南海紅樹林內(nèi)生真菌Phomopsis sp.ZZF08酰胺類次級代謝產(chǎn)物

陶移文，凌惠平，張建業(yè)，佘志剛，林永成

(1. 廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 511436；2. 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510275)

南海紅樹林內(nèi)生真菌Phomopsis sp.ZZF08酰胺類次級代謝產(chǎn)物

陶移文1，凌惠平1，張建業(yè)1，佘志剛2，林永成2

(1. 廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 511436；2. 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510275)

采用色譜技術(shù)對紅樹林內(nèi)生真菌Phomopsissp.ZZF08代謝產(chǎn)物進行分離純化，MS、NMR、X-單晶衍射及與文獻數(shù)據(jù)比對等方法確定其結(jié)構(gòu)，MTT法考察其對體外人鼻咽癌細(xì)胞KB和KBv200的毒性作用。結(jié)果表明，由紅樹林內(nèi)生真菌Phomopsissp.ZZF08培養(yǎng)液中分離得到12個酰胺類化合物，經(jīng)鑒定，分別為viridicatol (1)、cytochalasin H (2)、cytochalasin IV (3)、葡萄糖神經(jīng)酰胺 (4)、△4(5)(E)-鞘氨醇-正十六碳酰胺 (5)、尿囊素 (6)、胸腺嘧啶 (7)、尿嘧啶 (8)、環(huán)(亮-甘)二肽 (9)、環(huán)(亮-丙)二肽 (10)、環(huán)(苯丙-甘))二肽 (11)和環(huán)(苯丙-丙)二肽 (12)，其中，化合物1，2，3，4，5為首次從湛江紅樹林內(nèi)生真菌Phomopsissp.中發(fā)現(xiàn)。體外細(xì)胞毒性實驗表明化合物2，3對KB細(xì)胞和KBv200細(xì)胞有較強細(xì)胞毒性。

紅樹林；內(nèi)生真菌；擬莖點霉菌；酰胺類次級代謝產(chǎn)物

紅樹林內(nèi)生真菌因其獨特的生存環(huán)境而產(chǎn)生了獨特的代謝方式，為其產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎，活性出眾的次級代謝產(chǎn)物提供了可能[1-3]。擬莖點霉屬Phomopsis(Sacc.) Bubak在分類學(xué)上屬于半知菌亞門、腔孢綱、球殼孢目、球殼孢科，其種類多、分布廣，活性代謝產(chǎn)物豐富[4-7]。

Phomopsissp. ZZF08為廣東省湛江紅樹林植物樹皮內(nèi)生真菌，其代謝產(chǎn)物豐富。對該菌進行大規(guī)模發(fā)酵后，分離得到12個酰胺類化合物。運用現(xiàn)代波譜技術(shù)，單晶衍射技術(shù)以及文獻比對等方法，確定這些化合物為viridicatol (1)、cytochalasin H (2)、cytochalasin Ⅳ (3)、葡萄糖神經(jīng)酰胺 (4)、△4(5)(E)-鞘氨醇-正十六碳酰胺(5)、尿囊素(6)、胸腺嘧啶 (7)、尿嘧啶(8)、環(huán)(亮-甘)二肽(9)、環(huán)(亮-丙)二肽(10)、環(huán)(苯丙-甘)二肽(11)和環(huán)(苯丙-丙)二肽(12)，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structures of compounds

1 儀器與材料

Varian INOVA 500NB/400NB/300NB核磁共振波譜儀 (美國Varian公司)；VG ZAB-HS 雙聚焦質(zhì)譜儀 (英國VG公司)；VG Autospec-500 質(zhì)譜 (英國VG公司)；EQUINOX55 紅外儀 (德國Bruker公司)；UV-2501PC 紫外-可見分光光度計 (日本島津公司)；Vario EL CHNS-O元素分析儀 (德國 Elementar公司)； Bruker XSCANS 衍射儀 (德國Bruker公司)； Polaptronic HNQW5 型旋光儀 (德國Schmidt-Haensch 公司)；北京 X-4 型顯微熔點儀；Agilent 1100 型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。薄層色譜硅膠GF254和柱色譜用硅膠 (青島海洋化工廠有限公司)；常規(guī)試劑均為AR。

2 提取與分離

發(fā)酵培養(yǎng)基為GYP為：φ(葡萄糖)=1%，φ(蛋白胨)=0.2%，φ(酵母膏)=0.1%，φ(粗海鹽)=0.2%，pH 7.0，室溫靜置培養(yǎng)30 d。

