基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的EGFR或KRAS突變型非小細(xì)胞肺癌耐藥基因表達(dá)譜分析

吳 峰 朱圣明 胡承浩 邱 力 王 科

基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的EGFR或KRAS突變型非小細(xì)胞肺癌耐藥基因表達(dá)譜分析

吳 峰 朱圣明 胡承浩 邱 力 王 科

目的通過(guò)對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析，探究NSCLC中EGFR和KRAS突變與耐藥基因表達(dá)的關(guān)系，以及對(duì)患者生存和預(yù)后的影響。方法對(duì)NCBI中GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)進(jìn)行表達(dá)量分析、生存分析和相關(guān)性分析。結(jié)果①研究分析表明，ABCC1、GSTP1、MGMT1和RRM1基因在NSCLC組織中存在明顯的高表達(dá)(P<0.0001；P<0.0001；P=0.0014；P<0.0001)；而ERCC1和TUBB3基因表達(dá)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.3922；P=0.4583)。②在KM組中，TUBB3、ABCC1和XPA基因存在明顯的高表達(dá)(P=0.0169；P=0.033；P=0.0165)，而在EM組中只有ABCC1存在明顯的高表達(dá)(P=0.0002)。③在KM組中ABCC1和XPA的表達(dá)情況呈正相關(guān)(P=0.025，γ=0.4992)；而它們與TUBB3的表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)(P=0.0075，γ=-0.5789；P=0.0012，γ=-0.6696)。④ABCC1和TUBB3的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肺癌患者的總生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率明顯降低。結(jié)論在NSCLC中EGFR或KRAS基因的突變會(huì)導(dǎo)致部分相關(guān)耐藥基因的差異表達(dá)，這些差異表達(dá)的基因之間存在相關(guān)性，而且對(duì)患者的生存及預(yù)后又具有重要影響。

非小細(xì)胞肺癌；EGFR；KRAS；耐藥基因

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1411～1415)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)40%～80%存在表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的過(guò)度表達(dá)和突變。針對(duì)該靶點(diǎn)的藥物主要為EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)[1]。盡管EGFR突變的NSCLC患者大多會(huì)對(duì)其首次治療有響應(yīng)，但在此后腫瘤又會(huì)有不同程度的復(fù)發(fā)，甚至出現(xiàn)耐藥[2-3]。KRAS也是NSCLC的驅(qū)動(dòng)突變，其結(jié)果是信號(hào)通路的持續(xù)激活，KRAS的突變與抗EGFR抗體藥物的治療效果也有密切關(guān)系[4]。

本研究旨在通過(guò)相關(guān)NSCLC的耐藥基因的表達(dá)研究及相關(guān)樣本的預(yù)后情況，了解EGFR和KRAS突變與NSCLC耐藥性的相關(guān)性，以期為臨床EGFR和KRAS突變的NSCLC患者的用藥和治療提供一個(gè)可靠的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本研究所用到的材料均來(lái)自于NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，具體信息見(jiàn)表1。

表1 GES31210數(shù)據(jù)集樣本分組統(tǒng)計(jì)表

1.2 分析方法

1.2.1 表達(dá)量分析 基于數(shù)據(jù)庫(kù)特定研究樣本數(shù)據(jù)集中特定目標(biāo)基因的表達(dá)量的相對(duì)值進(jìn)行表達(dá)量的分析，所有數(shù)據(jù)都經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換和中位數(shù)中心化處理。根據(jù)表達(dá)量處理后數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類和差異分析。文中熱圖由HemI軟件制作，比較差異分析圖由GraphPad Prism 5軟件制作(P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。

1.2.2 生存分析 基于數(shù)據(jù)庫(kù)特定研究樣本數(shù)據(jù)集中特定目標(biāo)基因的表達(dá)量的相對(duì)值及對(duì)應(yīng)樣本的總生存(OS)和無(wú)復(fù)發(fā)生存(RFS)信息進(jìn)行生存分析，所有數(shù)據(jù)都經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換和中位數(shù)中心化處理，并采用Kaplan-Meier分析方法進(jìn)行分析。

1.2.3 相關(guān)性分析 基于數(shù)據(jù)庫(kù)特定研究樣本數(shù)據(jù)集中特定目標(biāo)基因的表達(dá)量的相對(duì)值進(jìn)行相關(guān)性分析，所有數(shù)據(jù)都經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換和中位數(shù)中心化處理(P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，γ<0表示負(fù)相關(guān)，γ>0表示正相關(guān))。

