貴州烤煙糖苷類化學(xué)成分抗氧化活性及分離鑒定

丁根勝，葛永輝，楊 超，李永青，王承福，黃新民，黃正虹，楊盛剛，萬里興，惠建權(quán)，耿召良*

（1.貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，貴陽 550009；2.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽 550081；3.云南中醫(yī)學(xué)院，昆明 650500）

貴州烤煙糖苷類化學(xué)成分抗氧化活性及分離鑒定

丁根勝1，葛永輝2，楊 超1，李永青1，王承福3，黃新民1，黃正虹1，楊盛剛1，萬里興1，惠建權(quán)1，耿召良2*

（1.貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，貴陽 550009；2.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽 550081；3.云南中醫(yī)學(xué)院，昆明 650500）

為深入研究煙草糖苷類化學(xué)成分及其抗氧化活性，以貴州烤煙為材料，首先用有機(jī)溶劑甲醇回流提取和大孔樹脂吸附法獲得糖苷類化學(xué)成分粗提物，對糖苷粗提物不同溶劑萃取物的清除DPPH自由基活性進(jìn)行研究，再應(yīng)用反相色譜、凝膠色譜、半制備液相色譜及薄層層析等技術(shù)，對清除自由基活性最好的組分進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。結(jié)果表明，糖苷粗提物不同溶劑萃取物均表現(xiàn)一定的清除 DPPH自由基活性，其中乙酸乙酯部分活性最好。從乙酸乙酯部分分離獲得了多個糖苷類單體，并利用核磁共振儀對其中4個單體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，分別為7,8-二氫-3-氧代-α-紫羅蘭醇-β-D-吡喃葡萄糖苷（化合物1），3-氧代-α-紫羅蘭醇-β-D-吡喃葡萄糖苷（化合物2），異嗪皮啶6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（化合物3），東莨菪苷（化合物4）。

煙草；糖苷；分離純化；DPPH；結(jié)構(gòu)鑒定

糖苷是煙草中重要的潛香物質(zhì)[1-3]，由單糖或低聚糖的半縮醛羥基和另一分子中的羥基、氨基、硫羥基等失水而產(chǎn)生的化合物。煙草糖苷不具有明顯的揮發(fā)性和香味特征，但在經(jīng)過高溫加熱或燃燒時釋放香氣香味，是影響煙葉香氣的重要因素[4-8]。因分離難度大，難以獲得單體化合物，煙草中糖苷類物質(zhì)一直是研究的重點和難點。從煙草中分離鑒定糖苷類香氣前體的工作已經(jīng)開展了一些，主要集中在20世紀(jì)70年代中期至80年代初，其單體結(jié)構(gòu)的分離鑒定也為煙草香氣的形成機(jī)理提供了新見解。此外，在多種植物化學(xué)成分的研究中，很早就發(fā)現(xiàn)糖苷類成分具有較好的體外抗氧化活性[9-12]，但煙草糖苷類成分的抗氧化活性鮮有研究。確定煙草糖苷類等成分的清除自由基能力和抗氧化活性，對于降低卷煙的危害性具有一定的現(xiàn)實意義。本研究采用天然產(chǎn)物分離方法，通過測定煙草粗糖苷不同極性萃取物對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）的清除能力來評估其抗氧化活性，并對活性較好部分進(jìn)行系統(tǒng)分離鑒定，為煙草糖苷抗氧化活性研究及煙草綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Inova400核磁共振儀，TMS內(nèi)標(biāo)；ESI-MS由Waters Xevo-QTOF質(zhì)譜儀測定；柱色譜硅膠和薄層色譜硅膠（青島海洋化工廠）；反相材料 RP-18（40～63 μm）（Merck）；Amberlite XAD-2 大孔吸附樹脂（Sigma）；凝膠柱填料為 Sephadex LH-20（25～100 μm）（Amersham Biosciences）；半制備液相色譜（Waters 1525型），流動相為甲醇：去離子水； UV-2501PC紫外可見分光光度計（日本SHIMADZU）；XT-4雙目顯微熔點測定儀（北京泰克儀器有限公司）；化學(xué)試劑均為分析純，半制備系統(tǒng)采用色譜純級別（Merck）；糖苷顯色劑為5% α-萘酚甲醇溶液；維生素C（VC，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；DPPH（上海麥克林公司）。煙葉材料：煙葉均為貴州產(chǎn)區(qū)烤煙。

