青蒿琥酯對小鼠玫瑰痤瘡樣炎癥的作用觀察

李婷 曾慶文 陳向明 胡陽 張海清 俞愛華 王海瑞

201802上海市嘉定區(qū)南翔醫(yī)院皮膚科（李婷、陳向明、胡陽、張海清、俞愛華、王海瑞）；上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院兒科 上海市兒科醫(yī)學研究所（曾慶文）

青蒿琥酯對小鼠玫瑰痤瘡樣炎癥的作用觀察

李婷 曾慶文 陳向明 胡陽 張海清 俞愛華 王海瑞

201802上海市嘉定區(qū)南翔醫(yī)院皮膚科（李婷、陳向明、胡陽、張海清、俞愛華、王海瑞）；上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院兒科 上海市兒科醫(yī)學研究所（曾慶文）

目的觀察青蒿琥酯對小鼠玫瑰痤瘡樣炎癥的影響。方法在25只7周齡BALB/c雄鼠背部皮下注射40 μl抗菌肽LL?37，每12小時1次，共4次，制備玫瑰痤瘡樣小鼠模型，并將其隨機等分為5組，每次注射LL?37后模型組給予生理氯化鈉溶液灌胃，治療組分別給予25、50、100 mg/kg青蒿琥酯溶液灌胃，陽性對照組給予30 mg/kg鹽酸多西環(huán)素溶液灌胃；另取5只小鼠作為空白對照組，僅背部皮下注射4次純水。首次注射LL?37后48 h觀察各組皮損和紅斑評分，取背部注射部位皮膚行HE染色，觀察組織結(jié)構(gòu)并計數(shù)炎癥細胞數(shù)量，ELISA法檢測皮損髓過氧化物酶（MPO）活性。結(jié)果模型組皮損炎癥反應明顯，紅斑評分（3.20±0.84）、炎癥細胞計數(shù)（517.27±99.43）和MPO活性（0.57±0.08）均顯著高于空白對照組（均P＜0.01），陽性對照組紅斑評分（1.60±0.89）、炎癥細胞計數(shù)（270.93±124.63）和MPO活性（0.40±0.05）均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05、0.01、0.01）。50和100 mg/kg青蒿琥酯組紅斑評分分別是1.80±0.84和1.40±0.55，顯著低于模型組（P＜0.05、0.01），炎癥細胞計數(shù)分別為286.00±33.72和258.00±36.44，顯著低于模型組（均P＜0.01），MPO活性分別是0.43±0.05和0.40±0.06，亦明顯低于模型組（P＜0.05、0.01）。50 mg/kg和100 mg/kg青蒿琥酯組紅斑評分、炎癥細胞計數(shù)和MPO活性與陽性對照組差異均無統(tǒng)計學意義。結(jié)論青蒿琥酯能抑制小鼠玫瑰痤瘡樣炎癥反應，以中、高劑量最為明顯。

肥大性酒渣鼻；青蒿素類；多西環(huán)素；內(nèi)源性抗菌多肽類物質(zhì)；疾病模型，動物；青蒿琥酯；LL?37

玫瑰痤瘡是一種以面部皮膚潮紅、毛細血管擴張及丘疹、膿皰為表現(xiàn)的慢性炎癥性皮膚病。血管反應和炎癥反應是玫瑰痤瘡發(fā)病的兩個必要因素［1］。研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯具有抗炎和抑制血管新生的作用［2］，這些藥理活性可能與其臨床治療玫瑰痤瘡的作用機制有關。我們觀察青蒿琥酯對小鼠玫瑰痤瘡樣炎癥炎癥反應的影響，為臨床應用青蒿琥酯治療玫瑰痤瘡提供依據(jù)。

資料和方法

一、資料

1.實驗動物：SPF級［SCXK（滬）2012?0002］7周齡BALB/c健康雄鼠30只，體重18～20 g，動物來自上海斯萊克實驗動物有限公司（合格證號0151124）。小鼠每籠5只，自由進食飲水，12 h晝夜交替（7：00～19：00燈亮），室溫（23±1）℃，相對濕度45%～55%。飼養(yǎng)于華東師范大學腦功能基因組學教育部重點實驗室動物中心。