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)耐藥基因在NSCLC患者中的表達(dá)分析

為了評(píng)估NSCLC耐藥性與EGFR和KRAS基因突變的關(guān)系，我們選取了7個(gè)已有報(bào)道過(guò)的NSCLC相關(guān)的耐藥基因，分別為切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross complement-1,ERCC1)、核糖核苷還原酶亞單位1 (ribonucleotide reductase M1,RRM1)、細(xì)胞骨架微管蛋白Ⅲ(classⅢ-tubulin,TUBB3)、多藥耐藥相關(guān)蛋白基因1(multidrug resistence-associated protein,MRP1或ABCC1)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶1(glutathione-S-transferase P1,GSTP1)，O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methy lguanine-DNA methyltransferase,MGMT)和DNA修復(fù)基因(DNA damage recognition and repair factor,XPA)。據(jù)以往的相關(guān)研究表明，這些基因在NSCLC的耐藥性調(diào)控方面都起著非常重要的作用。據(jù)此，我們對(duì)GSE31210數(shù)據(jù)集中的不同分組的NSCLC樣本和正常樣本的這些基因的表達(dá)進(jìn)行了表達(dá)譜的聚類分析，結(jié)果表明，不同的耐藥相關(guān)基因在不同分組間的表達(dá)存在差異，如RRM1和GSTP1基因在NSCLC組織中存在明顯的高表達(dá)，這也與以往的類似研究結(jié)果相一致。這些表明，耐藥基因的表達(dá)在不同突變類型NSCLC分組間存在差異，可能與NSCLC的耐藥性及EGFR和KRAS基因的突變有關(guān)。

2.2 正常對(duì)照組與NSCLC組間耐藥基因的表達(dá)差異比較

通過(guò)上述表達(dá)譜顯示，耐藥基因在不同分組間的表達(dá)量確實(shí)存在差異。所以，為了進(jìn)一步具體探究這些表達(dá)差異，我們?cè)诓煌纸M間進(jìn)行了具體的比較和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明，與正常肺組織相比，ABCC1、GSTP1、MGMT1和RRM1基因在NSCLC組織中存在明顯的高表達(dá)(ABCC1，P<0.0001；GSTP1，P<0.0001；MGMT1，P=0.0014；RRM1，P<0.0001)；而ERCC1和TUBB3基因在正常組織和NSCLC組織間的表達(dá)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ERCC1，P=0.3922；TUBB3，P=0.4583)，甚至XPA基因在正常組織中存在一定程度的高表達(dá)(XPA，P=0.0004)(圖1)。

2.3 不同基因突變組間耐藥基因的表達(dá)差異比較

為了進(jìn)一步明確耐藥相關(guān)基因的表達(dá)與EGFR和KRAS基因突變間的聯(lián)系，我們又對(duì)EGFR基因突變組(EM)、KRAS基因突變組(KM)和無(wú)突變NSCLC組(LC)間的耐藥基因的表達(dá)差異進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，不同分組間耐藥基因的表達(dá)存在明顯的差異，尤其是在KM組中，與LC組相比，TUBB3、ABCC1和XPA基因存在明顯的高表達(dá)(TUBB3，P=0.0169；ABCC1，P=0.033； XPA，P=0.0165)，而在EM組中只有ABCC1存在明顯的高表達(dá)(ABCC1，P=0.0002)，TUBB3反而呈現(xiàn)出明顯的低表達(dá)現(xiàn)象(TUBB3，P=0.0003)(表2和圖2)。這些結(jié)果表明，相關(guān)耐藥基因的表達(dá)與NSCLC中EGFR或KRAS基因的突變存在著一定的聯(lián)系，而且通過(guò)這一比較分析可以看到不同的耐藥基因在不同的突變組中表達(dá)不同，各耐藥相關(guān)基因也不會(huì)同時(shí)處于同樣的表達(dá)趨勢(shì)，也許它們之間還存在功能互補(bǔ)的關(guān)系。