1.2 方法

1.2.1 提取樣品的制備 取烤煙煙葉2.2 kg，粉碎至20～40目，加入3倍重量的95%乙醇溶液，加熱回流提取3次，每次4 h，合并提取液后濃縮蒸干，加適量甲醇溶解，趁熱抽濾得到深紅色液體，濾液再次減壓濃縮，得浸膏436 g。浸膏加水懸濁，用石油醚多次萃取，合并萃取液并減壓濃縮，得石油醚萃取層27.25 g，計算得率為6.25%。再依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得乙酸乙酯萃取層28.14 g和正丁醇萃取層 70.85 g，得率依次為 6.45%和16.25%，收集水層。

1.2.2 粗糖苷成分的富集及檢測 乙酸乙酯部分溶液通過Amberlite XAD-2大孔樹脂柱，依次用去離子水和不同濃度乙醇水溶劑逐級洗脫，收集中間段洗脫物，減壓蒸干，通過薄層層析（TLC）檢測，經(jīng)α-萘酚濃硫酸溶液噴灑后加熱顯色反應(yīng)，檢測出含有糖苷成分的粗分段組分，合并相似組分得糖苷類粗成分。

1.2.3 抗氧化活性研究 抗氧化活性檢測參考文獻(xiàn)[13]方法。（1）DPPH儲備液的配制：準(zhǔn)確稱取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）0.078 g，用無水乙醇溶解定容至100 mL棕色容量瓶中，搖勻，得濃度為2.0 mmol/L母液，4 ℃保存?zhèn)溆谩＃?）VC溶液的配制：準(zhǔn)確稱取 VC 0.25 g，水溶解得母液濃度2.5mg/mL，分別取母液 0.01、0.02、0.03、0.05、0.08、0.10和0.15 mL定容至25 mL容量瓶中，得濃度梯度 0.001、0.002、0.003、0.005、0.008、0.010和 0.015 mg/L溶液，室溫放置備用。（3）供試品溶液配制：將各萃取層浸膏用無水乙醇溶解，按一定濃度梯度依次稀釋備用。（4）自由基清除率測定方法：參照文獻(xiàn)[13]方法，取2 mL不同濃度供試品溶液與2 mL濃度為0.2 mmol/L DPPH溶液加入比色管中，混勻后室溫避光放置30 min，于517 nm處測定吸光度值（A值），平行測定3次，以VC為陽性對照。利用DPPH溶液的特征紫紅色基團(tuán)的吸收，用紫外-可見分光光度法測定反應(yīng)后的供試溶液在517 nm吸收的下降程度，表示其對有機(jī)自由基的清除能力。按照公式和回歸方程分別計算自由基清除率和半數(shù)清除率（IC50）。

DPPH清除率＝1-(Ai-Aj)/A0

Ai為樣品+DPPH吸光度的平均值；Aj為樣品溶液吸光度的平均值；A0為DPPH吸光度的平均值。

1.2.4 化合物分離與富集 取煙草乙醇提取物中乙酸乙酯萃取段浸膏（28.14 g）用Amberlite XAD-2大孔樹脂柱色譜粗分，經(jīng)水-乙醇（1∶0～0∶1，V∶V）梯度洗脫，TLC檢測分段為9個部分（Fr.1～9），將其中的Fr.2段通過凝膠柱（LH-20）層析后，進(jìn)樣至半制備色譜系統(tǒng)中進(jìn)行分離，在流動相為37%甲醇-水溶劑條件下，保留時間為12 min時獲得化合物1（34 mg）；Fr.5段通過RP-18反相硅膠柱層析，流動相為甲醇-水（1∶9～10∶0，V∶V），通過TLC檢測合并后分段為6段（PE.1～6），其中PE.3部分經(jīng)過凝膠柱（LH-20）層析后，經(jīng)過HPLC系統(tǒng)分離，在37%乙腈-水流動相條件下，在保留時間為12 min和14 min分別獲得化合物2（36 mg）和3（41 mg）；Fr.6段通過正相硅膠柱層析（流動相為石油醚-丙酮5∶1，V∶V）后，TLC檢測含有糖苷類物質(zhì)的樣品段，進(jìn)樣至半制備色譜系統(tǒng)中進(jìn)行分離，在流動相為19%乙腈-水溶劑條件下，保留時間為9 min時獲得化合物4（24 mg）。

1.2.5 結(jié)構(gòu)鑒定 分別采用電噴霧質(zhì)譜（ESI/MS）和核磁共振（1H NMR和13C NMR）對分離產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。1H NMR的核磁共振頻率為400 MHz，13C NMR的核磁共振頻率為100 MHz，以DMSO-d6為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1 烤煙粗提物不同萃取層抗氧化活性