2.實驗試劑與設備：抑菌肽LL?37由吉爾（上海）生化有限公司合成，用純水溶解成320 μmol/L；青蒿琥酯片（廣西桂林制藥廠，批號AS116401），溶解于5%碳酸氫鈉溶液后再用生理氯化鈉溶液配制成所需濃度。鹽酸多西環(huán)素分散片（vibramycin?D，美國輝瑞制藥有限公司，批號11700200），溶于超純水后均置4℃冰箱保存，3 d內(nèi)用完。小鼠髓過氧化物酶（MPO）ELISA試劑盒來自美國RD公司。光學顯微鏡（Olympus B×43 F）及成像系統(tǒng)（micropublisher3.3RTV，加拿大Qimaging公司），直徑8 mm皮膚圓形打孔器（上海醫(yī)療器械有限公司手術器械廠），BIO?TEK酶標儀（ELX?800型，美國BioTek儀器有限公司）。

二、方法

1.造模［3］：動物以標準飼料飼養(yǎng)適應1周后進入實驗。實驗前1天，剃除小鼠背部3 cm×3 cm范圍毛發(fā)。向小鼠背部備皮部位用胰島素注射器皮內(nèi)注射LL?37（320 μmol/L），每次注射40 μl，間隔12 h重復注射，共連續(xù)注射 4次，即0、12、24、36 h各1次。

2.分組與給藥：第1次注射LL?37后即分為模型組、治療組（低、中、高劑量青蒿琥酯組）和陽性對照組，每組5只小鼠。另有5只小鼠為空白組，僅皮下注射4次40 μl純水。每次注射LL?37后模型組給予0.2 ml生理氯化鈉溶液灌胃，3個治療組分別給予25 mg/kg（低劑量組），50 mg/kg（中劑量組）和100 mg/kg（高劑量組）青蒿琥酯溶液灌胃，陽性對照組給予30 mg/kg鹽酸多西環(huán)素溶液灌胃，共4次。

3.大體觀察及皮損紅斑評分［2?3］：首次注射LL?37后48 h觀察各組注射部位皮損變化，并對皮膚紅斑給予評分，0分為無紅斑，1分為隱約可見紅斑，2分為明顯可見淡紅斑,邊界模糊，3分為紅斑明顯且邊界清晰，4分為紅斑顏色深邊界清晰。

4.組織病理觀察：首次注射LL?37后48 h處死小鼠，剪下背部注射部位的皮膚，用鉆孔器鉆取紅斑處皮損，等分為兩份，一份常規(guī)固定在甲醛溶液中，另一份置于低溫冰箱中備用。將甲醛液固定好的標本常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，每張切片在×100光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)，×400光鏡下觀察皮損內(nèi)3個不重疊視野，計數(shù)炎癥細胞數(shù)量，取均值。

5.皮損內(nèi)MPO測定：將鉆取的另一半皮損從低溫冰箱中取出，剪碎，勻漿，按試劑盒說明操作，最后用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度值。

三、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、大體觀察

48 h后，空白組小鼠背部皮膚正常（圖1A）；模型組局部注射部位皮膚形成中央水腫或壞死結(jié)痂的紅斑（圖1B）。陽性對照組皮膚紅斑明顯減輕（圖1C），紅斑評分顯著低于模型組（P＜0.05），見表1。不同劑量青蒿琥酯治療后皮損紅斑反應均有不同程度減輕（圖1D～1F）。其中，50和100 mg/kg青蒿琥酯組紅斑評分較模型組均顯著下降（P＜ 0.05、0.01），但兩組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），且與陽性對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（q值均為0.63，均P＞0.05），見表1。

圖1 首次注射LL?37后48 h各組皮損表現(xiàn) 1A：空白組局部無紅腫；1B：模型組局部紅斑充血、水腫明顯；1C：陽性對照組局部紅斑充血輕微，水腫輕微；1D：低劑量青蒿琥酯組局部紅斑充血較明顯，水腫輕微；1E：中劑量青蒿琥酯組局部紅斑充血輕微，水腫輕微；1F：高劑量青蒿琥酯組局部紅斑充血輕微，水腫輕微

