探討蛋白酶體功能障礙對散發(fā)性帕金森病發(fā)病機(jī)制的影響

黃優(yōu)

572000 海南省第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

探討蛋白酶體功能障礙對散發(fā)性帕金森病發(fā)病機(jī)制的影響

黃優(yōu)

目的探討蛋白酶體功能障礙對散發(fā)性帕金森病的發(fā)病機(jī)制。方法收集本院2013年7月～2015年7月病例，將存在蛋白酶體功能障礙的帕金森病患者50例作為觀察組，未存在蛋白酶體功能障礙的帕金森病患者50例作為對照組，觀察2組患者的行為學(xué)改變情況，通過RT-PCR、Western blotting分子生物學(xué)方法檢測患者血液中α-突觸核蛋白(α-Syn)表達(dá)水平。結(jié)果觀察組患者血清的α-突觸核蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)。結(jié)論蛋白酶體功能障礙可能導(dǎo)致散發(fā)性帕金森病患者血液中α-突觸核蛋白(α-Syn)水平升高，考慮該因素可能是散發(fā)性帕金森疾病的危險因素。

蛋白酶體功能障礙 α-突觸核蛋白(α-Syn) 散發(fā)性帕金森 發(fā)病機(jī)制

帕金森病是一種慢性進(jìn)展性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重?fù)p害老年人的身體健康和影響老年人的日常生活，并給家庭和社會帶來經(jīng)濟(jì)上沉重的負(fù)擔(dān)。在我國中老年人群中發(fā)病率已達(dá)0.2/100，且呈明顯上升趨勢[1-2]。臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、動作遲緩、運(yùn)動減少、肌強(qiáng)直和姿勢平衡障礙等4大主要特征，除了特征性的運(yùn)動障礙等癥狀以外常伴有精神癥狀及認(rèn)知功能障礙，主要表現(xiàn)為抑郁、多疑、思維遲鈍、癡呆、智能低下、幻覺等。臨床上以平衡障礙一步態(tài)異常為主要癥狀的帕金森病患者往往具有病程進(jìn)展較快，出現(xiàn)抑郁、認(rèn)知障礙、跌倒及殘疾的概率較高的特點(diǎn)。主要的病理特征是出現(xiàn)黑質(zhì)的致密部位多巴胺能神經(jīng)元的選擇性喪失，出現(xiàn)殘存路易小體，該病包括帕金森病癡呆和路易體癡呆，其中90%的患者呈現(xiàn)散在發(fā)生，即散發(fā)性的帕金森病[1]。目前該病主要的治療方法包括藥物及外科手術(shù)治療，但是都只是針對臨床表現(xiàn)，并不能阻止疾病的進(jìn)程，該病的致殘率較高。該病的病理機(jī)制尚未完全明確，可能與遺傳及環(huán)境因素有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)蛋白纖維化是散發(fā)性帕金森病患者導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的重要原因[2]。在疾病形成的過程中α-突觸核蛋白是與該病最為密切的相關(guān)蛋白，具有一定的神經(jīng)毒性，同時受到脂肪酸的作用，在蛋白酶體功能障礙時會發(fā)生結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化，泛素-蛋白酶體系是細(xì)胞蛋白的重要系統(tǒng)，可以參與降解蛋白質(zhì)和氧化蛋白質(zhì)[3]。帕金森病患者中黑質(zhì)致密部位氧化損傷的蛋白水平表達(dá)升高。多項(xiàng)研究都表明蛋白酶體可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，同時促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)泛素/α-共核蛋白免疫反應(yīng)陽性包涵體形成[4]。這提示蛋白酶體障礙對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病起著重要作用，本研究通過探討蛋白酶體功能障礙對散發(fā)性帕金森病發(fā)病機(jī)制的影響，以期為其在散發(fā)性帕金森病發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細(xì)胞與儀器

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(MBI公司，美國)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidas，HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(碧云天生物技術(shù)有限公司)，Goat anti-rabbit Ig GHRP，Goat anti-mouse IgG-HRP，α-Syn rabbit polyclonal IgG和β-actin(C4)mouse monoclonal IgG1(購自美國Santa Cruz Biotechnology公司)，避光4 ℃保存。半干式轉(zhuǎn)移和電泳儀(購自美國BIO-RAD公司)。倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)、全能型高性能臺式冷凍離心機(jī)(Heaeus，BiofugeStratos德國)、深低溫冰箱(SANYO，AltraLow日本)、實(shí)時定量熒光PCR儀(Rotor-gene3000，澳大利亞)。

1.2 分組

收集本院2013年7月～2015年7月病例，將蛋白酶體功能障礙的帕金森病患者50例作為觀察組，其中女22例，男28例，所有的病例都是初治病例，H&Y分期不超過2期，其中1期18例，1.5期15例，2期17例，年齡20～70歲，平均年齡(61.25±10.23)歲。未存在蛋白酶體功能障礙的帕金森病患者50例作為對照組，其中男27例，女23例，年齡0～70歲，平均年齡(64.26±8.56)歲，H&Y分期不超過2期，其中1期18例，1.5期14例，2期18例。抽取患者的空腹血液，勻漿器充分勻漿，之后將其轉(zhuǎn)移至EP管中，以14 000 r/min離心30 min，取上清液移至新EP管保存，使用前經(jīng)BCA法測定蛋白水平。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合帕金森病的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡20～70歲；③納入研究的患者均為接受過多巴胺受體激動劑及左旋多巴制劑的治療；④入組前頭顱影像學(xué)檢查排除帕金森綜合征及多系統(tǒng)萎縮等；⑤依從性強(qiáng)，愿意接受本臨床研究。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①年齡<20歲或>70歲的患者；②存在其他軀體系統(tǒng)疾病，有嚴(yán)重其他系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤的患者；③帕金森疊加綜合征、腦血管病、腦炎、一氧化碳中毒及藥物等影響的患者；④患者姿勢平衡障礙是由于其他疾病引起的；⑤存在嚴(yán)重的記憶障礙，研究對象的簡易智力狀態(tài)檢查MMSE<24分者；⑥不愿意接受本臨床研究，依從性差的患者。