以樣品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)，繪制曲線如圖1，并計算IC50值（表1）。

抗氧化活性測定結(jié)果表明（圖1），煙葉浸膏不同極性溶劑萃取層均具有一定抗氧化活性，抗氧化活性由強(qiáng)到弱為：乙酸乙酯萃取層＞正丁醇萃取層＞水層＞石油醚萃取層。其 IC50值由大到小為：石油醚萃取層＞水層＞正丁醇萃取層＞乙酸乙酯萃取層。IC50值越小說明其抗氧化性越強(qiáng)，后續(xù)單體化合物分離試驗選取抗氧化活性最好的乙酸乙酯萃取層為材料進(jìn)行活性物質(zhì)的分離純化。

2.2 糖苷成分結(jié)構(gòu)鑒定

經(jīng)柱層析及半制備色譜系統(tǒng)分離，從煙草乙醇提取物中乙酸乙酯萃取段浸膏獲得多個糖苷單體化合物，對其中4個單體進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。結(jié)果表明，化合物 1:白色粉末（甲醇:水溶劑），mp.375～378 ℃。TOF-MS FD+:m/z (%):372，分子式為C19H32O7。不飽和度為5。易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，不溶于石油醚、乙醚。α-萘酚-濃硫酸溶液噴灑后加熱顯色反應(yīng)呈紫紅色斑點。1HNMR [MeOD，400 MHz]：δH5.80（1H，s，H-4），5.71（1H，dd，J=16，6.4Hz，H-7），5.67（1H，d，J=16，6.4Hz，H-8），4.29（1H，d，H-2'），4.19（1 H，d，J=7.6 Hz，H-1’），3.60（2H，m，H-6'），3.12（1H，m，H-9），3.10-3.01（3H，m，H-4'，H-S'，H-3'），2.62（1H，dd，J=8.8 Hz，H-6），2.38（1H，s，H-2），2.07（1H，s，H-2），1.85（3H，s，H-10），1.20（3H，d，J=6.4 Hz，H-13），0.95（6H，dd，J=15.2 Hz，H-11，H-12）；13CNMR[MeOD，100 MHz]：δC20.2（CH3，C-13），22.4（CH3，C-10），26.3（CH3，C-11），26.9（CH3，C-12），35.1（C-1），46.7（CH2，C-2），53.9（CH，C-6），60.6（CH2，C-6'），69.3（CH，C-4'），73.1（CH，C-3'），74.1（CH，C-2'），76.2（CH，C-9），76.3（C-3），100.3（CH，C-1'），123.8（CH，C-4），126.6（CH，C-8），136.1（CH，C-7），169.7（C-5），200.6（C=O，C-3）。

表1 各烤煙粗提樣品對DPPH自由基的IC50檢測結(jié)果Table 1 Scavenging IC50 of each sample on DPPH free radical

圖1 各樣品對DPPH自由基清除力隨質(zhì)量濃度變化曲線Fig. 1 DPPH scavenging curves of each sample with change of concentrations

以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的 7,8-dihyd-3-oxo-αionol-β-D-glucopyranoside 基本一致[14]，可以判斷該化合物為 7,8-二氫-3-氧代-α-紫羅蘭醇-β-D-吡喃葡萄糖苷，其結(jié)構(gòu)式如圖2。

圖2 化合物1的化學(xué)式結(jié)構(gòu)Fig. 2 The structure of compound 1

化合物2，白色粉末（丙酮溶劑），mp. 398～402℃。TOF-MS FD+:m/z(%): 370，分子式為C19H30O7，不飽和度為 5。易溶于甲醇、乙醇、丙酮，不溶于石油醚、乙醚。α-萘酚-濃硫酸溶液噴灑后加熱顯色反應(yīng)呈紫紅色斑點。1HNMR [MeOD，400 MHz]：δH5.73（1H，s，H-4），5.62（1H，d，J=16，6.4Hz，H-7），5.54（1H，d，J=16，6.4Hz，H-8），4.18（1H，d，H-2’），4.19（1H，d，J=7.6Hz，H-1’），3.60（2H，m，H-6’），3.12（1H，m，H-9），3.10-3.01（3H，m，H-4’，H-5’，H-3’），2.62（1H，d，J=8.8Hz，H-6），2.38（1H，s，H-2），2.07（1H，s，H-2），1.85（3H，s，H-10），1.20（3H，dd，J=6.4Hz，H-13），0.95（6H，dd，J=15.2Hz，H-11，H-12）；13CNMR[MeOD，100MHz]：δC20.3（CH3，C-13），22.2（CH3，C-10），26.1（CH3，C-11），26.8（CH3，C-12），35.2（C-1），46.5（CH2，C-2），54.0（CH，C-6），60.2（CH2，C-6’），69.3（CH，C-4’），73.0（CH，C-3’），74.1（CH，C-2’），76.3（CH，C-9），76.2（C-3），100.1（CH，C-1’），123.7（CH，C-4），126.6（CH，C-8），136.1（CH，C-7），161.5（C-5），197.0（C=O，C-3）。

