穩(wěn)定表達GFP-Parkin融合蛋白的SH-SY5Y細胞系的建立和功能初探

趙海洲，莫燦坤，林展樂，劉文華

肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061

穩(wěn)定表達GFP-Parkin融合蛋白的SH-SY5Y細胞系的建立和功能初探

趙海洲，莫燦坤，林展樂，劉文華

肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061

目的：建立穩(wěn)定表達GFP-Parkin的SH-SY5Y細胞系，并檢測Parkin對MPP+引起的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用。方法：將Parkin編碼序列克隆到載體pEGFP-C1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-Parkin，轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞，通過G418篩選，建立穩(wěn)定表達GFP-Parkin的SH-SY5Y細胞系；熒光顯微鏡和Western印跡鑒定Parkin表達，MTT法檢測Parkin對MPP+致細胞損傷的保護作用。結(jié)果：酶切鑒定及測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒pEGFP-Parkin構(gòu)建正確；熒光顯微鏡下可見細胞內(nèi)有GFP-Parkin的融合表達，Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量79×103的蛋白條帶；MTT結(jié)果顯示Parkin能夠減弱MPP+對SH-SY5Y細胞的損傷，與對照組相比，存活率高約15％，差異顯著（P＜0.05）。結(jié)論：構(gòu)建了穩(wěn)定表達GFP-Parkin的SH-SY5Y細胞系，為進一步研究Parkin的細胞保護作用和其他功能機制奠定了基礎(chǔ)。

Parkin蛋白；SH-SY5Y細胞；穩(wěn)定表達；MPP+

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是第二大常見的神經(jīng)退行性疾病，主要特征表現(xiàn)為靜止性震顫、肌僵直、姿勢異常及記憶力減退等。85％～90％的帕金森病患者呈散發(fā)性，其發(fā)病與農(nóng)藥、重金屬等環(huán)境因素息息相關(guān)[1]。此外，帕金森病也存在家族遺傳性，5％～15％的帕金森病患者由單基因家族遺傳方式引起，這些基因包括Parkin（PARK2）、DJ-1（PARK7）、ATP13A2（PARK9）、PTEN-induced putative kinase 1（PINK1）、LRRK2（PARK8）和 SNCA（PARK1，4）等[2]。

Parkin基因于1998年被克隆，其突變呈現(xiàn)常染色體隱性遺傳的青少年型帕金森病（autosomal recessive juvenile parkinsonism，ARJP）[3]。該基因定位于染色體6q25.2-27，位于遺傳標記D6S305和D6S253之間，含12個外顯子，基因的開放讀框為1395bp，所編碼的蛋白Parkin含465個氨基酸殘基。Parkin基因的缺失和位點突變與ARJP相關(guān)[4-5]。Parkin是一種E3泛素連接酶，在上游基因PINK1的啟動下，Parkin可以識別異常折疊蛋白，介導(dǎo)底物蛋白泛素化，進而通過泛素-蛋白酶體途徑降解異常折疊蛋白[6]。Parkin還參與氧化應(yīng)激及線粒體的自噬、形態(tài)維持和功能調(diào)控等[7-8]。過表達Parkin可以保護MPTP或6-OHDA引起的毒性損傷[9-10]。Parkin在神經(jīng)和非神經(jīng)組織中都有表達。在腦組織中，Parkin的亞細胞定位廣泛，包括線粒體、高爾基體、突觸小泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞核等[11-13]；在培養(yǎng)的細胞中，Parkin的亞細胞定位還存在爭議[14-15]。

轉(zhuǎn)基因細胞模型是研究Parkin在細胞內(nèi)的定位、功能，以及與其他蛋白相互作用的重要工具，已廣泛用來研究Parkin與PD的關(guān)系[16-18]。以往在研究Parkin功能及其相關(guān)機制時常采用瞬時轉(zhuǎn)染，但瞬時轉(zhuǎn)染因存在轉(zhuǎn)染效率低、外源基因低表達等問題，而不利于精確闡明Parkin在細胞中的定位、功能等。因此，建立穩(wěn)定表達細胞系有利于深入研究其功能機制。

