不同品系昆蟲病原線蟲對煙草小地老虎的致病力

李 根，許文君，王新中，戶艷霞，冼繼東*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510642；2.云南省煙草公司大理市公司，云南大理671000)

不同品系昆蟲病原線蟲對煙草小地老虎的致病力

李 根1，許文君1，王新中2，戶艷霞2，冼繼東1*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510642；2.云南省煙草公司大理市公司，云南大理671000)

小地老虎AgrotisypsilonRottemberg是煙田的一種重要的地下害蟲。為了探明不同品系的昆蟲線蟲對煙田地下害蟲小地老虎的致病力，在室內(nèi)采用生測試驗(yàn)法，以濾紙為介質(zhì)，測定了斯氏屬線蟲Steinernemacarpocapsae和異小桿屬線蟲Heterorhabditisbacteriophora共5個(gè)品系對小地老虎3齡幼蟲、5齡幼蟲和蛹的致病力。結(jié)果表明，5個(gè)不同昆蟲病原線蟲品系均對小地老虎3齡幼蟲具有致病力，其中斯氏線蟲S.carpocapsae-A11 (Sc-A11)對小地老虎的致死速度最快，侵染24 h、36 h和72 h后小地老虎校正死亡率分別為41.3%、69.7%和86.7%，均高于其它線蟲品系，小地老虎的死亡率隨著線蟲侵染時(shí)間的增加而增加的，至96 h后校正死亡率達(dá)到100%，Sc-A11侵染5齡幼蟲的校正死亡率均高于其它線蟲品系，可見Sc-A11對小地老虎幼蟲的致病力最強(qiáng)，為最敏感的昆蟲病原線蟲品系。Sc-All對小地老虎3齡幼蟲、5齡幼蟲的校正死亡率在72 h時(shí)分別為86.7%、43.3%，化蛹率為23.7%，Sc-All不侵染小地老虎蛹。盆栽煙草上線蟲Sc-A11劑量為20頭IJs/cm2施用3次和線蟲劑量為80頭IJs/cm2施用2次的處理的保苗效果最好，3 d后保苗效果分別為79.64%和76.85%，達(dá)到最佳的防治效果。

小地老虎；昆蟲病原線蟲；生物測定；致病力；煙草

小地老虎AgrotisipsilonRottemberg屬于鱗翅目，夜蛾科，是為害煙草的一種重要的地下害蟲。其1齡和2齡幼蟲常棲息于土表及煙株幼苗心葉，3齡后白天潛伏于煙株根際土層約2 cm處，夜間出土活動(dòng)危害，常將煙苗齊地面咬斷，有時(shí)爬入煙株嫩頭，咬食嫩莖和葉片(謝春鳳等，2013)。小地老虎對移栽后大田煙株的為害極其嚴(yán)重，直接影響產(chǎn)量。由于該蟲幼蟲的生活環(huán)境隱蔽，適應(yīng)能力強(qiáng)，給防治造成了極大的難度。目前在煙草生產(chǎn)上對該蟲的防治仍以化學(xué)防治為主，隨著化學(xué)藥劑使用濃度逐步加大和使用頻率增加，導(dǎo)致小地老虎對多種化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性(于偉麗等，2012)?；瘜W(xué)殺蟲劑的廣泛應(yīng)用不利于害蟲天敵的作用，導(dǎo)致小地老虎和其他害蟲的爆發(fā)，同時(shí)污染環(huán)境，因此，小地老虎的生物防治研究得到了廣泛重視，而在煙草生產(chǎn)上應(yīng)用于小地老虎的生物防治手段并不多見，主要有蘇蕓金桿菌(胡忠如等，2012；高川等，2012)，其次是白僵菌(馮玉元，2009)，而植物源制劑的應(yīng)用只進(jìn)行了初步探討，如茶枯(楊通隆等，2012)、紫莖澤蘭(華勁松等，2014)等。

