偽狂犬病病毒單克隆抗體制備及特征分析

葉華虎，陳建宇,2，周小軍，王進，代艷艷，韓宇，劉珩，袁菊芳

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 實驗動物中心，北京 100071；2.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021

偽狂犬病病毒單克隆抗體制備及特征分析

葉華虎1，陳建宇1,2，周小軍1，王進1，代艷艷1，韓宇1，劉珩1，袁菊芳1

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 實驗動物中心，北京 100071；2.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021

目的：制備偽狂犬病病毒（PRV）單克隆抗體，為PVR防控奠定基礎(chǔ)。方法：用PRV疫苗毒株Bartha-k61免疫小鼠，取免疫小鼠脾臟B淋巴細胞與SP2/0細胞融合，用酶聯(lián)免疫吸附實驗篩選陽性雜交瘤細胞并制備腹水，用病毒中和實驗檢測單克隆抗體（腹水）對PRV的中和作用。結(jié)果：通過細胞融合，共得到11株針對PRV的雜交瘤細胞。中和實驗結(jié)果顯示，無論是對于PRV弱毒株Bartha-k61還是強毒株AV25，2株雜交瘤細胞產(chǎn)生的腹水都表現(xiàn)為明顯的中和效應(yīng)；但2株單抗的中和能力不同，其中1株雜交瘤細胞腹水的中和效價為1∶16～1∶32，另1株的效價為1∶4。交叉反應(yīng)顯示，11株單克隆抗體中，2株與單純性皰疹病毒存在明顯的免疫反應(yīng)，1株與猴B病毒的gD蛋白存在明顯交叉反應(yīng)。結(jié)論：制備了PRV的單克隆抗體，并獲得了對PRV具有中和作用的單克隆抗體，以及能與其他皰疹病毒交叉反應(yīng)的單克隆抗體。

偽狂犬病病毒；單克隆抗體；中和抗體；交叉反應(yīng)

偽狂犬?。╬seudorabies，PR），又稱 Aujeszky病，是由偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的一種豬的急性、傳染性疾病，主要表現(xiàn)為母豬繁殖障礙、發(fā)熱，以及仔豬急性死亡等癥狀。其中，仔豬的病死率極高，最高可達100％。除豬外，PRV也同樣能感染牛、羊等多種家畜以及家禽和野生動物等，發(fā)病動物表現(xiàn)為急性傳染性疾病特征[1-3]。

偽狂犬病的臨床診斷并不復(fù)雜，通過典型臨床癥狀及流行病學(xué)特征即可確認。雖然近年來隨著疾病的持續(xù)發(fā)生，臨床表現(xiàn)向非典型轉(zhuǎn)化，但ELISA診斷試劑、膠體金試紙條、間接免疫熒光及分子診斷（主要是PCR）等方法的先后建立[4-6]，極大地提高了疾病診斷的準(zhǔn)確性。

但是，PRV的治療目前仍是世界性難題。在世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達國家，通過疫苗免疫接種、母豬野毒感染監(jiān)測和凈化，使該病得到了有效控制。而我國，盡管免疫接種受到高度重視并廣泛實施，但由于免疫接種時機、持續(xù)監(jiān)測手段、設(shè)施布局及飼養(yǎng)管理水平等原因，PRV時有發(fā)生甚至暴發(fā)，特別是自2011年以來，PRV在全國規(guī)模化豬場再次大面積暴發(fā)，由此引起的仔豬高死亡率給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[7]?？梢?，有效的PRV治療手段仍是我國養(yǎng)豬業(yè)面臨的巨大挑戰(zhàn)。

業(yè)已證實，中和抗體是PRV感染動物治療的特效藥物。國外已有中和抗體的制備及研究報道[8]，國內(nèi)學(xué)者針對PRV及其不同分子的抗體研究也開展了大量工作，如相繼得到針對PRV的gB、gE、gD等分子的單克隆抗體，被證實可能用于病毒檢測[9]；孟日增等利用超濃縮PRV通過免疫家兔制備的高效價多抗，被證實對病毒具有中和作用，且中和效價約為1∶16[10]。