用紗布過濾發(fā)酵液，分離菌體和發(fā)酵液。發(fā)酵液濃縮至5 L，用乙酸乙酯萃取3次；菌體晾干，甲醇浸泡至無色。將萃取物和浸提物合并，經(jīng)硅膠柱層析、高效液相色譜、重結(jié)晶等操作，獲得12個純化合物。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色塊狀固體，θmp250～252 ℃，HR EI MSm/z253.072 9，結(jié)合1H和13C NMR數(shù)據(jù)可確定該化合物分子式為C15H11NO3，不飽和度U=11提示分子中可能存在芳香環(huán)。紅外光譜數(shù)據(jù)(35 44，3 423，3 239，1 654和1 245 cm-1)暗示分子中有羥基、酰胺和芳環(huán)存在。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz)δ: 9.06 (1H, s), 7.34 (1H, dd,J=1.0, 8.0 Hz), 7.07 (1H, ddd,J= 1.0, 8.0, 8.0 Hz), 7.32 (1H, dt,J= 1.0, 8.0 Hz), 7.09 (1H, dd,J= 1.0, 8.0 Hz), 6.71 (1H, dd,J= 1.5, 2.5 Hz), 6.82 (1H, ddd), 7.29 (1H, dd,J= 8.0, 8.0 Hz), 6.72 (1H, ddd,J= 1.0, 1.5, 8.5 Hz), 12.16 (1H, s), 9.55 (1H, s);13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz)δ: 158.3, 157.3, 142.2, 134.9, 133.1, 129.5, 126.5, 124.5, 124.2, 122.2, 120.9, 120.4, 116.8, 115.3, 114.7。1H NMR顯示該化合物含8個芳香區(qū)質(zhì)子峰和三個可交換的質(zhì)子信號(δH= 9.06, 9.55，12.16)，其中δH= 12.16應(yīng)為螯合羥基質(zhì)子峰。13C NMR和DEPT 135°譜圖表明化合物存在8個芳香CH(129.5、126.5、124.5、122.2、120.4、116.8、115.3和114.7)，6個芳香季碳(120.9、124.2、133.1、134.9、142.2和157.3)以及1個酰胺基團(δC: 158.3)。這些基團對應(yīng)8個不飽和度，相對于11個不飽和度來說分子中還剩3個不飽和度，暗示化合物結(jié)構(gòu)中應(yīng)該含3個環(huán)。一維氫譜和1H-1H COSY譜圖表明一組4個芳香次甲基質(zhì)子依次連接在一起的，另一組3個芳香質(zhì)子也是依次連接在一起的。綜合上述信息，推導(dǎo)出該化合物的初步結(jié)構(gòu)是苯酚取代的異喹啉結(jié)構(gòu)，經(jīng)文獻查閱后確定化合物1為viridicatol[8]。X-單晶衍射進一步證實其結(jié)構(gòu)，其單晶結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 化合物1和2的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Molecular structures of compounds 1 and 2

化合物2：無色塊狀晶體，θmp272～273 ℃，HR EI MSm/z493.285 1，結(jié)合1H和13C NMR數(shù)據(jù)可確定該化合物分子式為C30H39NO5。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz)δ: 5.68 (1H, s), 3.24 (1H, m), 2.11 (1H, t), 2.76 (1H, m), 3.81 (1H, d,J= 11.0 Hz), 2.92 (1H, t), 2.64 (1H, dd,J= 8.5, 13.5 Hz), 2.84 (1H, dd,J= 4.5, 13.5 Hz), 0.97 (3H, d,J= 6.5 Hz), 5.09 (1H, s), 5.33 (1H, s), 5.72 (1H, ddd,J= 1.0, 10.5, 15.5 Hz), 5.38 (1H, m,), 1.8 (1H, m), 2.03 (1H, m), 1.77 (1H, m), 1.55 (1H, dd,J=3.0, 14.0 Hz), 1.86 (1H, dd,J= 3.0, 14.0 Hz), 5.84 (1H, dd,J= 3.0, 13.5 Hz), 5.52 (1H, dd,J= 2.5, 13.5 Hz), 5.54 (1H, s), 1.03 (3H, d), 1.32 (3H, s), 2.26 (3H, s), 7.13 (2H, d), 7.31 (2H, dd), 7.23 (1H, t), 2.08 (1H, s);13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz)δ: 174.2, 170.1, 147.9, 138.6, 138.1, 137.3, 129, 128.9, 127.1, 127.0, 125.9, 114.0, 77.4, 74.2, 69.7, 53.7, 53.7, 51.7, 50.3, 47.1, 45.5, 42.7, 32.8, 31.1, 28.4, 26.4, 20.8, 14.0。通過1H NMR、13C NMR 及2D NMR確定了2的結(jié)構(gòu)為cytochalasin H[7]。該結(jié)構(gòu)經(jīng)X-單晶衍射證實，其單晶結(jié)構(gòu)見圖2。