表1 各組小鼠紅斑評分和炎癥細胞計數(shù)比較（±s）

表1 各組小鼠紅斑評分和炎癥細胞計數(shù)比較（±s）

注：n=5。a：與空白組比，P ＜ 0.05；b：與陽性對照組比，P ＜0.05；c：與模型組比，P ＜ 0.05

組別模型組青蒿琥酯組25 mg/kg 50 mg/kg 100 mg/kg陽性對照組空白組F值P值紅斑評分3.20±0.84ab炎癥細胞計數(shù)517.27±99.43ab髓過氧化物酶（pg/mg）0.57±0.08ab 2.20±0.45a 1.80±0.84ac 1.40±0.55c 1.60±0.89c 0.40±0.55c 8.55＜0.01 378.13±62.55a 286.00±33.72ac 258.00±36.44ac 270.93±124.63ac 52.2±51.10bc 20.45＜0.01 0.45±0.09a 0.43±0.05ac 0.40±0.06ac 0.40±0.05ac 0.11±0.05bc 26.41＜0.01

二、組織病理和炎癥細胞計數(shù)

空白組小鼠（圖2A）表皮無壞死結(jié)痂，細胞間及細胞內(nèi)未見水腫，真皮內(nèi)及皮下脂肪層少量炎癥細胞浸潤。模型組（圖2B）部分區(qū)域有明顯壞死，表皮缺如，部分區(qū)域表皮反應性增生，真皮及皮下組織毛細血管擴張和大量以中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤。陽性對照組（圖2C）表皮壞死程度減輕，炎癥細胞浸潤明顯少于模型組（P＜0.01）。25 mg/kg青蒿琥酯組（圖2D）組織病理變化與模型組相近；50、100 mg/kg青蒿琥酯兩組（圖2E、2F）炎癥細胞計數(shù)均較模型組顯著下降（均P＜0.01），但兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與陽性對照組比較差異亦無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。

圖2 各組小鼠皮損織病理（HE×100）A：空白組皮膚各層結(jié)構(gòu)完整，無明顯炎癥細胞浸潤；2B：模型組表皮嚴重壞死缺如，表皮下大量炎癥細胞浸潤；2C：陽性對照組表皮無明顯壞死，表皮下少量炎癥細胞浸潤；2D：低劑量青蒿琥酯組表皮輕度壞死缺如，表皮下見較多炎癥細胞浸潤；2E：中劑量青蒿琥酯組表皮無明顯壞死，表皮下少量炎癥細胞浸潤；2F：高劑量青蒿琥酯組表皮完整，表皮下少量炎癥細胞浸潤

三、MPO活性比較

模型組MPO活性明顯高于空白對照組（P＜0.01），陽性對照組MPO活性顯著低于模型組（P＜0.01）；50 mg/kg和100 mg/kg青蒿琥酯組MPO活性均顯著低于模型組（P＜0.05、0.01），但兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），且與陽性對照組比較差異 無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。

討 論

大量研究表明，紫外線、毛囊蠕型螨等外界刺激會激活多種信號途徑，引起皮損處先天免疫異常，絲氨酸蛋白酶和抗菌肽分泌增多［2，4］。LL?37是唯一存在于人體的Cathelicidin類抗菌肽，含有37個氨基酸，具有誘導新生血管生成和促進炎癥反應的作用，在玫瑰痤瘡的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用［5?6］。Yamasaki等［7］用組織病理免疫染色發(fā)現(xiàn)玫瑰痤瘡患者皮損處有大量抗菌肽，其中LL?37最為顯著。向小鼠背部皮下注射LL?37，48 h后注射部位出現(xiàn)與玫瑰痤瘡病理表現(xiàn)相似的皮損。我們研究發(fā)現(xiàn)，LL?37可以引起小鼠注射部位皮膚產(chǎn)生紅斑、水腫，組織病理顯示以中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤，與文獻［3，7］一致。

目前玫瑰痤瘡的系統(tǒng)治療多以抗生素治療為主，其中鹽酸多西環(huán)素使用最廣，臨床療效明確，故在本研究中作為陽性對照。但多西環(huán)素對小鼠玫瑰痤瘡樣炎癥反應影響的國內(nèi)外資料很有限。最近研究發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素治療玫瑰痤瘡的作用機制與抗菌活性無關，而與抑制玫瑰痤瘡的先天免疫反應有關［8］。所以尋找其他具有抗炎作用的非抗生素類藥物治療玫瑰痤瘡非常重要，有助于減少抗生素使用量，避免菌群失調(diào)和耐藥菌的產(chǎn)生。