但影響抗血清制備的因素很多，因而難以保證批次間的中和效果。我們以當(dāng)前應(yīng)用最廣的疫苗用PRV弱毒株Bartha-k61免疫小鼠，制備單克隆抗體，期望獲得廣譜的PRV中和抗體，為PRV防控提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心生產(chǎn)；SP2/0細胞、BHK-21細胞、單純性皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）HSV-1和HSV-2為本室保存；PRV Bartha-k61株由北京市農(nóng)林科學(xué)院李永清教授惠贈；PRV強毒株AV25購于中國獸藥監(jiān)測所；HAT培養(yǎng)基、HT、PEG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑等購于Sigma公司；RPMI-1640、DMEM/F12（1∶1，簡稱 DF）培養(yǎng)基，胎牛血清，青霉素，鏈霉素等購于Gibco公司；高結(jié)合能力酶標(biāo)板購于Nunc公司；羊抗鼠IgG標(biāo)記抗體購于康為生物試劑公司；TMB單組分顯色液購于湖州英創(chuàng)生物技術(shù)公司。

1.2 PRV的制備

將Bartha-k61接種于BHK-21細胞，待細胞完全病變后，將其凍融3次，高速離心（12 000r/min）收集細胞上清，然后超高速離心（11 000×g）濃縮病毒，最后通過蔗糖密度梯度離心進一步純化病毒。

1.3 小鼠免疫

將弗氏完全佐劑與Bartha-k61充分混合均勻并形成油乳劑，分點皮下注射于3只3～4周齡BALB/c小鼠（100μL/只）；2周后，用相同劑量的病毒與弗氏不完全佐劑混勻進行加強免疫，加強免疫共2次；最后一次加強免疫7d后，采鼠尾血檢測血清抗體效價；選擇效價≥1∶12 000（ELISA）的小鼠直接腹腔注射同等劑量的病毒，3d后無菌取小鼠脾臟，用于細胞融合。

1.4 細胞融合

無菌條件下取小鼠脾臟并去脂，用無菌生理鹽水和RPMI-1640分別洗滌；將脾臟放入滅菌的200目濾網(wǎng)，用注射器芯擠壓釋放其中的脾淋巴細胞；加入5mL RPMI-1640洗滌濾網(wǎng)，過濾后的脾細胞用巴斯吸管輕輕吹打，加入30mL RPMI-1640，1200r/min離心；收集培養(yǎng)好的SP2/0細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基1200r/min離心洗滌1次；將2種細胞（比例為1∶3～1∶6）混合，加入RPMI-1640到30mL，1200r/min離心6min洗滌2次，棄上清；在臺面上輕輕敲打細胞沉淀使其混勻；采用滴加方式緩慢加入1mL PEG（邊加邊混勻），最后在約5min內(nèi)輕緩加入預(yù)熱的RPMI-1640培養(yǎng)基29mL；800r/min離心6min，棄上清；加入含20％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基約50mL，用巴斯吸管輕輕吹打混勻，制備鋪板。

鋪板前2d無菌收集小鼠腹腔細胞，制備滋養(yǎng)層細胞；將融合處理的細胞加入滋養(yǎng)層細胞中，每孔 100μL；第 2d加 5×HAT 培養(yǎng)基 50μL（用含20％FBS的RPMI-1640配制），繼續(xù)培養(yǎng)2～3d；采用半換量加入HT/HAT（1∶1）培養(yǎng)基（用含20％FBS的 RPMI-1640配制，0.5×HAT和 0.5×HT）；2～3周后，用含 20％FBS和 1×HT的 RPMI-1640培養(yǎng)基換液，直到雜交瘤細胞長出；待雜交瘤細胞鋪滿孔的一半及以上時，取上清用于ELI?SA檢測。

1.5 雜交瘤細胞檢測

超濃縮的Bartha-k61用碳酸鹽緩沖液（CBS，pH9.6）稀釋至 1/100并包被，每孔 100μL，4℃過夜；酶標(biāo)板用含0.5％BSA、0.2％水解酪蛋白的PBS封閉1h；加雜交瘤細胞培養(yǎng)上清100μL，37℃孵育40min，PBST洗滌3次，5min/次；加入1∶5000稀釋的HRP山羊抗小鼠IgG（以含0.5％BSA 的 PBST稀釋）每孔 100μL，37℃孵育 35min，PBST 洗滌 3次，5min/次；加入單組分 TMB液100μL，37℃避光15min；最后加入終止液（2 mol/L H2SO4）50μL，在測量波長為 450nm、參比波長為620nm下測定D值，D值大于3倍陰性對照平均值為閾值，篩選陽性雜交瘤細胞。