1.5 RT-PCR(半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))

抽取患者的空腹血液，每例血清100mg，提取總RNA。取2μg總RNA行逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)體系為20 μl；吸取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl，分別加入18sRNA、α-Syn的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；反應(yīng)條件均為95 ℃預(yù)變性5 mins，94 ℃變性30 s，60 ℃30 s，72 ℃60 s，72 ℃7 mins，循環(huán)30次；PCR產(chǎn)物溴化乙錠1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)下進(jìn)行觀察并拍攝電泳圖像；以18sRNA作為內(nèi)參照，進(jìn)行PCR產(chǎn)物的半定量分析，測量各電泳條帶之吸光度積分值(A值)。

1.6 Western blotting

取血清提取100 mg總蛋白；SDS-PAGE凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，加α-Syn一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1000)37 ℃孵育1 h；ECL光化學(xué)法顯色，用彩色圖像分析系統(tǒng)測定吸光度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 α-Syn mRNA表達(dá)水平

觀察組患者的血清α-突觸核蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)(表2)。

表1 α-Syn mRNA表達(dá)水平的比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與治療前比較，△P<0.05

2.2 α-Syn蛋白表達(dá)水平

觀察組患者的血清α-突觸核蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)(表2)。

表2 α-Syn蛋白表達(dá)水平的比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與治療前比較，△P<0.05

3 討 論

帕金森病是臨床上的常見神經(jīng)退行性疾病，與選擇性的中腦黑質(zhì)致密部位的多巴胺能神經(jīng)元丟失和退化相關(guān)，主要特征是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的變性[5]。最新的研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶體受到抑制可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡，形成胞質(zhì)的泛素-α-共核蛋白免疫反應(yīng)包涵體使神經(jīng)元退變，伴隨著黑質(zhì)致密部位多巴胺的喪失，出現(xiàn)神經(jīng)元的損傷。有研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶體受損之后多巴胺能神經(jīng)元會使蛋白酶抑制劑敏感性提高，個別神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，通過選擇性損傷機(jī)制促使神經(jīng)細(xì)胞的氧自由基的增多，需要蛋白酶體來清除這些受損的蛋白[6-8]。蛋白酶體抑制劑選擇性損害多巴胺能神經(jīng)元可能與α-共核蛋白削弱了突觸囊泡對多巴胺的儲存，從而進(jìn)一步增加了胞漿內(nèi)多巴胺及氧自由基，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞氧化受損有關(guān)[9-11]。

目前臨床尚未明確α-突觸核蛋白的正常功能，在多數(shù)散發(fā)性帕金森病患者中未發(fā)現(xiàn)其基因突變，提示α-Syn 可能在散發(fā)性帕金森病發(fā)病中起著重要作用。泛素蛋白酶體系統(tǒng)是α-Syn的主要降解途徑，如果發(fā)生障礙則會導(dǎo)致α-Syn 聚集，從而誘發(fā)散發(fā)性帕金森病的發(fā)病[12]。研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶體成為影響細(xì)胞功能的重要藥物靶點(diǎn)，該靶點(diǎn)的抑制劑在臨床研究中被廣泛應(yīng)用，α-共核蛋白的生理功能尚不清楚，同時散發(fā)性帕金森病患者機(jī)體內(nèi)的α-共核蛋白量增高[13-14]。通過多種翻譯后修飾形式，引起黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡，中腦黑質(zhì)內(nèi)多種細(xì)胞、生化及分子改變已被發(fā)現(xiàn)，散發(fā)性帕金森病患者蛋白酶體α亞單位丟失，蛋白酶體活化因子表達(dá)下降，水解功能減弱[15]。大量的研究表明在帕金森病發(fā)病機(jī)制中蛋白酶體功能下降起重要作用，參與了黑質(zhì)的神經(jīng)元內(nèi)蛋白質(zhì)聚集及神經(jīng)元變性[16]。本研究結(jié)果顯示，觀察組α-突觸核蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)。這提示蛋白酶體功能障礙可能導(dǎo)致患者血清中的α-突觸核蛋白(α-Syn)形成，考慮該因素可能是散發(fā)性帕金森病的危險因素。蛋白酶體功能不能得到恢復(fù)，影響氧化受損的蛋白質(zhì)的降解，從而降低了蛋白酶體的清除能力，同時氧化受損的蛋白集聚增多，從而造成惡性循環(huán)，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[17]。

綜上所述，蛋白酶體功能障礙可能導(dǎo)致α-Syn血液中的聚集釋放，也可能是發(fā)生散發(fā)性帕金森病的重要危險因素。蛋白酶體功能下降可引起多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)α-共核蛋白聚集，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能的紊亂，最終促進(jìn)了多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。

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R742.5

A

1007-0478(2017)05-0455-03

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.05.019

(2016-09-21收稿)