探討利用測量不確定度評估ELISA法檢測抗HEV-IgM實驗中灰區(qū)設置的適用性

楊宇生

（成都市疾病預防控制中心，四川 成都 610041）

探討利用測量不確定度評估ELISA法檢測抗HEV-IgM實驗中灰區(qū)設置的適用性

楊宇生

（成都市疾病預防控制中心，四川 成都 610041）

目的 探討ELISA法檢測HEV-IgM的實驗中灰區(qū)值的設置。方法 使用瑞士漢密爾頓全自動酶聯(lián)免疫分析儀FAME24/20檢測HEV-IgM，利用本實驗室ELISA法檢測抗HEV-IgM實驗中的測量不確定度，評估ELISA法檢測抗HEV-IgM實驗中灰區(qū)值的范圍。結果置信水平為95%時，抗HEV-IgM擴展不確定度U抗HEV-IgM=59.78%，在臨界狀態(tài)下，即s/co=1時，s/co值有95%的可能性位于1± 1*59.78%，即可評估ELISA法檢測抗HEV-IgM實驗中灰區(qū)值范圍為0.40～1.60。結論 灰區(qū)范圍的設置能顯著的影響到ELISA檢測結果，設置合理的符合實驗室實際情況的灰區(qū)范圍，有助于降低假陰性標本的漏檢率，提高檢測的準確度和檢測質量，利用實驗室已獲得的測量不確定度來評估檢測項目的灰區(qū)范圍，比起按照固定比例來設置灰區(qū)范圍更為科學合理，也更適合不同實驗室的實際情況。

ELISA；測量不確定度；灰區(qū)；設置

戊型病毒性肝炎是一種經消化道傳播的病毒性肝炎，其傳播方式、臨床表現(xiàn)和預后均與甲型病毒性肝炎類似，是發(fā)展中國家的面臨的一個重大公共衛(wèi)生問題，能引起戊型肝炎大的爆發(fā)流行或急性散發(fā)性感染，還可轉為慢性感染，主要侵犯中青年，尤其是孕婦感染率高，戊肝如果爆發(fā)在孕婦人群尤其是妊娠晚期，易導致高發(fā)病率、高病死率、高急性肝功能衰竭等肝臟疾病，還可導致早產兒，低出生體質量兒和圍生期病死率的風險增加[1]?！吨腥A人民共和國食品安全法》（2015年修訂）第45條中也規(guī)定，患有國務院衛(wèi)生行政部門規(guī)定的有礙食品安全疾病的人員，不得從事接觸直接入口食品的生產。從事接觸直接入口食品工作的食品生產經營人員應當每年進行健康檢查，取得健康證明后方可上崗工作。而戊型病毒性肝炎作為食品從業(yè)人員健康檢查的項目之一，是衛(wèi)生行政部門規(guī)定的有礙食品安全疾病之一。

血清免疫學檢測抗HEV-IgM作為戊肝近期感染的標志[1]，其中ELISA法是最常用的免疫學檢測方法之一。酶聯(lián)免疫試驗（ELISA）法是免疫診斷中的一項常用技術，已成功地應用于多種病原微生物引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷，也可應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定。由于ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定以及易于自動化操作等特點，還廣泛應用于各級醫(yī)療衛(wèi)生機構，如各級醫(yī)院，疾病預防控制中心實驗室，采供血機構實驗室等，因此保證ELISA檢測結果的準確性和檢測質量，對于疾病的診斷，預防篩查和流行病學調查等有著十分重要的意義。但是由于ELISA法影響因素較多，十分有必要在臨界值附近設置灰區(qū)，以提高檢測準確性，避免出現(xiàn)漏檢。同時，由于國內試劑廠商多沒有提供試劑檢測結果的灰區(qū)值，國內對于灰區(qū)范圍的設置沒有統(tǒng)一的標準，各實驗室對于灰區(qū)設置也有不同的觀點和方法?；诖?，本研究對此問題進行初步探討，嘗試利用實驗室的測量不確定度來評估ELISA檢測中實驗項目的灰區(qū)的范圍設置。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器：預防醫(yī)學門診部實驗室采用瑞士HANMILTON AT全自動樣本處理機，和瑞士漢密爾頓FAME24/20全自動酶聯(lián)免疫分析儀。

