帶有小鼠CD40L基因的漢灘病毒糖蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

馮偉，張堯，張曉曉，應(yīng)旗康，劉梓諭，吳興安，王芳

1.第四軍醫(yī)大學(xué) 學(xué)員旅，陜西 西安 710032；2.第四軍醫(yī)大學(xué) 微生物學(xué)教研室，陜西 西安 710032

帶有小鼠CD40L基因的漢灘病毒糖蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

馮偉1，張堯1，張曉曉2，應(yīng)旗康2，劉梓諭2，吳興安2，王芳2

1.第四軍醫(yī)大學(xué) 學(xué)員旅，陜西 西安 710032；2.第四軍醫(yī)大學(xué) 微生物學(xué)教研室，陜西 西安 710032

目的：構(gòu)建漢灘病毒包膜糖蛋白基因的真核表達(dá)載體，并加入可增強(qiáng)免疫應(yīng)答效應(yīng)的細(xì)胞因子CD40L基因，檢測(cè)其可否在真核細(xì)胞中表達(dá)。方法與結(jié)果：參照GenBank中漢灘病毒M基因和小鼠CD40L的全基因序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）獲得M和CD40L基因片段，將其與pCI-neo載體相連，測(cè)序證實(shí)該載體構(gòu)建成功后，將此真核表達(dá)載體以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO-K1中，利用間接免疫熒光法（IFA）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)M基因和CD40L基因可以同時(shí)表達(dá)于CHO-K1細(xì)胞中。結(jié)論：構(gòu)建了帶有CD40L基因的漢灘病毒包膜糖蛋白重組質(zhì)粒并獲得表達(dá)，為深入研究漢灘病毒感染后包膜糖蛋白引起的特異性免疫應(yīng)答規(guī)律奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

漢灘病毒；包膜糖蛋白；CD40L

漢灘病毒（Hantaan virus，HTNV）屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，為分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，病毒基因組按片段大小分為L(zhǎng)、M、S等3個(gè)片段，分別編碼RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-depen?dent RNA polymerase，RdRp）、包膜糖蛋白（glyco?protein，GP）和核衣殼蛋白（nucleoprotein，NP）。GP和NP為結(jié)構(gòu)蛋白，是重要的病毒抗原[1]。GP具有多個(gè)中和抗原表位，在機(jī)體的保護(hù)性體液免疫應(yīng)答中起主要作用，但其誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力較弱；NP具有較強(qiáng)的免疫原性，但其刺激產(chǎn)生中和抗體的能力較弱[2]。

CD40配體（CD40 ligand，CD40L）是常用的免疫刺激分子，其作為佐劑可增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞的抗原提呈能力，提高疫苗免疫效果[3]。

我們將漢灘病毒包膜糖蛋白基因與小鼠CD40L基因同時(shí)構(gòu)建入真核表達(dá)載體pCI-neo中，并觀察此重組質(zhì)?？煞裨谡婧思?xì)胞中表達(dá)，從而為進(jìn)一步的動(dòng)物免疫奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO-K1、感受態(tài)大腸桿菌JM109、含有漢灘病毒76-118株M全長(zhǎng)基因序列的質(zhì)粒pcDNA3.1-M、質(zhì)粒pCI-neo由本室保存；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、凝膠回收試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE 2000購(gòu)自Invitrogen公司；抗?jié)h灘病毒GP的特異性抗體由本室制備保存；兔抗小鼠CD40L多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自康為世紀(jì)公司。

1.2 漢灘病毒M基因片段的擴(kuò)增

參照GenBank中漢灘病毒76-118株M基因核苷酸序列設(shè)計(jì)并合成1對(duì)引物，同時(shí)在引物兩端分別加入MluⅠ和 XbaⅠ酶切位點(diǎn)。上游引物為5'-CGACGCGTATGGGGATATGGAAGTGGC-3'，下游引物為5'-GCTCTAGACTATGATTTTTTATGCTT CCTTACGGG-3'。以含有漢灘病毒M基因的質(zhì)粒pcDNA3.1-M為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（反應(yīng)條件：95℃ 預(yù) 變 性 10min，以 95℃ 30s、54℃ 30s、72℃ 2.5min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min）。