以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的 3-oxo-α-ionol-β-D-glucopyranosid基本一致[14-16]，可以判斷該化合物為3-氧代-α-紫羅蘭醇-β-D-吡喃葡萄糖苷。其結(jié)構(gòu)式如圖3。

圖3 化合物2的化學(xué)式結(jié)構(gòu)Fig. 3 The structure of compound 2

化合物3，白色粉末（甲醇溶劑），mp.267～270℃。TOF-MS FD+:m/z(%): 370，分子式為C16H18O10，不飽和度為 9。易溶于甲醇、乙醇，不溶于石油醚、乙醚、氯仿。α-萘酚-濃硫酸溶液噴灑后加熱顯色反應(yīng)呈紫紅色斑點。1HNMR [MeOD，400 MHz]: δH7.81（1H，d，J=3.9Hz，H-4），7.22（1H，d，H-8），6.93（1 H，d，J=4.2 Hz，H-3），6.29（1H，d，J=9.8 Hz，H-9），5.19（1H，d，J=5.8Hz，H-1'），3.40（1H，d，J=9.2Hz，H-6'），1.26（3H，s，7-OMe）；13CNMR[MeOD，100 MHz]：δC56.1（C-OMe），60.2（CH2，C-6'），69.2（CH，C-4'），72.3（CH，C-2'），74.9（CH，C-3'），75.8（CH，C-5'），99.0（CH，C-1'），99.1（C-10），103.4（CH，C-8），108.9（CH，C-3），113.0（C-6），149.9（C-4），145.0（C-5），148.2（C-7），164.3（C-9），170.3（C=O，C-2）。

以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的 Isofraxetin 6-O-β-D-glucopyranoside基本一致[15]，可以判斷該化合物為異嗪皮啶6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。其結(jié)構(gòu)式如圖4。

化合物 4，白色粉末（甲醇溶劑），mp.232～236 ℃。TOF-MS FD+: m/z(%): 354，分子式為C16H18O9，不飽和度為 9。易溶于甲醇、乙醇，不溶于石油醚、乙醚、氯仿。α-萘酚-濃硫酸溶液噴灑后加熱顯色反應(yīng)呈紫紅色斑點。1HNMR [MeOD，400 MHz]：δH3.69（1H，s，6-OMe），4.13（1H，m，H-5'），4.40（1 H，m，H-4'），4.30（1H，m，H-2'），4.41（1H，m，H-3'），4.31（1H，m，H-6a'），4.52（1H，d，J=2.2 Hz，H-6b'），5.88（1H，d，J=7.2 Hz，H-1’），6.39（1H，d，J=9.6 Hz，H-3），7.11（1H，s，H-5），7.59（1H，s，H-8），7.63（1H，d，J=9.6 Hz，H-4）；13CNMR [MeOD，100 MHz]：δC57.0（6-OMe），64.2（CH2，C-6'），71.9（CH，C-4'），74.9（CH，C-2'），79.2（CH，C-3'），80.0（CH，C-5'），102.9（CH，C-1'），105.2（CH，C-8），110.8（CH，C-5），112.8（CH，C-10），115.1（CH，C-3），144.8（CH，C-4），148.1（CH，C-6），150.9（CH，C-9），152.2（CH，C-7），162.5（C=O，C-2）。

圖4 化合物3的化學(xué)式結(jié)構(gòu)Fig. 4 The structure of compound 3

以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的 Scopolin基本一致[15,17]，可以判斷該化合物為東莨菪苷。其結(jié)構(gòu)式如圖5。