昆蟲病原線蟲(Entomopathogenic Nematode，EPN)是昆蟲的?；约纳鞌常瑢οx的天敵沒有明顯的負(fù)作用(Bathon, 1996)，其感染期蟲態(tài)(infective juveniles，IJs)在土壤中很活躍，可主動(dòng)且有效地通過害蟲體壁上的自然開口或節(jié)間膜進(jìn)入到寄主體內(nèi)，并釋放共生菌，產(chǎn)生毒素，可在48 h內(nèi)導(dǎo)致寄主死亡(Grewaletal., 2005)，因此，近年來被應(yīng)用于地下害蟲如蠐螬類(錢秀娟等，2005；李俊秀等，2007；許艷麗等，2008；劉樹森等，2010)和地老虎類，包括小地老虎(張應(yīng)剛等，1992；楊健全等，2000；Khattabetal., 2013)、八字老虎(張思佳等，2013)和黃老虎(張安邦等，2015)的防治中。不同線蟲品系對同一寄主的侵染能力不同，由于作物生長環(huán)境的差異，線蟲對不同作物上的寄主侵染力也不一樣(Grewaletal., 2005)。只有針對于不同作物上的小地老虎，篩選出具有高致病力的線蟲品系，才能有效地提高田間的防治效果。在近期的研究中，Ebssa等(2012)的研究表明，斯氏線蟲Steinernemacarpocapsaec對高爾夫球場上小地老虎的防治效果最好，Yan等(2014)報(bào)導(dǎo)了應(yīng)用S.carpocapsaeMex和HeterorhabditisindicaLN2能有效減輕蔬菜地菜心上小地老虎的為害；武海斌等(2015)篩選出S.carpocapsaeNC116品系對玉米地的小地老虎具有較高的致病力，但利用昆蟲病原線蟲防治煙草上小地老虎的研究尚未見報(bào)道。本研究通過室內(nèi)生測試驗(yàn)，測定了不同線蟲品系對煙草上小地老虎不同蟲期的致病力，研究了優(yōu)勢線蟲S.carpocapsae-A11對煙草小地老虎的防治效果，旨在為煙草上地下害蟲的生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小地老虎AgrotisypsilonRottemberg：從煙田中采集小地老虎幼蟲，在室內(nèi)飼養(yǎng)至羽化，將成蟲配對，飼以5%蜜蜂水，使其產(chǎn)卵。孵化的幼蟲由本試驗(yàn)室在溫度25℃±1℃、相對濕度80%±10%下用人工飼料飼養(yǎng)多代，從而獲得試驗(yàn)所需要的蟲源。選擇發(fā)育整齊的3、4、5齡幼蟲備用。

供試線蟲：斯氏屬線蟲Steinernemacarpocapsae有3個(gè)品系，分別為：S.carpocapsae1 (Sc-1)、S.carpocapsaeA11 (Sc-A11)、S.longicaudumX-7 (Sl-X-7)和異小桿屬線蟲Heterorhabditisbacteriophora的2個(gè)品系：H.bacteriophora1 (Hb-1)和H.bacteriophora2 (Hb-2)，由廣東省生物資源應(yīng)用研究所和泰安綠農(nóng)生物科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1不同品系昆蟲病原線蟲對小地老虎幼蟲的致病力測定

在直徑為8.5-14 cm的培養(yǎng)皿中墊一層濾紙，加入適量的水，使濾紙保持濕潤。用200 μL移液槍在體視鏡下吸取線蟲，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入100條線蟲，同時(shí)每培養(yǎng)皿放入小地老虎3齡幼蟲、5齡幼蟲和蛹各10頭，幼蟲可用隔紙板相互隔開，以防互相殘殺，并飼以人工飼料。選取的5個(gè)品系(S.c-A11、H.b-2、S.c-1、H.b-1、X-7)的線蟲作為5個(gè)處理，每處理小地老虎3齡幼蟲、5齡幼蟲和蛹各10頭，以清水作對照。將處理和對照放入相對濕度為80%，溫度為25℃的人工氣候箱。于24 h后每隔24 h檢查小地老虎幼蟲的死亡情況并作記錄。計(jì)算死亡率、校正死亡率、化蛹率，供試蛹在觀察致死同時(shí)記錄羽化情況。本試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.2.2昆蟲病原線蟲防治煙草小地老虎幼蟲盆栽試驗(yàn)

在光溫室條件下，在直徑為21 cm、高19 cm的塑料花盆中裝入17 cm高的土(約1950 g)，將已經(jīng)育好的煙草苗，移栽至花盆中，每盆栽種5株煙苗，在煙草移栽時(shí)同時(shí)將小地老虎接入盆中。每盆埋入供試小地老虎3齡幼蟲10頭。2 d后待小地老虎活動(dòng)正常時(shí)，在以下各處理中接入昆蟲病原線蟲S.carpocapsaeA11。按均勻方法設(shè)計(jì)不同處理：