我們構(gòu)建了穩(wěn)定表達融合蛋白GFP-Parkin的SH-SY5Y細胞系，為深入研究Parkin的定位和其他功能機制提供了可靠的細胞模型。

1 材料和方法

1.1 材料

SH-SY5Y細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢）；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS為 Gibco公司產(chǎn)品；MTT、MPP+、G418為Sigma公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒、細胞裂解液購自碧云天公司；ECL發(fā)光液購自Tanon公司；抗體GFP來自Cell Signaling Technology公司，抗體actin、PRK8購自Santa Cruz Biotechnology公司；山羊抗兔二抗購自Merk Millipore公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司；Lipo?fectAMINE 3000、蛋白marker、EB、EcoRⅠ和BamHⅠ來自Thermo Fisher Scientific公司；DNA marker購自廣州東盛生物科技有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 Parkin基因的擴增

以pCMV-Tag2B-Parkin質(zhì)粒（本實驗室保存）為模板，引物1為5'-GCGCGAATTCTATGATAGT GTTTGTCAGGTTC-3'，引 物 2 為 5'-GCGCGGATC CCTACACGTCGAACCAGTGG-3'，分別添加酶切位點EcoRⅠ和BamHⅠ，PCR擴增出人源Parkin編碼序列。

1.3 重組表達載體的構(gòu)建及鑒定

上述PCR產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠分離，用膠回收試劑盒對目的片段切膠回收，將PCR膠回收產(chǎn)物和pEGFP-C1質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，卡那霉素篩選并挑取陽性單克隆菌落，菌落于37℃培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切初步鑒定，DNA測序進一步確認。測序鑒定采用通用引物，上游引物為EGFP-Cfor（5'-AG CACCCAGTCCGCCCTGAGC-3'），下 游 引 物 為SV40-pArev（5'-GAAATTTGTGATGCTATTGC-3'）。

1.4 細胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細胞用含10％胎牛血清的無抗生素DMEM培養(yǎng)基，在恒溫37℃、含5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3d細胞傳代一次，用對數(shù)期細胞進行實驗。

1.5 穩(wěn)定表達GFP-Parkin細胞系的建立

轉(zhuǎn)染前將SH-SY5Y細胞接種于6孔板中，細胞密度為1×105/孔，待細胞生長至70％～80％融合度，用 LipofectAMINE 3000轉(zhuǎn)染 pEGFP-Parkin，同時設(shè)未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染載體pEGFP-C1的對照。轉(zhuǎn)染方法參照試劑盒說明書。轉(zhuǎn)染后48h，將細胞培養(yǎng)液更換為含600μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)基，篩選陽性克隆，之后每隔3d更換一次培養(yǎng)基（含600μg/mL G418）。

轉(zhuǎn)染3周后，對表達綠色熒光的陽性細胞用含300μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。每天在熒光顯微鏡下觀察細胞，陽性細胞用于后續(xù)實驗，部分細胞凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細胞形態(tài)學(xué)觀察

對挑選的陽性細胞每天用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照，觀察內(nèi)容包括細胞生長的快慢、突觸生長、細胞貼壁、細胞形態(tài)變化，以及細胞內(nèi)的熒光強度等。

1.7 MTT法檢測細胞存活率

SH-SY5Y細胞按1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板，鋪板后24h用于實驗。實驗設(shè)立空白組（只有培養(yǎng)基，無細胞）、對照組（不加藥物）和藥物組（1mmol/L MPP+處理）。實驗每組設(shè)3個復(fù)孔，藥物作用 48h后每孔加入200μL MTT（0.5 mg/mL），孵育4h，棄上清，加入150μL DMSO溶解甲瓚，用酶標儀測定D490nm值。細胞存活率（％）=（藥物組D490nm-空白組D490nm）/（對照組D490nm-空白組D490nm）×100％。實驗重復(fù)3次。

1.8 Western印跡檢測Parkin的表達

用6cm培養(yǎng)皿傳代培養(yǎng)細胞，待細胞達到90％～100％融合度，用PBS洗1次，將細胞刮下，12 000r/min離心1min，棄上清，加入細胞裂解液至細胞沉淀，冰上裂解細胞20min，15 000r/min離心10min后取上清。Western印跡檢測Par?kin、actin的表達，分離膠濃度10％，電泳后轉(zhuǎn)膜，加相應(yīng)的一抗（GFP、Parkin和actin）、二抗孵育，ECL法顯影，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0軟件進行，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用單因素方差分析（ANOVA）和t檢驗，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

如圖1A所示，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以看到1.4kb左右的條帶（白色箭頭所示），與預(yù)期大小相符。

