抗青枯內(nèi)生細(xì)菌的篩選及其對煙草青枯病的防治效果

姜乾坤，彭 閣，王 瑞，譚 軍，邸慧慧，向必坤，趙秀云，彭五星，董善余

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；2.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000；3.湖北省煙草公司恩施州公司宣恩縣煙葉分公司，湖北 宣恩 445500；4.湖北省煙草公司宜昌市公司 湖北 宜昌 443000）

抗青枯內(nèi)生細(xì)菌的篩選及其對煙草青枯病的防治效果

姜乾坤1，彭 閣1，王 瑞2，譚 軍2，邸慧慧2，向必坤2，趙秀云1，彭五星3*，董善余4

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；2.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000；3.湖北省煙草公司恩施州公司宣恩縣煙葉分公司，湖北 宣恩 445500；4.湖北省煙草公司宜昌市公司 湖北 宜昌 443000）

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌引起的一種土傳細(xì)菌性煙草病害，主要危害煙草的根莖，嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量。從青枯病發(fā)病田健康煙株分離內(nèi)生細(xì)菌55個，通過平板拮抗實(shí)驗(yàn)篩選，R-3、R-7、R-9菌株對青枯雷爾氏菌有明顯的拮抗作用。gyrB基因序列分析表明，R-3、R-7、R-9均為貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）。3個菌株的發(fā)酵液經(jīng)115 ℃高溫處理均能保持對青枯雷爾氏菌的抑制活性，說明 3株貝萊斯芽胞桿菌可產(chǎn)生耐高溫的抑菌物質(zhì)。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，R-3、R-7和R-9均可長期定殖于煙草根和莖中，對青枯病的防治效果分別為55.72%、48.34%和50.71%。

煙草青枯??；植物內(nèi)生菌；貝萊斯芽胞桿菌；定殖能力；防治效果

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種土傳細(xì)菌性煙草病害，是典型的維管束病害，主要危害煙草的根、莖。1864年在印度尼西亞首先報道了青枯病對煙草的毀滅性危害，此后迅速蔓延至主要產(chǎn)煙國家[1]。該病是熱帶、亞熱帶煙區(qū)的主要病害，在我國南方普遍發(fā)生，近幾年有從南向北蔓延之勢，已成為煙葉生產(chǎn)的毀滅性災(zāi)害[2]。

目前，煙草青枯病的防治研究已是最熱門課題之一，防治方法一般分為農(nóng)業(yè)防治、選育和栽培高抗品種、化學(xué)防治、生物防治等[3]。在我國，化學(xué)防治仍是控制煙草青枯病的主要技術(shù)手段。生物防治具有經(jīng)濟(jì)、安全無公害、長效等特點(diǎn)，是防治煙草青枯病研究的熱門方向，但是生物防治起步晚，生物資源匱乏，在田間防效顯著的菌株報道也有不少，但青枯病仍較為嚴(yán)重，很難徹底根除。1992年，KLOEPPER等[4]首次提出“植物內(nèi)生菌”的概念，植物內(nèi)生菌是生活史的一定階段或者全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌或者細(xì)菌。植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)除了在生物防治中應(yīng)用外，還可作為外源基因載體及新藥的來源，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力[5]。利用植物內(nèi)生菌防治植物病害是生物防治的重要方法，內(nèi)生菌和病原菌具有相同的生態(tài)位，相互競爭空間和營養(yǎng)，使病原菌缺乏營養(yǎng)而死亡，從而達(dá)到抵御病害的目的[6]。

本研究從發(fā)病煙區(qū)的健康煙株中分離篩選出對青枯雷爾氏菌有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，并進(jìn)行了分子鑒定和田間試驗(yàn)，為煙草青枯病的生物防治提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：青枯雷爾氏菌分離自發(fā)病的煙株。

培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%），發(fā)酵培養(yǎng)基（小麥粉1%，豆粕粉1%，K2HPO40.5%，pH 7.0）。

1.2 內(nèi)生細(xì)菌的分離純化

試驗(yàn)于2016年5—9月在湖北恩施市城郊煙草基地從云煙 87青枯病發(fā)病煙田中挑選健康煙株，分離根、莖、葉中的內(nèi)生細(xì)菌。分別稱取0.5 g的根、莖、葉進(jìn)行表面消毒，75%乙醇10～30 s，無菌水沖洗2次，0.1%升汞1～3 min，無菌水沖洗3次[7]，然后，加入5 mL無菌水研磨充分，稀釋10倍涂布于LB平板，于37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取菌落形態(tài)不同的細(xì)菌分離純化，將純化菌株-20 ℃甘油管保存。