1.3 CD40L基因片段的擴(kuò)增

參照GenBank中小鼠CD40L基因序列設(shè)計(jì)并合成1對(duì)引物，在引物兩端分別加入StuⅠ和Csp45Ⅰ酶切位點(diǎn)。上游引物為5'-GAAGGCCTA TGATAGAAACATACAGCCAACCTTCCCCC-3'，下游引物為5'-GGGTTCGAATCAGAGTTTGAGTAAG CCAAAAGATGAGAAG-3'。將CD40L基因從StuⅠ和Csp45Ⅰ兩個(gè)位點(diǎn)插入pCI-neo-M載體替換neo基因，確保CD40L基因與M基因在該載體上同時(shí)表達(dá)。

1.4 pCI-neo-M-CD40L在真核細(xì)胞中的表達(dá)及鑒定

采用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒于體外轉(zhuǎn)染至已長(zhǎng)至單層的CHO-K1細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48h取出細(xì)胞爬片，沖洗后分別與一抗（抗HTNV GP鼠單克隆抗體，兔抗小鼠CD40L多克隆抗體）及二抗（FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG和Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG）結(jié)合，最后與DAPI染液結(jié)合（細(xì)胞核定位染液），同時(shí)設(shè)對(duì)照組。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pCI-neo-M的構(gòu)建及鑒定

以pcDNA3.1-M質(zhì)粒為模板擴(kuò)增M全長(zhǎng)基因，純化后的PCR產(chǎn)物與pCI-neo載體相連，挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)MluⅠ和 XbaⅠ雙酶切后凝膠電泳得到約3400bp的目的片段（圖1），與預(yù)期相符，測(cè)序證實(shí)該載體構(gòu)建成功。

2.2 重組質(zhì)粒pCI-M-CD40L的構(gòu)建及鑒定

圖1 重組質(zhì)粒pCI-neo-M酶切鑒定結(jié)果

從活化的小鼠脾細(xì)胞中克隆CD40L基因，純化后的PCR產(chǎn)物與pCI-neo-M載體相連，挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)StuⅠ和Csp45Ⅰ雙酶切后凝膠電泳得到約783bp的目的片段（圖2），與預(yù)期相符，測(cè)序證實(shí)該載體構(gòu)建成功。表明構(gòu)建了帶有小鼠CD40L基因的漢灘病毒糖蛋白真核表達(dá)載體（圖3）。

2.3 重組質(zhì)粒pCI-M-CD40L表達(dá)糖蛋白和細(xì)胞因子CD40L的檢測(cè)

將重組質(zhì)粒pCI-M-CD40L轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，48h后用間接免疫熒光法（indirect immuno?fluorescence assay，IFA）檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖4，GP、CD40L均有表達(dá)且GP與CD40L可共定位。

圖2 重組質(zhì)粒pCI-M-CD40L酶切鑒定結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒pCI-M-CD40L構(gòu)建示意圖

圖4 重組質(zhì)粒pCI-M-CD40L轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的間接免疫熒光結(jié)果（×400）

3 討論

漢灘病毒在我國(guó)主要引起腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS），該病危害極為嚴(yán)重，目前尚無(wú)特效治療藥物，主要使用疫苗進(jìn)行預(yù)防[4]。