圖1 正常組與NSCLC組間耐藥相關(guān)基因的表達(dá)差異比較分析

耐藥相關(guān)基因LCvsKMLCvsEMKMvsEMERCC10.71240.03480.3372RRM10.50300.11250.0436TUBB30.01690.00030.0009GSTP10.17030.43340.2678ABCC10.03300.00020.3490MGMT0.22210.25480.1013XPA0.01650.82170.0074

2.4 耐藥基因表達(dá)間的相關(guān)性分析

鑒于上述的研究結(jié)果，為了進(jìn)一步探明不同差異表達(dá)的耐藥相關(guān)基因之間的關(guān)系，我們選取KM組中明顯高表達(dá)的3個(gè)基因TUBB3、ABCC1和XPA，并對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，在KM組中ABCC1和XPA的表達(dá)情況呈正相關(guān)(P=0.025，γ=0.4992)；而它們與TUBB3的表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)(P=0.0075，γ=-0.5789；P=0.0012，γ=-0.6696)(圖3)。這就說(shuō)明，在KM組中，ABCC1和XPA可能存在協(xié)同高表達(dá)的情況，而它們與TUBB3之間則可能是一種耐藥功能上的互補(bǔ)關(guān)系。因此即便是在同樣高表達(dá)的KM組中，各耐藥基因的高表達(dá)情況并不完全同步，且可能存在互補(bǔ)的現(xiàn)象。

圖2 不同基因突變組間耐藥相關(guān)基因的表達(dá)差異比較分析

圖3 KRAS突變組中相關(guān)耐藥基因表達(dá)相關(guān)性分析

2.5 耐藥基因異常表達(dá)對(duì)NSCLC患者生存及預(yù)后的影響

通過(guò)我們對(duì)部分高表達(dá)耐藥相關(guān)基因的相關(guān)性分析，我們?cè)谝欢ǔ潭壬辖沂玖似湓诒磉_(dá)上的協(xié)同或互補(bǔ)的規(guī)律?；诖?，我們進(jìn)一步對(duì)ABCC1和TUBB3基因表達(dá)對(duì)患者生存和預(yù)后的影響進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在EGFR突變的NSCLC患者中，ABCC1的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肺癌患者的總生存率明顯降低(P=0.0186)，并且它的高表達(dá)也同樣會(huì)導(dǎo)致肺癌患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存率明顯降低(P=0.0331)；與此類似，TUBB3的高表達(dá)也會(huì)導(dǎo)致肺癌患者的總生存率明顯降低(P=0.0018)，并且它的高表達(dá)也同樣會(huì)導(dǎo)致肺癌患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存率明顯降低(P=0.0071)。見(jiàn)圖4。

圖4 ABCC1和TUBB3高表達(dá)對(duì)NSCLC患者的生存分析

3 討論

基于NSCLC患者多存在EGFR的過(guò)表達(dá)或突變，目前所采用EGFR-TKIs靶向治療NSCLC患者仍然屬于較為有效的治療手段，可以使患者免受傳統(tǒng)化療手段所帶來(lái)的痛苦[5]。但在初期對(duì)EGFR-TKIs敏感性階段的治療后，耐藥性問(wèn)題的出現(xiàn)困擾了NSCLC患者的繼續(xù)治療[6]。有研究者發(fā)現(xiàn)，KRAS基因的突變可能與NSCLC耐藥性相關(guān)，而且隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，與耐藥性有關(guān)的一些基因也不斷被發(fā)現(xiàn)，正如本研究中所分析那些耐藥相關(guān)基因，它們?cè)贒NA修復(fù)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等方面發(fā)揮著不同的功能[7-8]。由于研究發(fā)現(xiàn)的眾多基因、蛋白和信號(hào)通路等均參與同一種或者多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，所以盡可能地闡明這些耐藥基因與EGFR或KRAS基因突變的相關(guān)性及其對(duì)患者生存和預(yù)后的影響將有利于尋找解決EGFR-TKIs耐藥性問(wèn)題以及靶向治療NSCLC患者的分子靶點(diǎn)和治療策略，通過(guò)這樣阻斷治療過(guò)程中出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象，提高靶向藥物治療NSCLC患者的療效。鑒于此，本研究基于數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)EGFR和KRAS基因突變的NSCLC樣本中相關(guān)耐藥基因進(jìn)行了分析。