化合物3：白色晶體,θmp124～126 ℃，EI MSm/z481。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz)δ: 7.99 (1H, d,J= 8.5 Hz)，6.55 (1H, d,J= 8.5 Hz)，3.82 (1H, dd,J= 5, 10 Hz), 2.43 (1H, m), 2.70 (2H, m), 1.15 (3H, s), 3.63 (3H, s), 7.56 (1H, d,J= 8.5 Hz)，6.55 (1H, d,J= 8.5 Hz)，3.93 (1H, d,J= 10 Hz), 2.43 (1H, m), 2.46 (2H, m), 3.63 (3H, s)，1.08 (3H, s)，11.34 (1H, br s)，11.62 (1H, br s), 2.05 (2H, br s), 13.76 (2H, br s);13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz)δ: 188.43, 188.43, 179.92, 179.12, 170.99, 170.92, 162.22, 159.98, 159.87, 157.22, 141.94, 141.87, 118.31, 116.70, 110.13, 108.33, 107.69, 107.51, 103.00, 102.73, 86.08, 86.08, 77.06, 76.8, 53.07, 52.98, 36.77, 36.66, 30.87, 30.87, 18.24, 18.10。將核磁數(shù)據(jù)與文獻[9]相對照, 證實3為cytochalasin Ⅳ。

化合物4：白色粉末狀固體，θmp178～180 ℃。LC MSm/z754.4 [M+1]+。結(jié)合1H、13C NMR推斷分子式為C43H79NO9，不飽和度U=5。1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz )δ: 3.55 (1H, dd,J= 10.5, 4.5 Hz), 3.91 (1H, dd,J= 10.5, 6.0 Hz), 3.81 (1H, m), 4.01 (1H, ddd,J= 7.0, 6.0, 6.0 Hz), 5.40 (1H, dd,J= 15.0, 6.0 Hz), 5.59 (1H, dt,J= 15.0, 6.0 Hz), 1.97 (2H, m), 1.85 (2H, m), 1.98 (2H, m), 5.09 (1H, t,J= 7.0 Hz), 1.93 (m, 2H), 1.28 (m, 12H), 1.28 (2H, m), 0.84 (3H, t,J= 7.5 Hz), 1.51 (3H, s), 7.29 (1H, d,J= 9.0 Hz), 5.60 (1H, d,J= 5.0 Hz), 4.80 (1H, d,J= 7.0 Hz), 4.30 (1H, ddd,J= 5.5, 5.0, 1.5 Hz), 5.46 (1H, dd,J= 16.0, 5.5 Hz), 5.69 (1H, ddt,J= 16.0, 7.5, 1.5 Hz), 1.96 (2H, m), 1.35 (2H, m), 1.28 (20H, m), 1.28 (2H, m), 0.84 (3H, t,J= 7.5 Hz), 4.12 (1H, d,J= 8.0 Hz), 2.98 (1H, ddd,J= 8.0, 8.0, 4.5 Hz), 3.20 (1H, m), 3.08 (1H, m), 3.09 (1H, m), 3.45 (1H, ddd,J= 11.0, 5.5, 6.0 Hz), 3.67 (1H, ddd,J= 11.0, 6.0, 2.0 Hz), 4.79 (1H, d,J= 4.5 Hz), 4.74 (1H, d,J= 4.5 Hz), 4.73 (1H, d,J= 5.0 Hz), 4.34 (1H, t,J= 6.0 Hz)；13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz)δ: 171.9, 134.7, 130.8, 130.7, 130.7, 128.9, 123.3, 103.3, 76.7, 76.5, 73.2, 71.8, 70.5, 70, 68.3, 61.0, 52.9, 38.8, 31.9, 31.0, 28.5-31.4, 28.5-31.4, 28.4, 27.2, 27.1, 21.8, 21.8, 15.5, 13.6, 13.6。通過與文獻[10]數(shù)據(jù)比對，確定化合物4為(3′E,4E)-1-(β-D-吡喃葡萄糖基)-3-羥基-2-[(2′-羥基十八碳酰基)氨基]-10-甲基-3′,4,9-十八碳三烯，即葡萄糖神經(jīng)酰胺。