CD40L主要表達(dá)于活化的CD4+T細(xì)胞表面，而CD40表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cells，ATC）（樹突細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）上。CD40L與CD40的結(jié)合，一方面促進(jìn)APC活化，促進(jìn)共刺激分子表達(dá)和細(xì)胞因子的分泌；另一方面，由于APC表達(dá)共刺激分子和分泌促進(jìn)T細(xì)胞分化的細(xì)胞因子，也促進(jìn)T細(xì)胞的活化，活化的Th細(xì)胞表達(dá)的CD40L與B細(xì)胞表面的CD40結(jié)合可促進(jìn)B細(xì)胞的增殖、分化，抗體生成和抗體類別轉(zhuǎn)換。CD40L已作為一些病毒DNA疫苗的免疫佐劑[5-6]。

漢灘病毒糖蛋白的免疫學(xué)特性為其成為漢灘病毒核酸疫苗的候選基因提供了理論依據(jù)。因此，我們以pCI-neo為載體構(gòu)建了含包膜糖蛋白基因的真核表達(dá)載體，在該載體中加入了可增強(qiáng)小鼠免疫刺激作用的CD40L基因，從而增強(qiáng)此真核表達(dá)載體對(duì)動(dòng)物的免疫效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明真核表達(dá)載體pCI-M-CD40L構(gòu)建成功，并且漢灘病毒包膜糖蛋白和CD40L可同時(shí)在真核細(xì)胞中獲得表達(dá)，證明了該重組體作為漢灘病毒核酸疫苗的可行性，從而為進(jìn)一步的動(dòng)物免疫及漢灘病毒多價(jià)核酸疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

[1] Muyangwa M,Martynova E V,Khaiboullina S F,et al.Hantaviral proteins:structure,functions,and role in Hantavirus infection[J].FrontMicrobiol,2015,6:1326.

[2] Yoshimatsu K,Yoo Y C,Yoshida R,et al.Protective immunity of Hantaan virus nucleocapsid and envelope protein studied using baculovirus-expressed protein[J].Arch Virol,1993,130（3-4）:365-376.

[3] Barr T A,Carlring J,Heath A W.Co-stimulatory ago?nists as immunological adjuvants[J].Vaccine,2006,24（17）:3399-3407.

[4] Jiang H,Du H,Wang L M,et al.Hemorrhagic fever with renal syndrome:pathogenesis and clinical picture[J].Front Cell Infect Microbiol,2016,6:1.

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CNKI推出《中國(guó)高被引圖書年報(bào)》

日前，中國(guó)知網(wǎng)（CNKI）中國(guó)科學(xué)文獻(xiàn)計(jì)量評(píng)價(jià)研究中心推出了一套《中國(guó)高被引圖書年報(bào)》，該報(bào)告基于中國(guó)大陸建國(guó)以來(lái)出版的422萬(wàn)余本圖書被近3年國(guó)內(nèi)期刊、博碩、會(huì)議論文的引用頻次，分學(xué)科、分時(shí)段遴選高被引優(yōu)秀學(xué)術(shù)圖書予以發(fā)布。據(jù)研制方介紹，他們統(tǒng)計(jì)并分析了2013-2015年中國(guó)學(xué)術(shù)期刊813萬(wàn)余篇、中國(guó)博碩士學(xué)位論文101萬(wàn)余篇、中國(guó)重要會(huì)議論文39萬(wàn)余篇，累計(jì)引文達(dá)1451萬(wàn)條。根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，422萬(wàn)本圖書至少被引1次的圖書達(dá)72萬(wàn)本。研制方根據(jù)中國(guó)圖書館分類法，將72萬(wàn)本圖書劃分為105個(gè)學(xué)科，分1949-2009年和2010-2014年兩個(gè)時(shí)間段，分別遴選被引最高的TOP 10％圖書，共計(jì)選出70911本優(yōu)秀圖書收入《中國(guó)高被引圖書年報(bào)》。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，這7萬(wàn)本高被引優(yōu)秀圖書雖然只占全部圖書的1.68％，卻獲得67.4％的總被引頻次，可見(jiàn)這些圖書質(zhì)量上乘，在同類圖書中發(fā)揮了更加重要的作用。該報(bào)告還首次發(fā)布各學(xué)科“學(xué)科h指數(shù)”排名前20的出版單位的評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)客觀評(píng)價(jià)出版社的社會(huì)效益——特別是學(xué)術(shù)出版物的社會(huì)效益具有重要的參考價(jià)值。