1.1.2 試劑：北京萬泰生物藥業(yè)有限責任公司生產的抗HEV-IgM酶聯(lián)免疫體外診斷試劑盒，北京康徹思坦生物制劑公司生產的室內質控品（單位：抗HEV-IgM，2 U/mL），衛(wèi)生部臨床檢驗中心提供的室間質量評價考核標本（每次質評活動中提供5個水平的質評樣本）。

1.2 數(shù)據(jù)：室內質控根據(jù)操作手冊每一檢測批內進行一次檢測，收集本實驗室2015年4月至2016年4月萬泰抗-HEV-IgM（批號：201501001）共83個質控數(shù)據(jù)。收集2014年至2015年度衛(wèi)生部臨床檢驗中心的室間質量評價活動，抗HEV-IgM實驗項目全年共兩次室間質評結果，每次室間質評活動中，衛(wèi)生部臨床檢驗中心發(fā)出5組水平的質控樣本，盡量選擇檢測結果在臨界值附近（s/co值在1～6）的質控樣本的室間質評數(shù)據(jù)。

1.3 檢測程序：①確保儀器處于良好的性能，儀器按作業(yè)指導書進行維護，年底由廠家工程師做年終維護；②以實驗室程序文件為指導，正確開展實驗室室內質量控制，同時每年參加衛(wèi)生部臨床檢驗中心組織的免疫項目室間質量評價計劃，均通過；③實驗室室內質控品和衛(wèi)生部臨檢中心室間質評樣本的測量過程，均和日常常規(guī)標本一致，根據(jù)儀器作業(yè)指導書和試劑說明書嚴格進行操作。

1.4 不確定度的來源與計算

1.4.1 不確定度來源：近年來國外學會諾德創(chuàng)新中心（NordicInnovation）提出一整套規(guī)則，即Nordtest準則[2]，其主要致力于北歐國家檢測方法的發(fā)展和檢測的一致性評定，以保證北歐國家間產品與服務能無障礙的流通，其中有關測量不確定度的評定方法主要采用實驗室已有的室內質控數(shù)據(jù)和實驗室參加PT（能力驗證）計劃所獲得的室間質量評價數(shù)據(jù)來進行測量不確定度的評估，旨在提供一個實用的、易于理解的、普遍的測量不確定度的評定方法，即是說，實驗室如果擁有室內質控數(shù)據(jù)，并參加了實驗室能力驗證計劃并獲得反饋回的室間質量評價數(shù)據(jù)，就可以根據(jù)Nordtest準則來進行測量不確定度的評估。根據(jù)Nordtest準則[2]，測量不確定度主要來源于實驗室內重現(xiàn)性（Reproducibility within-laboratory），以及方法和實驗室偏倚（Method and laboratory bias）。

1.4.2 不確定度評定[2-4]：合成相對標準不確定度uc（y）和擴展不確定度U：

U=k×uc，其中包含因子k=2，取95%置信區(qū)間。

其中，①實驗室內重現(xiàn)性（Rw）主要反映的是實驗室內的精密度，因此當室內質控品經過和常規(guī)檢測樣本一致的實驗處理過程并具有相似的基體效應時，室內質控數(shù)據(jù)的變異系數(shù)CV就是實驗室內重現(xiàn)性（Rw）的相對標準不確定度，用uRw（rel）表示：

在本文中s為本實驗室1年內室內質控數(shù)據(jù)標準差， 為1年內室內質控數(shù)據(jù)平均值。

②方法和實驗室偏倚即均方根（Root mean square，RMS），計算公式為[3]

n為實驗室參加衛(wèi)生部臨床檢驗中心室間質評的實驗次數(shù)，bias為實驗室室間質評樣本測量值與質評樣本公示值之間的相對偏倚值。

③參考值和（或）參考方法偏倚ucref，根據(jù)ISO13528[4]：

cvr為室間質評中相同方法組所得檢測結果的變異系數(shù)，m為室間質評相同方法組中參評實驗室的數(shù)目，1.25為穩(wěn)健標準差的轉換系數(shù)。