1.3 篩選拮抗青枯雷爾氏菌的內(nèi)生菌

1.3.1 拮抗細(xì)菌初篩 接種青枯雷爾氏菌于LB中，37 ℃，180 r/min，過夜培養(yǎng)，稀釋10倍后，均勻噴灑于LB平板上。挑取37 ℃培養(yǎng)24 h的內(nèi)生菌單菌落點(diǎn)接于平板上，每個平板共測試 4個菌株，每個菌株重復(fù)3次，37 ℃培養(yǎng)48 h，篩選產(chǎn)生抑菌圈的菌株。

1.3.2 拮抗細(xì)菌的復(fù)測 選取有抗菌活性的菌株，接種LB中，28 ℃，180 r/min，培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，取上清液115 ℃滅菌10 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。將青枯雷爾氏菌均勻噴灑于LB平板上。平板上放置4個無菌濾紙片，每個濾紙片加10 μL發(fā)酵液，37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察有無抑菌圈產(chǎn)生。

1.4 拮抗細(xì)菌gyrB基因序列分析鑒定

gyrB基因擴(kuò)增引物和反應(yīng)條件參考 SATOSHI等方法[8]。將gyrB基因擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測序，通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，采用MEGA5.2軟件構(gòu)建拮抗菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 拮抗細(xì)菌定殖能力鑒定

1.5.1 抗利福平的拮抗細(xì)菌的誘變 在LB固體培養(yǎng)基中加入2 μg/mL利福平，取100 μL菌液涂布，37 ℃培養(yǎng)2～4 d，待菌落生長后，挑選單菌落轉(zhuǎn)移至5 μg/mL的利福平抗性平板上，經(jīng)培養(yǎng)后篩選抗性菌落。逐步提高利福平的濃度分別至10、20、40、60 μg/mL，最后獲得抗60 μg/mL利福平菌株。將抗性菌株在添加60 μg/mL利福平的LB平板上連續(xù)傳代3～5次，穩(wěn)定抗性菌株的抗性。檢測利福平抗性菌株對青枯雷爾氏菌的拮抗能力，選擇抗菌活性與出發(fā)菌株相似的抗性菌株用于定殖研究。

1.5.2 拮抗細(xì)菌在煙草體內(nèi)的定殖試驗(yàn) 按 1%接種抗利福平的拮抗菌株于LB中，37 ℃，180 r/min發(fā)酵48 h。煙草移栽7 d后每棵苗灌溉50 mL發(fā)酵液，每個菌處理18棵煙株，每6棵煙株為1組，3組平行試驗(yàn)，以灌溉50 mL水的煙株作為對照組。分別在7，14，21，28，45，60 d后，檢測煙草根和莖中拮抗細(xì)菌的濃度：清洗煙草根表面的根際土，晾干表面水分，稱取0.5 g根和莖，對根和莖進(jìn)行表面消毒，方法同上。加入5 mL無菌水研磨充分，研磨液稀釋 10倍、100倍，取100 μL涂布于 60 μg/mL利福平LB平板，37 ℃培養(yǎng)48 h，記錄菌落數(shù)，重復(fù)3次，計(jì)算每克根、莖中拮抗細(xì)菌的含量：每克根（莖）中拮抗細(xì)菌含量=平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×（無菌水質(zhì)量+根（莖）質(zhì)量）×10/根（莖）質(zhì)量。備注：1 mL無菌水質(zhì)量為1 g。

1.6 田間試驗(yàn)

選取定殖能力好的拮抗菌株，按1%接種于2.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min發(fā)酵48 h，稀釋10倍，澆灌于田間煙株根圍土壤中。每個小區(qū)100株煙草，2個月后進(jìn)行病情調(diào)查。分別以4%春雷霉素和清水澆灌煙株作為藥劑對照和空白對照。每個處理設(shè)置3個小區(qū)。青枯病的病情指數(shù)按照中華人民共和國煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)煙草病害分級及調(diào)查方法調(diào)查，發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果按下式計(jì)算：