1.6 雜交瘤細胞單克隆化

根據(jù)ELISA檢測結(jié)果，取D值最高的24個孔中的雜交瘤細胞轉(zhuǎn)入24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞鋪滿一半以上時繼續(xù)進行ELSIA檢測。對D值高的細胞進行無限稀釋，接種于96孔板，待單克隆長出后檢測。對來源于最初孔的細胞，每個挑選1個單克隆且D值高的細胞通過24孔板、6孔板和25mL培養(yǎng)瓶逐級放大培養(yǎng)，用于生產(chǎn)腹水。

1.7 雜交瘤細胞腹水制備

給6～8周齡以上的BALB/c雌性小鼠腹腔注射滅菌石蠟油0.5mL/只，12～15d后腹腔接種雜交瘤細胞 1×106～2×106/只，收集腹水。

1.8 單克隆抗體的中和作用測定

對腹水進行總蛋白測定，用PBS調(diào)整蛋白濃度為2.5 mg/mL；用含3％FBS及PRV為100倍TCID50的DMEM/F12培養(yǎng)基對其進行系列稀釋，37℃孵育1h；將處理好的病毒-抗體液加入BHK-21細胞鋪板的96孔板，每個稀釋度4個復(fù)孔，每24h觀察記錄細胞病變。以抗犬細小病毒（canine parvoviurs，CPV）雜交瘤細胞生產(chǎn)的單克隆抗體（腹水）為對照。

1.9 單克隆抗體的交叉反應(yīng)性

用前述病毒制備方法獲得的HSV-1和HSV-2濃縮液，以及實驗室前期純化的猴B病毒（B vi?rus，BV）gD重組蛋白包板，對8株單克隆抗體進行ELISA檢測（方法同前），了解PRV單克隆抗體與同源病毒（或分子）的交叉反應(yīng)性。

2 結(jié)果

2.1 PRV雜交瘤細胞制備及單克隆化

將PRV免疫小鼠脾臟淋巴細胞與SP2/0細胞融合后，接種于5塊96孔細胞培養(yǎng)板，經(jīng)篩選培養(yǎng)，共有136個孔長出了雜交瘤細胞；ELISA結(jié)果顯示，87個孔中的細胞上清都與PRV有明顯的抗原-抗體反應(yīng)，但各孔的D值存在明顯差異，說明其中的抗體量不同。

根據(jù)細胞密度及ELISA所測D值，實驗選取了24個高抗體分泌量的細胞進行單克隆化。即先將其轉(zhuǎn)入24孔板培養(yǎng)，同時對上清進行檢測，其后將穩(wěn)定分泌抗體的細胞通過有限稀釋法接種于96孔板，進行單克隆化。最后，從最初來源的各個孔中，每種細胞挑選1個單克隆化且穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株。根據(jù)細胞狀態(tài)、生長速度、ELISA檢測D值的穩(wěn)定性，最終獲得了11株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株。

2.2 腹水制備及測定

將挑選的11株雜交瘤細胞由24孔板、6孔板和25mL培養(yǎng)瓶逐級放大培養(yǎng)，收集細胞，用RP?MI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為5×106～8×106/mL，腹腔接種于注射石蠟油的BALB/c雌性小鼠，每只0.2mL，收集腹水（在細胞注射后12～18d產(chǎn)生），測定腹水體積，用NanoDrop2000測定總蛋白濃度，ELISA測定效價，結(jié)果見表1，不同雜交瘤細胞的腹水平均產(chǎn)量、蛋白濃度及ELISA效價不同。