2 結 果

2.1 uRw（rel）計算結果：收集本實驗室2014年至2015年度的同一批號的室內質控數(shù)據(jù)，利用室內質控數(shù)據(jù)來評估測量不確定度，結果見表1。

表1 實驗室內重現(xiàn)性的相對標準不確定度

2.2 相對偏倚和RMSbias計算結果：收集本實驗室2014年至2015年度衛(wèi)生部臨檢中心室間質量評價回饋數(shù)據(jù)，評價方法和實驗室偏倚的測量不確定度，結果見表2。

表2 評價方法和實驗室偏倚相對標準不確定度

2.3 參考值測量不確定度ucref計算結果：結果見表3。

表3 室間質評參考值相對標準不確定度

2.4 合成相對標準測量不確定度和擴展不確定度：

其中包含因子k=2，取95%置信區(qū)間。

2.5 ELISA法檢測抗HEV-IgM灰區(qū)范圍：置信水平為95%時，抗HEV-IgM擴展不確定度U抗HEV-IgM=59.78%，在臨界狀態(tài)下，即s/co=1時，s/co值有95%的可能性位于1±1*59.78%，即可評估本實驗室ELISA法檢測抗HEV-IgM實驗中灰區(qū)值范圍為0.40～1.60。

3 討 論

ELISA法的基本原理是抗原抗體的特異性結合，以及底物和酶的多級放大系統(tǒng)，其操作步驟復雜，每一步操作不當都會對最終結果產生影響，同時ELISA法影響因素眾多，包括試劑的因素，樣本前處理，內源性和外源性干擾因素等[5]。在采用ELISA方法進行檢測時，國產試劑常以CUTOFF值（co值）來作為判定檢測結果陽性還是陰性的標準，但是由于ELISA方法學的原因和種種限制，還是會出現(xiàn)一些處于臨界值附近的結果，現(xiàn)有的實驗室技術難以判斷其陰陽性，而國外的ELISA試劑通常把這一區(qū)間的結果定義為“灰區(qū)”[6]。由此可以看出，由于ELISA方法學的固有特性和局限性，其必然會存在有處于“灰區(qū)”范圍內的可疑檢測結果，同時由于ELISA法步驟復雜，影響因素眾多，因此應用ELISA法進行檢測時變異系數(shù)較大，灰區(qū)的范圍相對較寬，因此科學合理的設置灰區(qū)范圍對實驗結果和檢測質量有著顯著影響。

灰區(qū)的設置就是在臨界值附近劃出一定的“范圍”，在這個“范圍”內樣本的檢測結果為“可疑”，需對樣本進行重復檢測，設置灰區(qū)范圍的方法一般有兩種，一是根據(jù)室內質控的變異系數(shù)cv，或室內質控的標準差SD[7]，另一種是按照固定比例來設定，例如10%～15%倍CUTOFF值區(qū)域作為灰區(qū)范圍[8]。筆者認為酶聯(lián)免疫實驗（ELISA）中“灰區(qū)”的設置不是固定的，也沒有一個統(tǒng)一的標準比例，由于ELISA實驗影響因素眾多，同時每個檢測項目的特點不同，各個實驗室的客觀條件、檢測水平也各不相同，因此“灰區(qū)”范圍的設定應該根據(jù)不同檢測項目，不同檢測條件，由各實驗室根據(jù)實際情況進行設置，毛瑞[9]也持相似的觀點，同時僅僅根據(jù)室內質控cv或SD來設置，也存在一定局限，如cv僅反應實驗室批內和批間變異，未能反應出實驗室檢測的偏倚大小，而根據(jù)Nordtest準則[2]，測量不確定度主要來源于實驗室內重現(xiàn)性、以及方法和實驗室偏倚，其能全面反應實驗室的批內和批間變異，以及實驗室的偏倚。測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結果相聯(lián)系的參數(shù)，即在一定的置信水平下，測量之值有多大可能性處于這個區(qū)間。當ELISA檢測結果在判斷結果真?zhèn)蔚呐R界值，即s/co=1時，由于檢測的測量不確定度的存在，此檢測結果有一定的可能性（一般是95%可信水平），處于1± 1*U，從而可以評估出該檢測項目實驗中的灰區(qū)值范圍，因此筆者認為利用測量不確定度來評估灰區(qū)范圍較為科學、合理。