處理Ⅰ：線蟲劑量5頭IJs/cm2、折合每盆1000頭、施用2次；

處理Ⅱ：線蟲劑量5頭IJs/cm2、折合每盆1000頭、施用3次；

處理Ⅲ：線蟲劑量10頭IJs/cm2、折合每盆2000頭、施用1次；

處理Ⅳ：線蟲劑量20頭IJs/cm2、折合每盆4000頭、施用3次；

處理Ⅴ：線蟲劑量40頭IJs/cm2、折合每盆8000頭、施用1次；

處理Ⅵ：線蟲劑量80頭IJs/cm2、折合每盆16000頭、施用2次；

CK：不接入線蟲，噴灑與處理同量清水。

將線蟲S.carpocapsae-A11懸浮液噴灑土中，并用塑料覆蓋1 d以免水分散失。為保持盆中土壤溫度，每隔3 d補(bǔ)加等量清水。施用的重復(fù)次數(shù)為每隔5 d施用一次。每處理30盆苗，以澆灌清水作為對照，設(shè)3次重復(fù)。兩周后扣盆調(diào)查和統(tǒng)計(jì)防治效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析不同處理項(xiàng)之間的差異顯著性，顯著性水平α=0.05，多重比較采用Duncan's新復(fù)極差法(DMRT)。試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用以下公式計(jì)算：

死亡率(%)=死亡蟲數(shù)/供試總蟲數(shù)×100

校正死亡率(%)=[(處理死亡率-對照死亡率)/(1-對照死亡率)]×100

化蛹率(%)=正常蛹數(shù)/待測總幼蟲數(shù)×100

羽化率(%)=羽化后的蛹?xì)?待測總蛹數(shù)×100

被害苗率(%)=(被害苗數(shù)/調(diào)查苗數(shù))×100

保苗效果(%)=[(對照區(qū)被害率﹣處理區(qū)被害率)/對照區(qū)被害率]×100

蟲口減退率(%)=[(施藥前活蟲數(shù)﹣施藥后活蟲數(shù))/施藥前活蟲數(shù)]×100

防治效果(%)=[(處理區(qū)蟲口減退率﹣對照區(qū)蟲口減退率)/(1-對照區(qū)蟲口減退率)]×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同昆蟲病原線蟲品系對小地老虎幼蟲的致病力

供試的5種昆蟲病原線蟲品系對小地老虎3齡幼蟲、5齡幼蟲和蛹的致病力測定結(jié)果分別見表1-表3。由表1和表2可見，供試的5種昆蟲病原線蟲品系S.carpocapsae1 (Sc-1)、S.carpocapsaeA11 (Sc-A11)、S.longicaudumX-7 (Sl-X-7)、H.bacteriophora-1 (Hb-1)和H.bacteriophora-2 (Hb-2)對小地老虎的侵染力存在著顯明的差異。其中致病力最高的是小卷蛾斯氏線蟲屬的S.carpocapsae-A11，其余依次為S.carpocapse1、長尾斯氏線蟲S.longicaudumX-7、H.bacteriphora1和H.bacteriphora-2，在處理96 h后，小地老虎3齡幼蟲相對應(yīng)的校正死亡百分率分別為100%、87.5%、73.8%、47.3%和41.3%。線蟲品系Sc-A11對小地老虎3齡幼蟲表現(xiàn)出最強(qiáng)的致病力，在處理24 h、48 h、72 h后，小地老虎3齡幼蟲的校正死亡百分率分別為41.3%、69.7%、86.7%，小地老虎的死亡率隨著線蟲侵染時(shí)間的增加而增加的，至96 h后校正死亡率達(dá)到100%，線蟲品系Sc-A11侵染5齡幼蟲于24 h、36 h、72 h、96 h和120 h的校正死亡率分別為43.3%、45.3%、56.7%和74.3%，顯著高于其他線蟲品系。供試的昆蟲病原線蟲對小地老虎不同蟲齡的致病性也有一定的差異，隨著小地老虎齡期的增加，線蟲的侵染力降低。線蟲品系Sc-A11處理72 h后，小地老虎3齡幼蟲和5齡幼蟲的死亡率分別為86.7%和45.3%，處理96 h后，小地老虎3齡幼蟲和5齡幼蟲的死亡率分別為100%和56.7%。由表3可見，供試的5種昆蟲病原線蟲品系均對小地老虎的蛹無侵染能力。由上述研究結(jié)果可選出對小地老虎幼蟲致病力最好的線蟲品系Sc-A11進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表1 不同線蟲品系對小地老虎3齡幼蟲的致病力

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±SD，同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)，下表同。Note: The date in the table are mean±SD, and same lines with different letters indicate significant differences between different treatments (P<0.05), the same below.