2.3 單克隆抗體對PRV的中和作用

將11株雜交瘤細胞生產(chǎn)的腹水分別用含3％牛血清的DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基進行梯度稀釋，并加入終濃度為100倍TCID50的Bartha-k61弱毒或AV25強毒，于37℃作用1h，接種于BHK-21細胞，每個稀釋度接種4孔，同時以CPV單克隆抗體（腹水）為對照。結(jié)果，2種病毒株在CPV抗體組和不加抗體的陽性對照組于接種后24h即可見零星的細胞病變；48h，所有孔的細胞都出現(xiàn)病變，但CPV組的1/2稀釋孔細胞病變較輕；72或96h，即使CPV組的1/2稀釋孔細胞50％以上都出現(xiàn)病變，其他稀釋組和陽性對照所有孔中80％以上細胞發(fā)生病變（圖2A、C）。而PRV單克隆抗體組的細胞病變與單克隆株及稀釋率有關(guān)，其中單克隆抗體株5C9接毒后96h，在1/2、1/4、1/8稀釋度無細胞病變，1/16稀釋度有1孔出現(xiàn)病變，1/32稀釋度有2孔出現(xiàn)細胞病變，但細胞病變程度較輕，僅見小病變灶，周圍細胞正常（圖2D、E）；1/64稀釋度的4個孔全部出現(xiàn)病變。3C9株的1/2、1/4稀釋度無細胞病變，1/8稀釋度及以上全部孔病變。其余單克隆株接毒96h，僅在1/2稀釋度有部分孔未出現(xiàn)病變，Bartha-k61弱毒株和AV25強毒株的病變情況基本一致。該結(jié)果表明，單克隆抗體株5C9對PRV有較好的中和作用，其中和效價為1∶16～1∶32，而3C9株的中和作用較弱，效價為1∶4。

表1 PRV單克隆抗體（腹水）的特征

2.4 PRV單克隆抗體的交叉反應(yīng)性

圖1 獲得的單克隆化雜交瘤細胞株

圖2 PRV單克隆抗體對病毒的中和作用

分別用HSV-1、HSV-2和BV gD重組蛋白包被板，對11株單克隆抗體進行ELISA檢測。結(jié)果，單克隆抗體1A5株與gD存在明顯的免疫反應(yīng)，其D值為0.836，而單克隆抗體2D8和4B8能同時與HSV-1和HSV-2反應(yīng)。

圖3 PRV單克隆抗體（腹水）與其他同源病毒及分子的交叉反應(yīng)

3 討論

PRV是皰疹病毒科α皰疹病毒屬成員，與該科其他病毒一樣，PRV具有嗜神經(jīng)性，動物一旦感染，病毒可在神經(jīng)節(jié)中長期潛伏，感染動物因此終生可能成為潛在的疫源?？梢?，動物種群凈化是疾病防控的根本[7,11]。

在西方養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達國家，由于該病發(fā)現(xiàn)早、相關(guān)研究較為深入、檢測和監(jiān)測及凈化措施到位、免疫接種合理，PRV的防控較為有效，豬群流行或暴發(fā)PRV較少發(fā)生。但是，在諸如我國等養(yǎng)殖業(yè)不發(fā)達國家，由于檢測和監(jiān)測手段不力、種群凈化工作滯后，PRV在豬場時有發(fā)生甚至暴發(fā)，并造成巨大的經(jīng)濟損失。PRV因此在我國與豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒、口蹄疫病毒等并稱為養(yǎng)豬業(yè)的重要病原。

鑒于PRV的嚴(yán)重危害，近年來國內(nèi)學(xué)者對PRV的研究非常重視，并在疫苗研發(fā)及診斷方法等研究上取得了良好進展[2,4,12]。但由于毒株變異及種群凈化緩慢等原因，對發(fā)病豬的控制，特別是發(fā)病仔豬的死亡仍然束手無策[13-14]。本實驗以當(dāng)前廣泛使用的PRV疫苗毒株Bartha-k61為免疫原，通過細胞融合和多次ELISA篩選，獲得了11株穩(wěn)定生產(chǎn)抗體的單克隆細胞株。對11株單抗的基本特征分析發(fā)現(xiàn)，不同細胞株的腹水產(chǎn)量及腹水的蛋白含量存在較大差異，如3C9株的產(chǎn)量平均為4.2mL/只，而1C6株僅為0.9mL/只；就蛋白濃度而言，5H6為37.9 mg/mL，而2D8僅為19.9 mg/mL。表明雜交瘤細胞的差異性不僅影響抗體性質(zhì)，而且對抗體生產(chǎn)同樣起著決定作用。