本研究所構(gòu)建的pEGFP-Parkin重組質(zhì)粒是將人源Parkin編碼序列通過EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切位點插入pEGFP-C1載體。重組質(zhì)粒EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切結(jié)果如圖1B所示，可見1.4kb（目的基因大?。┖?.7kb（載體大小）2條片段，與預(yù)測結(jié)果相符，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。進一步DNA測序結(jié)果也顯示Parkin基因成功構(gòu)建于pEGFP-C1載體上，與GenBank登錄序列（AB009973）進行序列比對，序列完全一致（序列未示）。

2.2 熒光顯微鏡檢測GFP-Parkin的表達

用質(zhì)粒pEGFP-C1和pEGFP-Parkin轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞，經(jīng)G418選擇性培養(yǎng)。用熒光顯微鏡檢測穩(wěn)定表達載體質(zhì)粒pEGFP-C1的細胞（命名為SH/GFP）和穩(wěn)定表達pEGFP-Parkin的細胞（命名為SH/GFP-Parkin）的熒光情況。結(jié)果顯示（圖2），SH/GFP和SH/GFP-Parkin細胞都可以穩(wěn)定表達綠色熒光（圖2D和F），可用于后續(xù)實驗。

2.3 Western印跡檢測GFP-Parkin的表達

圖1 Parkin基因擴增和重組質(zhì)粒鑒定

分別用GFP抗體和PRK8抗體對蛋白進行檢測。GFP抗體檢測顯示（圖3A），穩(wěn)定轉(zhuǎn)染載體質(zhì)粒pEGFP-C1的SH/GFP細胞可見相對分子質(zhì)量約27×103的GFP條帶；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-Parkin的SH/GFP-Parkin細胞有相對分子質(zhì)量約79×103的蛋白條帶，與GFP-Parkin的預(yù)測相對分子質(zhì)量相符。PRK8抗體檢測也發(fā)現(xiàn)，SH/GFP-Parkin細胞可見79×103的 GFP-Parkin融合蛋白（圖3B）。這表明在蛋白水平上，Parkin基因在SH/GFP-Parkin細胞中穩(wěn)定表達。

2.4 Parkin對MPP+損傷的保護作用

MTT實驗結(jié)果（圖4A）表明，經(jīng)1mmol/L MPP+處理 48h，載體組細胞（SH/GFP）存活率為（43.9±3.9）％，穩(wěn)定表達 Parkin組細胞（SH/GFPParkin）存活率為（58.9±8.4）％，Parkin穩(wěn)定表達組細胞比載體組細胞存活率高約15％，差異顯著（P＜0.05）。這表明Parkin可以部分抑制 MPP+對SH-SY5Y的損傷。

圖4B顯示，不經(jīng)MPP+處理的正常細胞呈梭形，而SH/GFP細胞經(jīng)1mmol/L MPP+作用48h后，較多細胞皺縮變圓；SH/GFP-Parkin細胞經(jīng)1mmol/L MPP+作用48h后，較少細胞變圓。該結(jié)果與MTT實驗結(jié)果相符。

圖2 熒光檢測GFP-Parkin蛋白的穩(wěn)定表達

圖3 Western印跡檢測GFP-Parkin的表達

3 討論

Parkin蛋白的確切功能尚不明確，但已知其是一個E3泛素蛋白連接酶[19]。E3泛素蛋白連接酶是蛋白酶體降解系統(tǒng)的組成部分，主要功能是降解細胞內(nèi)不需要的或錯誤折疊的蛋白質(zhì)。

圖4 Parkin對MPP+損傷的保護作用

Parkin基因缺失和突變是ARJP發(fā)病的原因之一。Parkin保護多巴胺能細胞的機制并不十分清楚，目前一般認為Parkin通過對特定底物的降解來清除胞內(nèi)異常折疊蛋白，對細胞起到保護作用[6]。Parkin具有多種多樣的重要功能。如可維持線粒體的完整性，調(diào)節(jié)線粒體的自噬過程[7]；還可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自由基傷害導(dǎo)致的細胞死亡等[20]。另有研究顯示Parkin突變和黑色素瘤之間存在相關(guān)性[21]。Parkin過表達及Parkin轉(zhuǎn)基因動物顯示其對神經(jīng)毒素MPTP和6-OHDA引起的多巴胺神經(jīng)元損失，以及α-synuclein、A-beta對神經(jīng)元的毒性具有明顯的保護作用[9-10,22-23]。本研究也發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達Parkin可以保護MPP+對SHSY5Y細胞的毒性損傷。但Parkin可能還有更多功能未被發(fā)現(xiàn)。對Parkin進行深入研究，闡明其和PD病理之間的關(guān)系，將有助于提供新的藥物作用靶點，為PD的治療提供新的策略。