表2 不同線蟲品系對小地老虎5齡幼蟲及化蛹的影響

表3 不同線蟲品系對小地老虎成蟲羽化的影響

2.2 優(yōu)勢線蟲品系S. carpsaeocapsae A11對煙草的保苗效果

不同處理下線蟲品系S.carpsaeocapsae-A11對煙苗的保苗效果見表4。由表4可以看出，線蟲的各處理均對小地老虎均有一定的控制作用，其保苗效果依次為處理Ⅳ(劑量為20頭IJs/cm2施用 3次)>處理Ⅵ(劑量為80頭IJs/cm2施用2次)>處理Ⅴ(劑量為40頭IJs/cm2施用1次)>處理Ⅱ(劑量為5頭IJs/cm2施用3次)>處理Ⅰ(劑量為5頭IJs/cm2施用2次)>處理Ⅲ(劑量為10頭IJs/cm2施用1次)。在施用次數(shù)相同時(shí)，施用線蟲劑量越高，保苗效果越好。在施用相同劑量的線蟲時(shí)，施用次數(shù)越多，其保苗效果越好。其中線蟲劑量為20頭IJs/cm2施用3次和線蟲劑量為80頭 IJs/cm2施用2次的處理的保苗效果最好，3 d后保苗效果分別為79.64%和76.85%，7 d后保苗效果分別為85.41%和83.61%。

表4 不同處理下線蟲Steinernema carpocapsae-A11對煙苗的保苗效果

注：IJs，侵染期線蟲幼蟲；表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)，下表同。Note: IJs, Infective juveniles; The date in the table are mean±SD, and same lines with different letters indicate significant differences between different treatments (P<0.05), the same below.

表5 不同處理下線蟲Steinernema carpocapsae A11對煙草小地老虎的防治效果

由表5可見，不同處理下優(yōu)勢線蟲品系S.carpsaeocapsaeA11對小地老虎的防治效果與保苗效果的結(jié)果是一致的。因此，建議在田間施用線蟲防治地下害蟲時(shí)，可以選擇高劑量80頭IJs/cm2施用2次(即一畝地使用量為1億頭)或者線蟲劑量為20頭IJs/cm2施用3次(即1.5畝地線蟲的使用量為1億頭)的施用方法，均可達(dá)到最佳的防治效果。

3 結(jié)論與討論

本研究表明，供試的5種昆蟲病原線蟲品系對煙草小地老虎的致病性存在著差異性。從5種不同昆蟲病原線蟲中篩選出對小地老虎致病性最強(qiáng)的種類為小卷蛾斯氏線蟲屬的S.carpocapsaeA11。同一種線蟲品系對不同齡期的小地老虎的侵染力也有所差異，其中對小地老虎3齡幼蟲的致病力最強(qiáng)，但隨著小地老虎齡期的增加，線蟲S.carpocapsaeA11的致病力下降。武海斌等(2015)從9種線蟲品系中測定中得出斯氏線蟲屬小卷蛾斯氏線蟲S.carpocapsaeNC116品系對小地老虎3齡幼蟲致病力最高，隨著小地老虎幼蟲齡期遞增，其致病力下降。張安邦等(2015)報(bào)道了格氏線蟲S.glaseriib是對黃地老虎致病力最強(qiáng)的昆蟲病原線蟲品系。由此說明，不同品系昆蟲病原線蟲對同一害蟲的防治效果不同。寄主的不同齡期可影響昆蟲病原線蟲的致病力。張思佳等(2013)報(bào)道線蟲品系S.carpocapsae2c對八字地老虎3齡幼蟲的致病力大于5齡幼蟲，且對蛹期不敏感。Fallon等(2004)報(bào)道昆蟲病原線蟲對光肩星天牛Anoplophoraglabripennis(Motschulsky)幼蟲的致病力隨著齡期的增大而下降。許多研究結(jié)果證實(shí)昆蟲病原線蟲不同種、不同品系對同一種害蟲的致死力和侵染力有很大差異，同一種或同一品系的昆蟲病原不同害蟲侵染力也不相同，本研究也獲得相似結(jié)果。因此，篩選致病力強(qiáng)的昆蟲病原線蟲品系是能否應(yīng)用線蟲控制目標(biāo)害蟲的關(guān)鍵(Gaugleretal., 1990; Bathon, 1996; Ebssaetal., 2012)。本研究篩選得出線蟲S.carpocapsaeA11為侵染煙草小地老虎的優(yōu)勢線蟲。