最有意義的是，對11株單抗的中和作用評價顯示，2株單抗對PRV都有中和作用，且對PRV弱毒株（Bartha-k61）和強毒株（AV25）中和效價一致。表明該抗體作用部位既是參與病毒感染的重要功能區(qū)，也是相對保守的區(qū)域。其中，5C9的中和效價接近1∶32，而3C9的中和效價只有1∶4。就作者所掌握的文獻資料而言，Wathen早在1985年即報道了PRV的中和性單抗制備[8]，但不清楚單抗的中和效價。國內(nèi)學(xué)者雖然有較多關(guān)于PRV及其分子的單抗制備研究，但未見中和性單抗成功制備的報道。孟日增等以超濃縮（超高速離心）PRV閩A株免疫家兔，制備了高ELISA效價（1∶32 000）的抗血清，且對病毒具有中和作用，其中和效價為1∶16[10]，略低于本實驗所得到的5C9單抗細胞株。而其他作者報道，利用分離得到的PRV野毒或病毒的重組蛋白免疫動物，抗血清的中和效價最高接近1∶1000[15-16]。明顯高于本實驗的單克隆抗體及孟日增的結(jié)果。我們推測，中和效價的巨大差異可能不僅與抗血清本身有關(guān)，還可能與評價過程中使用的細胞系及病毒有關(guān)。但高效價抗血清制備過程繁瑣，且容易受免疫程序中多個環(huán)節(jié)的影響。而本實驗篩選得到的中和單抗細胞株，在中和抗體制備上具有明顯的比較優(yōu)勢。

業(yè)已證實，α皰疹病毒屬成員在病毒結(jié)構(gòu)、感染機制、病毒受體等方面高度相似[17-19]。本實驗進一步將獲得的11株P(guān)RV單抗分別與HSV-1、HSV-2和重組猴B病毒gD蛋白進行ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)2株單抗（2D8和4B8）同時與HSV-1和HSV-2存在交叉反應(yīng)，而1株單抗（1A5）與gD存在明顯交叉反應(yīng)。理論上，這些單抗所針對的表位在不同病毒中高度保守，而進化論認為，在物種進化過程中，保守部位通常是重要的功能區(qū)。但這些具有交叉作用的抗體對PRV都未表現(xiàn)中和活性。上述特征是否是病毒逃避免疫監(jiān)視的機制之一[20-21]，尚不清楚。

總之，我們成功制備了PRV的多株單克隆抗體，并篩選到對病毒具有較高中和作用的單抗，為PRV的防控奠定了堅實基礎(chǔ)。

[1] Smith G.Herpesvirus transport to the nervous system and back again[J].Annu Rev Microbiol,2012,66:153-176.

[2] Dong B,Zarlenga D S,Ren X.et al.An overview of live attenuated recombinant pseudorabies viruses for use as novel vaccines[J].J Immunol Res,2014,2014:824630.

[3] Owen D J,Crump C M,Graham S C.Tegument as?sembly and secondary envelopment of alphaherpesvirus?es[J].Viruses,2015,7（9）:5084-5114.

[4] Li X,Sun Y,Yang S,et al.Development of an immu?nochromatographic strip for antibody detection of pseu?dorabies virus in swine[J].J Vet Diagn Invest,2015,27（6）:739-742.

[5] Meng X Y,Luo Y,Liu Y,et al.A triplex real-time PCR for differential detection of classical,variant and Bartha-k61 vaccine strains of pseudorabies virus[J].Arch Virol,2016,161（9）:2425-2430.

[6] Serena M S,Geisler C,Metz G E,et al.Expression and purification of suid herpesvirus-1 glycoprotein E in the baculovirussystem and itsuse to diagnose Aujeszky's disease in infected pigs[J].Protein Expr Pu?rif,2013,90（1）:1-8.

[7]Sun Y,Luo Y,Wang C H,etal.Controlof swine pseudorabies in China:opportunities and limita?tions[J].Vet Microbiol,2016,183:119-124.

[8] Wathen L M,Platt K B,Wathen M W,et al.Produc?tion and chraracterization of monoclonal antibodies di?rected against pseudorabies virus[J].Virus Res,1985,4（1）:19-29.

[9] 孫海鳳,顧真慶,董靜,等.偽狂犬病病毒gB和gE蛋白單克隆抗體的制備與鑒定[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2015,45（3）:247-252.

[10]孟日增,劉韜,馬文,等.豬偽狂犬病病毒多克隆抗體的制備及免疫學(xué)活性研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2015,42（6）:1417-1423.