青蒿琥酯價格低廉，安全性高，已被廣泛用于治療各型瘧疾。近些年，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯還具有其他非抗瘧藥理活性［9］。Chen等［10］早年發(fā)現(xiàn)外用青蒿琥酯可以抑制豚鼠變應性接觸性皮炎。王國江等［11］還發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯通過抑制IL?8所致的嗜中性粒細胞趨化減輕皮炎小鼠的炎癥反應。另外，青蒿素類藥物可以通過抑制血管內(nèi)皮生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等發(fā)揮抗血管生成作用［9］。青蒿琥酯抗炎和抑制血管增生的藥理活性均與玫瑰痤瘡的發(fā)病機制有關。前期［12］研究我們發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能有效治療輕、中度玫瑰痤瘡，療效與鹽酸多西環(huán)素相近。本研究中我們應用小鼠玫瑰痤瘡模型，在第1次皮下注射LL?37后即給陽性對照組小鼠和治療組小鼠鹽酸多西環(huán)素和不同濃度的青蒿琥酯灌胃，共4次。48 h后鹽酸多西環(huán)素和中、高劑量的青蒿琥酯均可以顯著降低紅斑評分和炎癥細胞計數(shù)，與模型組差異有統(tǒng)計學意義，但該3組間差異無統(tǒng)計學意義。本文結(jié)果提示，作為陽性對照的鹽酸多西環(huán)素能明顯抑制LL?37誘導的玫瑰痤瘡樣小鼠模型炎癥反應，中、高劑量的青蒿琥酯與鹽酸多西環(huán)素的抑制作用相近。但是青蒿琥酯治療玫瑰痤瘡的抗炎和抑制血管反應的機制還需進一步研究。

玫瑰痤瘡樣小鼠模型炎癥細胞浸潤以中性粒細胞為主，MPO是中性粒細胞中含量較高的一種酶，皮損部位MPO含量的增高可以反映中性粒細胞浸潤的程度［13］。本文結(jié)果顯示，模型組皮損內(nèi)MPO活性明顯高于空白組，鹽酸多西環(huán)素干預可明顯降低MPO活性，且中、高劑量青蒿琥酯干預也能明顯降低MPO活性，表明中、高劑量的青蒿琥酯和鹽酸多西環(huán)素均具有抗中性粒細胞浸潤的作用。

志謝 上海市周浦醫(yī)院王國江主任和華東師范大學腦功能研究所曹曉華教授

［1］Cribier B.Pathophysiology of rosacea:redness,telangiectasia,and rosacea［J］.Ann Dermatol Venereol,2011,138 Suppl 3:S184 ?191.DOI:10.1016/S0151?9638（11）70088?6.

［2］Del RJQ.Advances in understanding and managing rosacea:part 1:connecting the dots between pathophysiological mechanisms and common clinical features of rosacea with emphasis on vascular changes and facial erythema［J］.J Clin Aesthet Dermatol,2012,5（3）:16?25.

［3］Zhang J,Xu X,Rao NV,et al.Novel sulfated polysaccharides disruptcathelicidins,inhibitRAGE and reducecutaneous inflammation in a mouse model of rosacea［J］.PLoS One,2011,6（2）:e16658［2013?11?28］.DOI:10.1371/journal.pone.0016658.

［4］Salzer S,Ruzicka T,Schauber J.Face?to?face with anti?inflam?matory therapy for rosacea［J］.Exp Dermatol,2014,23（6）:379?381.DOI:10.1111/exd.12401.

［5］Salvado MD,Di GA,Lindbom L,et al.Cathelicidin LL?37 induces angiogenesis via PGE2?EP3 signaling in endothelial cells,in vivoinhibition by aspirin［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2013,33（8）:1965?1972.DOI:10.1161/ATVBAHA.113.301851.

［6］Marcinkiewicz M,Majewski S.The role of antimicrobial peptides in chronic inflammatory skin diseases［J］.Postepy Dermatol Alergol,2016,33（1）:6?12.DOI:10.5114/pdia.2015.48066.

［7］Yamasaki K,Di NA,Bardan A,et al.Increased serine protease activity and cathelicidin promotes skin inflammation in rosacea［J］.Nat Med,2007,13（8）:975?980.DOI:10.1038/nm1616.

［8］Kanada KN,Nakatsuji T,Gallo RL.Doxycycline indirectly inhibits proteolytic activation of tryptic kallikrein?related peptidases and activation of cathelicidin［J］.J Invest Dermatol,2012,132（5）:1435?1442.DOI:10.1038/jid.2012.14.