該報(bào)告從圖書被引用的角度出發(fā)，評(píng)價(jià)圖書的學(xué)術(shù)影響力，彌補(bǔ)了以銷量和借閱等指標(biāo)無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)價(jià)學(xué)術(shù)圖書的缺憾，科學(xué)、客觀地評(píng)價(jià)了圖書、圖書作者以及出版單位對(duì)各學(xué)科發(fā)展的貢獻(xiàn)。

《中國(guó)高被引圖書年報(bào)》把建國(guó)以來(lái)出版圖書全部納入評(píng)價(jià)范圍屬國(guó)內(nèi)首創(chuàng)，是全面、客觀評(píng)價(jià)圖書學(xué)術(shù)影響力的工具，填補(bǔ)了目前圖書學(xué)術(shù)水平定量評(píng)價(jià)的空白，在幫助圖書館建設(shè)特色館藏和提高服務(wù)水平、幫助出版管理部門了解我國(guó)學(xué)術(shù)出版物現(xiàn)狀、幫助科研機(jī)構(gòu)科研管理、幫助讀者購(gòu)買和閱讀圖書等方面，均具有較強(qiáng)的參考價(jià)值，也為出版社評(píng)估出版業(yè)績(jī)、決策再版圖書、策劃學(xué)科選題提供有用的信息。

《中國(guó)高被引圖書年報(bào)》由《中國(guó)學(xué)術(shù)期刊（光盤版）》電子雜志社有限公司出版。該產(chǎn)品的形式為光盤電子出版物，分為理學(xué)、工學(xué)、農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)、人文科學(xué)和社會(huì)科學(xué)6個(gè)分卷，隨盤贈(zèng)送圖書，歡迎您咨詢、訂購(gòu)。咨詢電話：010-82710850，82895056轉(zhuǎn)8599；email：aspt@cnki.net。

Construction of Hantaan Virus Envelope Glycoprotein Ex?pression Vector Added with Mouse CD40L Gene

FENG Wei1,ZHANG Yao1,ZHANG Xiao-Xiao2,YING Qi-Kang2,LIU Zi-Yu2,WU Xing-An2,WANG Fang2*
1.Cadet,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032;2.Department of Microbiology,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032;China
*Corresponding author,E-mail:wangf07@fmmu.edu.cn

Objective:The eukaryotic expression vector of Hantaan virus glycoprotein was constructed and added with mouse CD40L gene that could strengthen mouse immune response,in order to detect whether or not it could express in the eukaryotic cell.Methods&Results:Primers were designed referring to M gene sequence of Hanta?an virus and mouse CD40L gene in the GenBank.Then M gene and mouse CD40L gene were obtained through PCR,and cloned into eukaryotic expressing vector pCI-neo vector.After sequenced,the eukaryotic expressing vec?tor was transfected into eukaryotic cells CHO-K1 with liposome method.It was found that specific fluorescence appeared in the CHO-K1 after transfection by indirect immunofluorescence assay（IFA）.Conclusion:The results showed that the eukaryotic expressing vector of Hantaan virus glycoprotein conjugated with mouse CD40L was suc?cessfully constructed and expressed,to deeply investigate the immune response of Hantaan virus glycoprotein.

Hantaan virus;envelope glycoprotein;CD40 ligand（CD40L）

Q78;R392.1

A

1009-0002（2017）04-0499-04

2017-01-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（31470890，31270978）；軍隊(duì)重點(diǎn)課題（BWS13G）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃（2013KTCL03-06）

馮偉（1994- ），男，本科在讀，（E-mail）905597943@qq.com

王芳，（E-mail）wangf07@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.018