發(fā)病率=發(fā)病植株/調(diào)查植株總數(shù)×100%

病情指數(shù)=Σ[(病情級數(shù)×此級株數(shù))/(最高級數(shù)×總株數(shù))]×100

防治效果（%）=(對照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對照組病情指數(shù)×100。

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)生菌株的分離純化

從煙草體內(nèi)共分離出 55株內(nèi)生細(xì)菌，葉中分離出22株，根中22株，莖中11株。根和葉中內(nèi)生細(xì)菌比較多，莖中相對較少。

2.2 拮抗內(nèi)生細(xì)菌的初篩

從55株內(nèi)生細(xì)菌中，共篩選出3株拮抗細(xì)菌，分別為R-3，R-7和R-9，均來自煙草根中，對青枯雷爾氏菌有明顯的抗菌活性（圖1）。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物的拮抗效果

復(fù)測結(jié)果表明，高溫處理后的 R-3、R-7、R-9發(fā)酵液對青枯雷爾氏菌仍有明顯的拮抗作用，其中，R-3和R-9發(fā)酵液的抗菌活性高于R-7菌株（圖2）。表明3個菌株可產(chǎn)生耐高溫的抗菌活性物質(zhì)。

2.4 拮抗細(xì)菌gyrB基因序列分析及分子鑒定

以 3株拮抗細(xì)菌的基因組為模板，擴(kuò)增 gyrB基因，得到大小為1300 bp左右的條帶，與芽胞桿菌gyrB理論值相符。測序結(jié)果與GeneBank中已知序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。對系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果進(jìn)行分析，R-3，R-7，R-9鑒定為貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）。

圖1 拮抗細(xì)菌對青枯雷爾氏菌的抑菌效果Fig. 1 Antagonistic effects of antagonistic bacteria against Ralstonia solanacearum

圖2 拮抗細(xì)菌發(fā)酵液對青枯雷爾氏菌的抑菌效果Fig. 2 Antagonistic effects of liquid fermentation of antagonistic bacteria against Ralstonia solanacearum

圖3 根據(jù)gyrB基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree constructed by gyrB gene sequences

2.5 拮抗細(xì)菌定殖能力鑒定

2.5.1 抗利福平拮抗細(xì)菌的誘變 通過逐步提高利福平濃度的方法，獲得抗高濃度利福平（60 μg/mL）的抗性菌株。和野生型相比，利福平抗性菌株的菌落形態(tài)與野生菌相似，且對青枯雷爾氏菌有較強(qiáng)的拮抗作用（圖4）。

圖4 抗利福平拮抗細(xì)菌對青枯雷爾氏菌的抑菌效果Fig. 4 Antagonistic effects of rifampicin resistant bacteria against Ralstonia solanacearum

2.5.2 拮抗細(xì)菌定殖試驗(yàn) 分別培養(yǎng) 3株抗利福平的拮抗菌株，將發(fā)酵液接種煙草苗。于不同時間點(diǎn)，檢測煙草根和莖中拮抗細(xì)菌的濃度（圖 5，圖6）；而對照組在利福平抗性平板上未檢測到細(xì)菌的生長。結(jié)果表明，R-3、R-7、R-9菌株可經(jīng)過灌根處理進(jìn)入煙草根中，并轉(zhuǎn)移至莖中，具有良好的定殖能力和轉(zhuǎn)導(dǎo)能力；3個菌株在煙草根組織的定殖能力高于莖組織。3個菌株的定殖能力依次是R-3 ＞R-7 ＞ R-9。在煙草根中，在14 d內(nèi)R-3、R-7的濃度逐漸增加，在14 d濃度達(dá)到最高，分別為8.83×106cfu/g、5.96×106cfu/g，之后開始逐漸降低，28 d后趨于平穩(wěn)；而R-9菌株波動比較大，整體呈下降趨勢，在7 d濃度最高為1.24×106cfu/g（圖5）。在煙草莖中，R-3在21 d內(nèi)逐漸下降，之后趨于平穩(wěn)，7 d時濃度最高為8.63×105cfu/g；而R-7在21 d內(nèi)有上升趨勢，之后略微下降，最后趨于平穩(wěn)，在21 d時濃度最高為2.1×105cfu/g；R-9在14 d內(nèi)濃度逐漸上升，之后開始下降，且變化幅度較大，在14 d時濃度最高為2.66×105cfu/g（圖6）。