圖5 化合物4的化學(xué)式結(jié)構(gòu)Fig. 5 The structure of compound 4

3 討 論

以貴州烤煙為材料提取獲得烤煙浸膏，通過大孔樹脂吸附法獲得糖苷類化學(xué)成分粗提物，再通過不同極性有機(jī)溶劑分級分離，對烤煙糖苷粗提物不同溶劑萃取物進(jìn)行清除DPPH自由基活性研究。結(jié)果表明，糖苷粗提物不同溶劑萃取物均表現(xiàn)一定的清除DPPH自由基活性，其中乙酸乙酯部分活性最好。應(yīng)用反相色譜、凝膠色譜、半制備液相色譜及薄層層析等技術(shù)，對烤煙糖苷粗提物的乙酸乙酯部分進(jìn)一步分離純化，獲得了多個糖苷類單體。利用核磁共振儀對其中4個單體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，分別為：7,8-二氫-3-氧代-α-紫羅蘭醇-β-D-吡喃葡萄糖苷（化合物 1），3-氧代-α-紫羅蘭醇-β-D-吡喃葡萄糖苷（化合物 2），異嗪皮啶 6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（化合物3），東莨菪苷（化合物4）。

吸煙過量有害健康，可引起人體呼吸道等部位的損傷，但流行病學(xué)研究報告也顯示，吸煙可降低老年癡呆癥（Alzheimer 's disease，AD）和帕金森氏綜合癥（Parkinson 's disease，PD）的發(fā)病率，這可能與發(fā)現(xiàn)的煙草尼古丁清除活性氧自由基活性有關(guān)[18]。此外，煙草中還含有黃酮類、香豆類和單寧類等多種化學(xué)成分，而這些化合物已經(jīng)被證明具有較好的抗氧化性和降低自由基活性的功能[19]。本研究采用 DPPH法測定煙草糖苷類物質(zhì)抗氧化能力，結(jié)果顯示煙草糖苷提取物各萃取層均具有不同程度的抗氧化活性，并對抗氧化活性較好的乙酸乙酯萃取層進(jìn)行了系統(tǒng)分離。在分離的多個化合物單體中，首先鑒定了4個糖苷類化合物，其中化合物3和4是具有多酚單元的糖苷，可能是烤煙糖苷粗提物具有抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。同時，3-氧代-α-紫羅蘭醇-β-D-吡喃葡萄糖苷為具有良好加香作用的紫羅蘭醇類[20]。研究結(jié)果證明了煙草糖苷類化學(xué)成分的抗氧化活性，為開展系統(tǒng)的煙草糖苷單體抗氧化活性研究及煙草綜合開發(fā)利用提供了依據(jù)。

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Antioxidant Activity and Active Component Identification of Glycosides from Leaves of Guizhou Flue-cured Tobacco

DING Gensheng1, GE Yonghui2, YANG Chao1, LI Yongqing1, WANG Chengfu3, HUANG Xinmin1,HUANG Zhenghong1, YANG Shenggang1, WAN Lixing1, HUI Jianquan1, GENG Zhaoliang2*
(1. China Tobacco Guizhou Industrial Co., Ltd., Guiyang 550009, China; 2.Guizhou Tobacco Science Research Institute, Guiyang 550081, China; 3.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China)

To explore the chemical constituents of tobacco glycosides and their antioxidant activities, crude glycoside extracts from Guizhou flue-cured tobacco leaves were obtained by methanol-reflux and macroporous resin adsorption. DPPH radical-scavenging activities of different extracts of crude glycoside were investigated. Further separation and purification of ethyl acetate fractions were processed through reversed phase chromatography, gel chromatography, preparative liquid chromatography and thin layer chromatography. The results showed that, each crude glycoside extract showed certain DPPH radical-scavenging activities, in which the ethyl acetate fraction exhibited the best activity. Multiple monomeric compounds were isolated from the ethyl acetate fraction, and four glycoside chemical compounds were identified by NMR. The four monomers are 7,8-dihyd-3-oxo-α-ionol-β-D-glucopyranoside(1), 3-oxo-α-ionol-β-D-glucopyranosid (2), 6-O-β-D-glucopyranosid(3) and O-β-D- glucopyranosid(4).

flue-cured tobacco; glycoside; separation and purification; DPPH; structure identification

TS41+1

1007-5119（2017）05-0087-06 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.05.015

中國煙草總公司貴州省公司重點科技計劃項目“貴州煙葉中性致香物質(zhì)研究”（2013-07）；貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項目“貴州煙葉本源香提取物在卷煙配方中的應(yīng)用研究”（GZZY/KJ/JS/2015CY014-1）

丁根勝（1982-），男，碩士，農(nóng)藝師，主要從事卷煙產(chǎn)品研發(fā)與維護(hù)。E-mail：20020004@163.com*通信作者，E-mail：zhaolianggeng1104@126.com

2017-05-12

2017-09-06