化合物5：白色固體，θmp95～97 ℃，F(xiàn)AB MSm/z583 [M+1]+。1H NMR (CDCl3, 300 MHz)δ: 6.36 (1H, d,J=5.5 Hz ), 5.78 (1H, dt,J= 16.0, 6.0 Hz), 5.30 (1H, dd,J= 16.0, 6.5 Hz), 4.32 (1H, t,J=5.0 Hz), 3.95 (1H, dd,J=11.0, 4.0 Hz), 3.91 (1H, d,J=3.5 Hz), 3.71 (1H, dd,J=11.0, 3.5 Hz), 2.25 (2H, m,J= 7.5 Hz), 2.05 (2H, q,J=6.0 Hz), 1.64 (2H, m), 1.35 (2H, t,J= 7.5 Hz), 1.26 (44H, br s), 0.88 (6H, t, J = 6.5 Hz)；13C NMR (CDCl3, 75 MHz)δ: 173.1, 134.3, 128.8, 74.6, 62.5, 54.5, 36.9, 32.6, 31.9, 29.4～29.9, 25.8, 22.7, 14.0?；衔锏牟ㄗV數(shù)據(jù)與文獻[11]比較，確定化合物5為△4(5)(E)-鞘氨醇-正十六碳酰胺。

化合物6：白色細(xì)簇狀晶體，θmp236～237 ℃；FAB MSm/z：159 [M+1]。1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz)δ: 10.48 (1H, s), 7.98 (1H, s), 6.85 (1H, d,J= 8.0 Hz), 5.71 (2H, s), 5.24 (1H, dd,J= 8.0, 1.0 Hz)；13C NMR (DMSO，75 MHz)δ: 173.5, 157.3, 156.7, 62.4；這與尿囊素的波譜數(shù)據(jù)相符合，單晶數(shù)據(jù)進一步確證了其結(jié)構(gòu)。

化合物7：黃色固體；θmp233～235 ℃；1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz)δ: 1.70 (3H, s), 7.20 (1H, d,J= 2.0 Hz), 10.48 (1H, s), 10.91 (1H, s)。其外觀、TLC和氫譜與實驗室常見化合物庫中的胸腺嘧啶相符，所以可確定7為胸腺嘧啶。

化合物8：泥黃色固體，θmp>265 ℃ (升華)；1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz)δ: 5.43 (1H, dd,J= 1.0, 7.5 Hz), 7.23 (1H, d,J= 7.5 Hz), 10.72 (1H, s), 10.92 (1H, s)。外觀、TLC和氫譜與實驗室常見化合物庫中的尿嘧啶一致，確定化合物8為尿嘧啶。

化合物9：白色粉末，θmp224～226 ℃；1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz)δ: 8.20 (1H, br s), 7.91 (1H, br s), 3.79 (1H, m), 3.63 (2H, m), 1.77 (1H, m), 1.52 (2H, t,J= 6.9 Hz), 0.89 (3H, d,J= 6.9 Hz), 0.87 (3H, d,J= 6.9 Hz)；13C NMR (DMSO-d6, 75 MHz)δ: 165.95, 168.31, 52.82, 44.23, 42.14, 23.78, 23.05, 21.96。參照標(biāo)準(zhǔn)譜圖[12]，化合物9可確定為環(huán)(甘-亮)二肽。

化合物10：白色粉末，在210～220 ℃升華。FAB MSm/z185 [M+1]。1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz)δ: 8.11 (1H, s), 8.09 (1H, s), 3.86 (1H, m), 3.76 (1H, m), 1.82～1.86 (1H, m), 1.61～1.66 (1H, m), 1.71～1.76 (1H, m), 1.44 (3H, d,J= 7.0 Hz), 0.97 (3H, d,J= 6.5 Hz), 0.96 (3H, d,J= 6.5 Hz)；13CNMR (DMSO-d6, 75 MHz)δ: 171.5, 170.9, 60.9, 54.8, 45.1, 25.3, 23.5, 22.1, 20.9。根據(jù)1H NMR,13C NMR和MS及與文獻[13]對照可確定化合物10為環(huán)(丙-亮)二肽。