2.6 拮抗細(xì)菌對煙草青枯病的防治效果

從表1可見，貝萊斯芽胞桿菌R-3、R-7、R-9對煙草青枯病均有防治效果，其中R-3菌株的防治效果最好，防效為55.72%，3個菌株的防治效果均明顯（p ＜0.05）高于春雷霉素，表明其防治效果優(yōu)于抗生素，3株內(nèi)生拮抗細(xì)菌在防治煙草青枯病上具有很大的潛力。

圖5 不同時間煙草根中拮抗細(xì)菌的濃度Fig. 5 The concentration of antagonistic bacteria in tobacco root at different time points

圖6 不同時間煙草莖中拮抗細(xì)菌的濃度Fig. 6 The concentration of antagonistic bacteria in tobacco stem at different time points

表1 拮抗細(xì)菌對煙草青枯病的防效Table 1 Control efficacy of antagonistic bacteria to tobacco bacterial wilt

3 討 論

傳統(tǒng)的生防菌種大多來自土壤，從土壤中篩選出的拮抗細(xì)菌通過抑制土傳病原菌的繁殖達(dá)到防病的效果，對寄生在植物維管束的病原菌（如青枯雷爾氏菌）雖然有一定的防治效果但很難從根本上進(jìn)行防治。內(nèi)生拮抗細(xì)菌能進(jìn)入植物組織，與病原菌競爭空間與營養(yǎng)，可在植物內(nèi)部抑制病原菌的繁殖，能更好地防治病原菌，較傳統(tǒng)的土壤細(xì)菌更有優(yōu)勢，且有報道一些內(nèi)生細(xì)菌能促進(jìn)植物的生長[9]。因此，內(nèi)生拮抗細(xì)菌逐漸成為防治植物病害的一個重要菌種資源。例如，BEN ABDALLAH等[10]從銀葉茄（Solanum elaeagnifolium）中分離出2株芽胞桿菌SV101、SV104，可成功定殖于番茄中，防治番茄枯萎病，并促進(jìn)番茄生長。SOARES等[11]從常春藤中分離出一株解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens）C6c，能抑制病原菌極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima），同時還能促進(jìn)植物生長。本研究從發(fā)病煙區(qū)中健康煙株根、莖、葉中分離55株內(nèi)生細(xì)菌，具有拮抗作用的細(xì)菌均來自根部，顯然根部是拮抗細(xì)菌預(yù)防青枯雷爾氏菌入侵煙草的重要場所，但具體的抗病機(jī)理仍需進(jìn)一步探索。除了根、莖、葉中有內(nèi)生菌，也有報道從植物種子中分離出內(nèi)生菌。周崗泉等[12]從煙草種子中分離出對青枯雷爾氏菌有拮抗作用的細(xì)菌，部分菌株前期防治效果高達(dá)95%以上，同時證明內(nèi)生菌可促進(jìn)煙草種子的萌發(fā)。

在生物防治中，芽胞桿菌是大家所青睞的菌株。芽胞桿菌是一類好氧和兼性厭氧、產(chǎn)生抗逆性強(qiáng)的內(nèi)生孢子的桿狀細(xì)菌，而且具有易培養(yǎng)、易保存、有效期長等特點(diǎn)[13]。芽胞桿菌是土壤和植物微生態(tài)中的優(yōu)勢微生物種群，具有較強(qiáng)的抗菌防病能力，許多優(yōu)良的菌株已成功應(yīng)用于植物病害的防治。許大風(fēng)等[14]從青枯病發(fā)病煙田中健康煙株根際土中篩選出6株對青枯病有較強(qiáng)拮抗作用的菌株，其中XC4抑菌活性較強(qiáng)且效果穩(wěn)定，通過發(fā)酵優(yōu)化XC4菌株抑菌效果提高了72%。夏艷等[15]從煙田中分離出2株解淀粉芽胞桿菌和1株甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌，對青枯病的防效均達(dá)到60%以上。本試驗(yàn)從生防角度出發(fā)，從煙草根中分離出的3株拮抗細(xì)菌，經(jīng)gyrB基因序列鑒定為貝萊斯芽胞桿菌（B. velezensis）。MENG等[16]發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽胞桿菌BAC03對馬鈴薯瘡痂病菌（Streptomyces scabies）有較強(qiáng)的拮抗作用，且能促進(jìn)植物的生長，以及產(chǎn)生吲哚-3-乙酸、氨等活性物質(zhì)。LIU等[17]從海洋中分離的貝萊斯芽胞桿菌H3能產(chǎn)出表面活性素，對多種細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、分支桿菌、肺炎克雷伯菌、綠膿假單胞桿菌等）具有明顯的抗菌活性。目前，尚未見報道該類芽胞桿菌對煙草青枯病的防治效果。

