cells in STZ-injuried group were cultured with complete medium containing 10mmol/L STZ; the INS-1 cells in sericin-treatment group were cultured with complete medium containing 10mmol/L STZ and 300μg/ml sericin. Western Blotting was used to detect the expression of Bcl-2 protein in INS-1 cells of each group.Results:Compared with normal control group, the Bcl-2 protein expression in INS-1 cells of STZ-injuried group decreased obviously (P＜0.05). Compared with STZ-injuried group, the Bcl-2 protein expression in INS-1 cells of sericin-treatment group increased obviously (P＜0.05).Conclusions:Sericin may inhibit beta cell apoptosis by up regulating the expression of Bcl-2 protein.

Sericin; INS-1 cells; Bcl-2 protein

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81441133），河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（H2013406096），河北省教育廳青年基金項(xiàng)目（QN20131089），河北省高校重點(diǎn)發(fā)展學(xué)科“人體解剖與組織胚胎學(xué)”建設(shè)項(xiàng)目資助

△ 通訊作者

R587.1

A

1004-6879（2017）06-0453-03

2017-03-20）