我們的研究分析表明，ABCC1、GSTP1、MGMT1和RRM1基因在NSCLC組織中存在明顯的高表達(dá)；而ERCC1和TUBB3基因在正常組織和NSCLC組織間的表達(dá)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且XPA基因反而在正常組織中存在一定程度的高表達(dá)。這一表達(dá)情況的分析證明了耐藥基因異常表達(dá)的情況存在于NSCLC病例中，且有可能與疾病的某些進(jìn)程相關(guān)。與此同時(shí)，部分耐藥相關(guān)基因在此之間存在差異表達(dá)，尤其是在KM組中，TUBB3、ABCC1和XPA基因存在明顯的高表達(dá)，而在EM組中只有ABCC1存在明顯的高表達(dá)，TUBB3反而呈現(xiàn)出明顯的低表達(dá)現(xiàn)象。由此，相關(guān)耐藥基因的表達(dá)與NSCLC中EGFR或KRAS基因的突變存在著一定的聯(lián)系，而且通過(guò)這一比較分析可以看到不同的耐藥基因在不同的突變組中表達(dá)不同。針對(duì)于此，進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，在KM組中ABCC1和XPA的表達(dá)情況呈正相關(guān)；而它們與TUBB3的表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果就說(shuō)明了在KM組中，ABCC1和XPA可能存在協(xié)同高表達(dá)的情況，而它們與TUBB3之間則可能是一種耐藥功能上的互補(bǔ)關(guān)系。最終，我們對(duì)本研究分析篩選出的耐藥基因ABCC1和TUBB3進(jìn)行了生存分析，在EGFR突變的NSCLC患者中，ABCC1、TUBB3的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肺癌患者的總生存率明顯降低，并且它們的高表達(dá)也同樣會(huì)導(dǎo)致肺癌患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存率明顯降低。

通過(guò)本研究對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中NSCLC樣本數(shù)據(jù)的分析和歸納，發(fā)現(xiàn)在NSCLC中EGFR或KRAS基因的突變會(huì)導(dǎo)致部分相關(guān)耐藥基因的差異表達(dá)，尤其是高表達(dá)，這就與某些NSCLC病例的耐藥性相關(guān)聯(lián)了。此外，這些耐藥基因的表達(dá)還存在協(xié)同或互補(bǔ)的關(guān)系，通過(guò)這樣的表達(dá)關(guān)系可以更大化地維持腫瘤的增殖和存活等功能，以進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤的耐藥性。鑒于此，在今后的研究和臨床治療中，可以以這些差異表達(dá)的耐藥基因作為針對(duì)的依據(jù)及靶向治療的靶點(diǎn)。

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(編輯：甘艷)

AnalysisofResistantGenesExpressionProfilinginEGFRorKRASMutantNon-smallCellLungCancer(NSCLC)BasedonGEODatabase

WUFeng,ZHUShengming,HUChenghao,etal.

TaiheHospital,Taihe,442000

ObjectiveTo explore the relationship between EGFR or KRAS mutant NSCLC and resistance genes and the impact on the survival and prognosis of NSCLC patients,based on relevant database data analysis.MethodsBased on data sets of GEO in the NCBI database,to perform express analysis,survival analysis and correlation analysis.Results①Analysis showed thatERCC1,GSTP1,MGMT1 and RRM1 genes significantly higher expression in NSCLC(P<0.0001;P<0.0001;P=0.0014;P<0.0001);and the expression of ERCC1 and TUBB3 had no statistically significance(P=0.3922;P=0.4583).②In the KM group,the expression of TUBB3,ABCC1 and XPA genes were significantly higher(P=0.0169;P=0.033;P=0.0165),but in the EM group only ABCC1 significant higher expression(P=0.0002).③In the KM group,the expression of ABCC1 and XPA were positively correlated(P=0.025,γ=0.4992);and they were negatively correlated with TUBB3(P=0.0075,γ=-0.5789;P=0.0012,γ=-0.6696).④High expression of ABCC1 and TUBB3 will lead to overall survival and relapse-free survival of patients with lung cancer were significantly reduced.ConclusionThe mutations of EGFR or KRAS gene in NSCLC could lead to differences in part related resistance gene expression,in which the genes expression are correlated,but also has a significant impact on the survival and prognosis of patients.

NSCLC；EGFR；KRAS；Resistant genes

442000 湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)

王 科

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.09.005

R734.2

A

1001-5930(2017)09-1411-05

2016-10-24

2017-04-10)