目前，對Parkin的研究主要采用瞬時轉(zhuǎn)染方式[17,24-25]。雖然瞬時轉(zhuǎn)染較為簡單，但成本高，需要大量質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染效率偏低，并且基因表達不穩(wěn)定，表達時間有限，不利于重復(fù)實驗和實驗結(jié)果比較。所以建立穩(wěn)定表達Parkin蛋白的細胞系就顯得尤為重要，特別是在轉(zhuǎn)染效率較低的SH-SY5Y細胞中。

目的蛋白與綠色熒光蛋白的融合表達具有檢測方便、不須染色、對細胞無毒、利于研究目的蛋白的細胞內(nèi)定位等優(yōu)點[26]。目前Parkin在細胞內(nèi)的亞細胞定位還存在爭議。

本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達融合蛋白GFP-Parkin的細胞系，這將有利于對Parkin細胞內(nèi)亞細胞定位的進一步研究，尤其有利于蛋白在活細胞中的實時定位研究。目前已建立了穩(wěn)定表達Parkin的PC12和SH-SY5Y細胞系[27-28]，但其中Parkin并未融合GFP，不利于Parkin亞細胞定位的研究。而本研究構(gòu)建的GFP-Parkin細胞系可實現(xiàn)對Parkin的可視化研究，這為今后觀察Parkin蛋白活細胞實時定位、細胞內(nèi)的分布和轉(zhuǎn)運提供了理想的細胞系。

盡管對Parkin蛋白的研究已進行多年，但由于其功能多樣，因此很多功能機制尚不清楚，目前還處于初級階段。本研究建立了一個在基因組DNA中穩(wěn)定整合pEGFP-Parkin的SH-SY5Y細胞系，在該細胞系中融合蛋白GFP-Parkin得到有效穩(wěn)定表達，并初步證明Parkin可以減弱MPP+對SH-SY5Y細胞的損傷。該細胞系的建立為深入研究Parkin基因功能提供了較好的細胞模型。

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EstablishmentofSH-SY5Y CellLineStablyExpressing GFP-Parkin and its Preliminary Function

ZHAO Hai-Zhou,MO Can-Kun,LIN Zhan-Le,LIU Wen-Hua*
School of Life Sciences,Zhaoqing University,Zhaoqing 526061,China
*Corresponding anthor,E-mail:wenhualiu@hotmail.com

Objective:To establish SH-SY5Y cell line stably expressing GFP-Parkin,and evaluate its protective effect against MPP+by MTT assay.Methods:The coding sequence of human Parkin was cloned into the vector pEGFP-C1 to construct recombinant plasmid pEGFP-Parkin.The pEGFP-Parkin plasmid was transfected into SHSY5Y cells using LipofectAMINE 3000,and positive-expression cells were screened by using G418.The expres?sion of GFP-Parkin was identified with fluorescent microscopy and Western blot.The protective effect of Parkin against MPP+in SH-SY5Y cells was detected by MTT assay.Results:The constructed pEGFP-Parkin plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing analysis.Fluorescence photographs and West?ern blot data revealed that the SH-SY5Y cells expressed GFP-Parkin protein stably.MTT assay showed that sur?vival of Parkin group was 15％higher than that of control group after exposure to 1mmol/L MPP+for 48h（P＜0.05）,indicating that Parkin significantly enhanced cell survival.Conclusion:SH-SY5Y cell line stably express?ing GFP-Parkin has been established,laying a foundation for further investigating cytoprotective effects and other functional mechanisms of Parkin.

Parkin protein;SH-SY5Y cells;stable expression;MPP+

Q78;R741.02

A

1009-0002（2017）04-0429-06

2017-04-17

國家自然科學(xué)基金（31271124）；廣東省教育廳重大項目（2014KZDXM075）；廣東省教育廳創(chuàng)新團隊項目（2015KCXTD032）；廣東省教育廳青年創(chuàng)新人才項目（2016KQNCX178）

趙海洲（1987- ），男，碩士，研究實習(xí)員，（E-mail）zhaohaizhou012@163.com

劉文華，（E-mail）wenhualiu@hotmail.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.005