化合物11：白色粉末，加熱到165～170 ℃升華；FAB MSm/z205 [M+1]+；1H NMR (DMSO-d6，300 MHz)δ: 8.09 (1H, br s), 7.81 (1H，br s), 7.17～7.27 (5H，m), 4.06 (1H，m), 3.38 (1H, d,J= 16.8 Hz), 3.15 (1H，dd，J= 12.9, 5.4Hz), 3.02 (1H, dd,J= 12.9, 5.4Hz), 2.81 (1H, d,J= 16.8 Hz)；13C NMR (DMSO, 75 MHz)δ: 166.9, 165.5, 135.1, 129.7, 127.6, 126.1, 55.6, 43.7, 39.0。根據(jù)1H NMR,13C NMR和MS, 可確定化合物11為環(huán)(甘-苯丙)二肽，其數(shù)據(jù)與文獻[14]基本一致。

化合物12：白色粉末，θmp>270 ℃，F(xiàn)AB MSm/z218。1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz)δ: 8.09 (1H, br s), 8.00 (1H, br s), 7.15～7.29 (5H, m), 4.16～4.17 (1H, m), 3.60～3.62 (1H, m), 3.06～3.10 (1H, dd,J= 13.5, 4.5 Hz), 3.18～3.21 (1H, dd,J= 13.5, 4.5 Hz), 0.77 (3H, d,J= 7.0 Hz)；根據(jù)1H NMR, MS及與文獻[15]比對，確定12為環(huán)(苯丙-丙)二肽。

4 結(jié)果與討論

在Phomopsissp.ZZF08中共分得12個酰胺類化合物，并對其結(jié)構(gòu)進行了解析，證明其有產(chǎn)生大量酰胺類化合物的潛力。化合物1，2，3，4，5為首次從湛江紅樹林樹皮內(nèi)生真菌Phomopsissp.中分離得到。

此外，我們采用了MTT 法做了所有化合物對人鼻咽癌細(xì)胞株KB和人鼻咽癌細(xì)胞耐藥株KBv200的體外腫瘤細(xì)胞毒性實驗。用酶標(biāo)儀以試驗波長為570 nm，參比波長為450 nm測定A值。

繪制劑量反應(yīng)回歸曲線，計算半數(shù)殺傷濃度IC50,結(jié)果見表1。

化合物2，3對KB細(xì)胞株和KBv200細(xì)胞株表現(xiàn)出了良好的抑制活性，其IC50不高于1.41 μg/mL，其抗腫瘤作用機制有待進一步研究。

表1 12個化合物對KB、KBv200細(xì)胞的IC50Table 1 In vitro IC50 value (μg/mL) of 12 compounds against KB and KBv200 cells μg/mL

致謝: 本文的核磁共振譜、質(zhì)譜等測試均在中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院或測試中心完成。

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AmidemetabolitesofthemangroveendophyticfungusPhomopsissp.ZZF08fromtheSouthChinaSea

TAOYiwen1，LINGHuiping1，ZHANGJianye1，SHEZhigang2，LINYongcheng2

(1. School of Pharmaceutical Sciences，Guangzhou Medical University, Guangzhou 511436, China；2. School of Chemistry and Chemical Engineering，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China)

The amide metabolites ofPhomopsissp. ZZF08 from the South China Sea were isolated and purified by chromatography. Their structures were determined by MS, NMR, X-ray diffraction data and comparison with the literature data. Cytotoxicityinvitrowas performed by tetrazolium (MTT) assay. Twelve amide compounds were isolated, which were viridicatol (1), cytochalasin H (2), cytochalasin IV (3), glucosylceramide (4), ceramide (5), allantoin (6), thymine (7), pyridine (8), cyclo- (Leu-Gly) (9), cyclo-(Leu- Ala) (10), cyclo-(Phe- Gly) (11), and cyclo-(Phe- Ala) (12). Compounds1，2，3，4and5were isolated firstly fromPhomopsissp. collected from the mangrove bark of the Zhanjiang. In our cytotoxicity assays, compounds2and3exhibited strong cytotoxicity toward KB cells and KBv200 cells.

mangrove; endophytic fungus;Phomopsissp.; amide metabolites

O621.2

A

0529-6579(2017)05-0073-07

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.05.010

2017-05-08

廣東省自然科學(xué)基金 (2016A030313588); 廣東省科技計劃項目 (2013B021100021);廣州市教育局項目(1201610155)

陶移文(1975年生)，男；研究方向天然藥物化學(xué);E-mail：yywentao@aliyun.com