在生產(chǎn)實(shí)踐中，線蟲的施用劑量是影響防治效果的一個(gè)重要因素。劉樹森等(2010)在室內(nèi)測定了嗜菌異小桿線蟲滄州品系在不同侵染劑量下對暗黑鰓金龜幼蟲的致病力，結(jié)果表明，幼蟲的死亡率隨線蟲施用劑量的增加而升高。楊健全等(2000)報(bào)道了不同溫度、不同線蟲劑量對小地老虎侵染力不同，在同一溫度下，線蟲劑量越大，小地老虎的死亡率越高，在田間施用線蟲劑量為40000條/株防治小地老虎時(shí)防治效果可達(dá)68.53%。本研究的盆栽試驗(yàn)也有相似結(jié)果，即在施用次數(shù)相同的情況下，線蟲劑量施用越高，其保苗效果越好。在線蟲劑量為20頭IJs/cm2施用3次和線蟲劑量為80頭IJs/cm2施用2次的處理中，3 d后保苗效果可達(dá)75%以上。在田間應(yīng)用昆蟲病原線蟲防治地下害蟲時(shí)，影響昆蟲病原線蟲致病力的因素是很多的，這些因素往往會(huì)導(dǎo)致田間防治效果較低(李俊秀等，2007；Bélairetal., 2013)，有研究發(fā)現(xiàn)昆蟲病線蟲與生物源殺蟲劑混合可有效提高保苗效果(武海斌等，2015)，因此，在防治煙田地下害蟲時(shí)，可以考慮與其他生物制劑聯(lián)合使用，這方面的研究將會(huì)做進(jìn)一步探討，為利用昆蟲病原線蟲小卷蛾斯氏線蟲S.carpocapsaeAll防治煙草小地老虎提供理論依據(jù)。

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EvaluationofdifferentstrainsentomopathogenicnematodesagainstAgrotisypsilonRottemberg(Lepidoptera,Noctuidae)intobacco

LI Gen1, XU Wen-Jun1, WANG Xin-Zhong2, HU Yan-Xia2, XIAN Ji-Dong1*

(1. College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. Dali Tobacco Company in Yunnan Province, Dali 671000,Yunnan Province, China)

The black cutworm,AgrotisipsilonRottemberg (Lepidoptera, Noctuidae), is one of the most important ground pests which seriously damage on tobacco. In present study, the pathogenicity of 5 species of entomopathogenic nematodes (EPNs) against 3rdinstar larvae, 5thinstar larvae and pupae ofA.ipsilonwere determined withSteinernemacarpocapsaeandHeterorhabditisbacteriophorain the laboratory, respectively. The results showed that 5 species of entomopathogenic nematodes (EPNs) significantly affected the survival rate of 3rdinstar larvae ofA.ipsilon. The infection incubation of EPNS.carpocapsae-A11 (Sc-A11) against 3rdinstar larvae ofA.ipsilonwas the highest. The corrected mortality rates of 3rdinstar larvae ofA.ipsiloninfected by Sc-A11 were 41.3%, 69.7% and 86.7% after 24 h, 36 h and 72 h, respectively, which higher than other EPNs. The mortality rates of 3rdinstar larvae ofA.ipsilonincreased with increase in infection incubation from 24 h to 72 h and corrected mortality rate was 100% after 96 h. The corrected mortality rates of 5thinstar larvae infected by Sc-All were higher than that infected by other ENPs. That was to say, The ENP Sc-All had the highest pathogenicity against larvae ofA.ipsilon. The corrected mortality of 3rdinstar larvae and 5thinstar larvae were 86.7% and 43.3%, the pupation rate ofA.ipsilonwas 23.7% which infected by Sc-All after 72 h, While pupae ofA.ipsilonwas not infected by EPN Sc-All. The pot experiment showed that protection efficiency for tobacco of Sc-A11 was the best which used 20 IJs/cm2applied 3 times and 80 IJs/cm2applied 2 times. The survival rates of tobacco were 79.64% and 76.85% after 3 d, which showed the best control efficiency.

Agrotisipsilon; entomopathogenic Nematodes; bioassay; pathogenicity; tobacco

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Q968.1;S476

A

1674-0858(2017)05-1025-07

中國煙草總公司云南省公司科技計(jì)劃項(xiàng)目專項(xiàng)(2014YN29)

李根，男，1992年生，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向?yàn)楹οx生物防治，E-mail：l1119g@163.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: jdxian@scau.edu.cn

Received: 2017-06-14; 接受日期Accepted: 2017-08-30