陳善華[6]等的研究表明，ELISA檢測HBsAg結果處于灰區(qū)范圍的樣本，經電化學發(fā)光和HBA DNA重復檢測，其陽性率達10%以上，因此灰區(qū)范圍合理、科學的設置，有利于幫助判斷“可疑”標本，從而采取不同檢測試劑，或者不同檢測方法進行復檢，以進一步減少漏檢的可能性，提高實驗室檢測質量，保證廣大群眾的健康。

[1] 肖培,程龍慧,許曉紅.戊型肝炎病毒研究進展[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學, 2014,41(22):4160-4162.

[2] Magnusson B,Naykki T,Hovind H,et al.Handbook for Calculation of Measurement Uncertainty in Environmental laboratories[S]. Espoo:Nordtest,2003.

[3] Bertil Magnusson,Haakan Ossowicki,Olaf Rienitz Elvar Theodorsson.Routine internal-and external-quality control data in clinical laboratories for estimating measurement and diagnostic uncertainty using GUM principles[J].Scand J Clin Lab Invest, 2012,72(3):212-220.

[4] 中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.利用實驗室間比對進行能力驗證的統(tǒng)計方法[S].北京:中國標準出版社,2012.

[5] 容瑩,孫秀雙,鄭望春,等.乙型肝炎表面抗原檢測結果分析及灰區(qū)設置探討[J].檢驗醫(yī)學與臨床,2010,7(15):1593-1595.

[6] 陳善華,朱麗莉,李浩,等.ELISA方法檢測HBsAg設置灰區(qū)的必要性探討[J].中國輸血雜志,2013,26(10):1013-1014.

[7] 魏蘭華.ELISA法檢測抗-HIV實驗中灰區(qū)設置的探討[J].臨床輸血與檢驗,2015,17(6):566,581.

[8] 伍偉建,郭如華.ELISA試驗灰區(qū)設置方法的探討[J].中國生物制品學雜志,2008,21(10):911-912.

[9] 毛瑞.西藏自治區(qū)血液中心實驗室酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測“灰區(qū)范圍”淺談[J].實用醫(yī)技雜志,2013,20(3):285-287.

Discuss the Applicability of Using Measurement Uncertainty to Assess the Setting of Gray Area in Anti-HEV-IgM Detection by ELISA

YANG Yu-sheng
(Chengdu Center for Disease Control and Prevention, Chengdu 610041, China）

Objective Discuss the setting of gray area in anti-HEV-IgM detection by ELISA. Methods Use the Automatic enzyme-linked immunity analyzer FAME24/20 to detect anti-HEV-IgM, make use of measurement uncertainty in anti-HEV-IgM by ELISA, assess the range of gray area in anti-HEV-IgM by ELISA. Results With a 95% confidence level, the expanded uncertainty of anti-HEV-IgM was 59.31%, at the CUT-OFF level(S/CO=1), there was a 95% chance that S/CO was between 1±1*59.31%, then the range of gray area in anti-HEV-IgM by ELISA was 0.41-1.59. Conclusion The setting of gray area observably affects the detection of ELISA, reasonable range of gray area coincide with the actual situation of lab, helps to decrease the not-detected rate of false negative,improves the accurancy and quality of detection, assessment of the gray area range by the lab’ measurement uncertainty obtained, was more reasonable than setting of gray area by fixed ratio, then more suitable to the actual situation of the lab.

ELISA; Measurement uncertainty; Gray area; Setting

R575.1

B

1671-8194（2017）18-0011-03