3株芽胞桿菌防治青枯病的機(jī)理目前尚不清楚，有可能和它產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)有關(guān)。芽胞桿菌屬是一類重要的植物病原菌拮抗菌，易于定向分離，可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)包括多肽類、脂肽類、蛋白類等，是自然界廣泛存在的非致病菌[18-19]。王靜等[20]對青枯病生防菌株芽胞桿菌 SH7產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)進(jìn)行了粗提，該物質(zhì)可以被硫酸銨沉淀，初步鑒定為蛋白類物質(zhì)。本試驗(yàn)篩選的3株內(nèi)生拮抗細(xì)菌的發(fā)酵液經(jīng)115 ℃滅菌后仍具有抗菌活性，推測拮抗細(xì)菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)是其防治青枯病的主要機(jī)制，而且這種物質(zhì)耐高溫，這有待于進(jìn)一步的研究。另外內(nèi)生菌的定殖能力也是防止病原菌入侵的重要因素，內(nèi)生菌定殖能力越強(qiáng)，其在植物體內(nèi)繁殖后，能更好地競爭空間和營養(yǎng)，從而抑制病原菌的生長，達(dá)到防治的目的。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)篩選的3株拮抗內(nèi)生細(xì)菌對煙草青枯病有較好的防效，產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)耐高溫，有良好的應(yīng)用前景。內(nèi)生菌株在煙株體內(nèi)的定殖能力越強(qiáng)（如 R-3菌株），其田間防治效果越好，表明內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)的定殖能力與其防病效果密切相關(guān)。今后將圍繞3個內(nèi)生菌株的生防機(jī)制及其抑菌物質(zhì)的分離純化、發(fā)酵工藝進(jìn)行深入研究。

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Selection of Endophytic Antagonistic Bacteria for Control of Tobacco Bacterial Wilt

JIANG Qiankun1, PENG Ge1, WANG Rui2, TAN Jun2, DI Huihui2, XIANG Bikun2,ZHAO Xiuyun1, PENG Wuxing3*, DONG Shanyu4

(1. College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. Enshi Tobacco Company of Hubei Province, Enshi, Hubei 445000, China; 3. Xuan’en Tobacco Company of Enshi Tobacco Company, Xuan’en, Hubei 445500,China; 4. Yichang Tobacco Company of Hubei Province, Yichang, Hubei 443000, China)

Tobacco bacterial wilt is a soil-borne bacterial disease caused by Ralstonia solanacearum, which is mainly harmful to the roots and stems of tobacco and seriously affects tobacco yield. Fifty-five endophytic bacterial strains were isolated from healthy tobacco planted in diseased soils. Among them, strains R-3, R-7 and R-9 had obvious antagonistic effects on R. solanacearum in plate antagonistic experiments. Based on gyrB gene sequence, R-3, R-7 and R-9 all belong to Bacillus velezensis. After heated at 115 ℃, the liquid fermentation of the 3 strains still had antibacterial activities, indicating that these strains produced heat resistant substances. Field experiments showed that R-3, R-7 and R-9 were all able to chronically colonize in the root and stem of tobacco,and their control efficiency against bacterial wilt were 55.72%, 48.34% and 50.71%, respectively.

tobacco bacterial wilt; plant endophytic bacteria; bacillus velezensis; colonization; control efficiency

S435.72

1007-5119（2017）05-0013-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.05.003

中國煙草總公司科技重點(diǎn)項(xiàng)目“基于宏基因組學(xué)的植煙土壤健康評價研究與應(yīng)用”（110201402016）

姜乾坤（1989-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸镛r(nóng)藥。E-mail：1522568857@qq.com。*通信作者，E-mail：365850331@qq.com

2016-11-01

2017-01-09