[11]LipowskiA. Evaluation ofefficacy and safety of Aujeszky's disease vaccines[J].Pol J Vet Sci,2006,9（1）:75-79.

[12]Wang C H,Yuan J,Qin H Y,et al.A novel gE-de?leted pseudorabies virus（PRV）provides rapid and com?plete protection from lethal challenge with the PRV variant emerging in Bartha-k61-vaccinated swine popu?lation in China[J].Vaccine,2014,32（27）:3379-3385.

[13]黃元,陳晶,趙翠玲,等.偽狂犬病病毒變異株的鑒定及偽狂犬病的防控[J].中國畜牧獸醫(yī),2016,43（9）:2461-2467.

[14]童武,鄭浩,單同領(lǐng),等.偽狂犬病毒變異株（JS-2012）對仔豬的致病性研究[J].中國動物傳染病學(xué)報,2014,5:10-14.

[15]彭金美,安同慶,趙鴻遠,等.豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2013,35（1）:1-4.

[16]劉飛,童武,梁超,等.豬偽狂犬病毒gB、gC和gD蛋白多抗制備及交叉中和抗體效價測定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2016,38（1）:73-76.

[17]Abad C L,Razonable R R.α-Herpes virus infections among renaltransplantrecipients[J].Semin Nephrol,2016,36（5）:344-350.

[18]James S H,Prichard M N.Current and future thera?piesfor herpes simplex virus infections:mechanism of action and drug resistance[J].Curr Opin Virol,2014,8:54-61.

[19]KramerT,EnquistL W.Alphaherpesvirus infection disrupts mitochondrialtransport in neurons[J].Cell Host Microbe,2012,11（5）:504-514.

[20]Horst D,Verweij M C,Davison A J,et al.Viral eva?sion of T cell immunity:ancient mechanisms offering new applications[J].CurrOpin Immunol,2011,23（1）:96-103.

[21]Le-Trilling V T,Trilling M.Attack,parry and riposte:molecular fencing between the innate immune system and humanherpesviruses[J].Tissue Antigens,2015,86（1）:1-13.

Preparation and CharacterizationofMonoclonalAntibody Against Pseudorabies Virus

YE Hua-Hu1,CHEN Jian-Yu1,2,ZHOU Xiao-Jun1,WANG Jin1,DAI Yan-Yan1,HAN Yu1,LIU Heng1,YUAN Ju-Fang1*
1.Laboratory Animal Center,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071;2.College of Life Sciences,Inner Mongolia University,Hohhot 010021;China
*Corresponding author,E-mail:yjf1014@tom.com

Objective:In order to control the harm of pseudorabies virus（PRV）,monoclonal antibodies against PRV were produced and analyzed.Methods:Mice were immunized with PRV Bartha-k61 strain and then its spleen B lymphocytes were separated and fused with SP2/0 cells.The positive hybridoma cells were screened out by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） and used to produce ascites.The neutralizing effect of monoclonal antibodies on PRV were detected by virus neutralization experiment.Results:A total of 11 hybridoma cells lines were obtained after the treatment of cell fusion and screening.The results of virus neutralization test showed that the ascites produced by two hybridoma cell lines blocked BHK-21 cells infection by PRV attenuated strain Bar?tha-k61 and virulent strain AV25.However,the ability of neutralization effect was different between the two mono?clonal antibodies.For monoclonal antibodies 5C9,the neutralization titer was 1∶16～1∶32 and only 1∶4 was in monoclonal antibodies 3C9.In addition,among the 11 monoclonal antibodies,2 showed obvious immunoreactionwith herpes simplex virus type 1 and type 2,and 1 showed a significant cross-reactivity with recombinant gD pro?tein of monkey B virus.Conclusion:Monoclonal antibodies against PRV were successfully prepared and the mono?clonal antibodies with neutralization effect was screened out.In addition,we found that some monoclonal antibod?ies could cross-react with other herpes viruses.

pseudorabies virus;monoclonal antibodies;neutralization effect;cross-reactivity

Q78;R392.1

A

1009-0002（2017）04-0441-06

2017-01-03

國家科技支撐計劃（2015BAI08B03）；國家自然科學(xué)基金（31272514，31501908）

葉華虎（1970- ），男，博士，（E-mail）huahuy512@126.com

袁菊芳，（E-mail）yjf1014@tom.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.007