［9］Ho WE,Peh HY,Chan TK,et al.Artemisinins:pharmacological actions beyond anti?malarial［J］.Pharmacol Ther,2014,142（1）:126?139.DOI:10.1016/j.pharmthera.2013.12.001.

［10］Chen H,Maibach HI.Topical application of artesunate on guinea pig allergic contact dermatitis［J］.Contact Dermatitis,1994,30（5）:280?282.DOI:10.1111/j.1600?0536.1994.tb00598.x.

［11］王國江,顧軍,張海清.青蒿琥酯對中性粒細胞趨化的影響［J］.中國皮膚性病學雜志,2004,18（7）:391?393,411.DOI:10.3969/j.issn.1001?7089.2004.07.004.

［12］李婷,胡陽,俞愛華,等.口服青蒿琥酯治療酒渣鼻31例臨床觀察［J］.中國皮膚性病學雜志,2015,29（3）:330?332.DOI:10.13735/j.cjdv.1001?7089.201402021.

［13］Lazarevic?Pasti T,Leskovac A,Vasic V.Myeloperoxidase inhi?bitors as potential drugs［J］.Curr Drug Metab,2015,16（3）:168?190.

Effects of artesunate on rosacea?like inflammation in mouse models

Li Ting,Zeng Qingwen,Chen Xiangming,Hu Yang,Zhang Haiqing,Yu Aihua,Wang Hairui
Department of Dermatology,Nanxiang Hospital of Jiading District,Shanghai 201802,China（Li T,Chen XM,Hu Y,Zhang HQ,Yu AH,Wang HR）;Department of Pediatrics,Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai Institute for Pediatric Research,Shanghai 200092,China（Zeng QW）

Hu Yang,Email:huyang0620@163.com

ObjectiveTo evaluate effects of artesunate on rosacea?like inflammation in mouse models.MethodsTwenty?five male BALB/c mice aged 7 weeks were injected subcutaneously with 40 μl antibacterial peptide LL?37 into the back once every 12 hours for 4 sessions to establish mouse models with rosacea?like inflammation.These 25 mice were randomly and equally divided into 5 groups:after each injection of LL?37,model group were gavaged with sodium chloride physiological solution,treatment groups gavaged with 25,50 and 100 mg/kg artesunate solution separately,and positive control group gavaged with 30 mg/kg doxycycline hydrochloride solution.Another 5 healthy mice injected subcutaneously with pure water into the back for 4 sessions served as blank control group.Forty?eight hours after the initial injection of LL?37,changes in skin lesions and the intensity of erythema were assessed.Skin tissues at the dorsal injection site were resected and subjected to HE staining,the tissue structure was observed and the number of inflammatory cells was counted.Enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）was performed to estimate the activity of myeloperoxidase（MPO）in skin lesions.ResultsThe model group showed obvious inflammatory reactions,and significantly increased erythema score（3.20 ± 0.84）,inflammatory cell count（517.27 ± 99.43）and MPO activity（0.57 ± 0.08）compared with the blank control group（allP＜ 0.01）.The positive control group showed significantly decreased erythema score（1.60 ± 0.89）,inflammatory cell count（270.93 ± 124.63）and MPO activity（0.40 ± 0.05）compared with the model group（P＜ 0.05,0.01,0.01,respectively）.Moreover,the erythema score,inflammatory cell counts and MPO activity were all significantly lower in 50?（1.80 ± 0.84,286.00 ± 33.72,0.43 ± 0.05,respectively）and 100?mg/kg artesunate groups（1.40±0.55,258.00±36.44,0.40±0.06,respectively）than in the model group（P＜0.05 or 0.01）.However,there were no significant differences in the erythema score,inflammatory cell count and MPO activity between 50?or 100?mg/kg artesunate group and the positive control group（P＞ 0.05）.ConclusionArtesunate can inhibit rosacea?like inflammatory reactions in mouse models,especially the middle?and high?dose artesunate.

Rhinophyma;Artemisinins;Doxycycline;Cathelicidins;Disease models,animal;Artesunate;LL?37

胡陽，Email：huyang0620@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.09.007

上海市醫(yī)學重點?？平ㄔO項目（ZK2012B18）；上海市嘉定區(qū)醫(yī)學重點學科建設項目（ZD06）

Fund programs:Shanghai Medical Key Subject Construction Project（ZK2012B18）;Medical Key Subject Construction Project of Jiading District of Shanghai Municipality（ZD06）

2016?10?08）

（本文編輯：尚淑賢）