咪唑乙煙酸降解菌的分離鑒定及降解條件優(yōu)化

呂翻洋 許澤華 毛曉潔 孫建光

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2. 寧夏農(nóng)林科學(xué)院寧夏回族自治區(qū)銀川市 750002）

咪唑乙煙酸降解菌的分離鑒定及降解條件優(yōu)化

呂翻洋1許澤華2毛曉潔1孫建光1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2. 寧夏農(nóng)林科學(xué)院寧夏回族自治區(qū)銀川市 750002）

分離、鑒定除草劑咪唑乙煙酸降解菌IM9603并優(yōu)化其降解條件。通過形態(tài)學(xué)，生理生化反應(yīng)，16S rDNA初步鑒定該菌株分類地位，利用Box-Behnken優(yōu)化該菌株對咪唑乙煙酸的降解條件。結(jié)果顯示，初步鑒定該菌株屬于表短桿菌屬，在條件（pH5.5，溫度26.2℃，接菌量1 mL（OD600=1））下降解能力最強(qiáng)，菌株IM9603在咪唑乙煙酸初始濃度為50 mg/L 的條件下在7 d內(nèi)降解率可達(dá)93.08%。分離出的咪唑乙煙酸降解菌屬于Brevibacterium epidermidis菌株，該菌株對咪唑乙煙酸具有較高的降解能力，在環(huán)境修復(fù)方面存在潛在的應(yīng)用前景。

咪唑乙煙酸；生物降解；短桿菌屬；響應(yīng)面分析

環(huán)境中除草劑的降解主要有生物降解和非生物降解兩種方法［9］，微生物是除草劑降解的主要因素，它可以利用除草劑為碳源或氮源供其自身生長和繁殖，從而達(dá)到降解除草劑的目的。微生物降解除草劑對環(huán)境無污染，安全性較高［10］，所以分離篩選能高效降解咪唑乙煙酸的微生物是解決以上問題最為有效的途徑。目前國內(nèi)外有關(guān)咪唑乙煙酸生物降解的報(bào)道較少，Ding［11］分離到一株降解菌BH-1，在72 h內(nèi)能降解咪唑乙煙酸（500 mg/L-1）超過90%，該 菌 鑒 定 為 Alcaligenes sp.。Wang［12］發(fā) 現(xiàn) 菌 株WWX-1 Arthrobacter crystallopoietes可以利用咪唑乙煙酸作為唯一碳源生長。Liu［13］在中國東北黑土地分離到一株高效降解菌Acinetobacter baumannii IB5，并對其降解特性以及代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究。

本研究利用長期施用咪唑乙煙酸的大豆田土壤樣品，采用富集馴化的方法分離得到1株可利用咪唑乙煙酸為唯一碳源生長同時(shí)可降解咪唑乙煙酸的菌株IM9603，并對其分類地位和降解特性進(jìn)行了研究，同時(shí)優(yōu)化其對咪唑乙煙酸的降解條件，以期為構(gòu)建高效咪唑乙煙酸降解工程菌和降解酶制劑提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 咪唑乙煙酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）購于美國Sigma-Aldrich公司，咪唑乙煙酸原藥（96%）由農(nóng)藥檢定所提供。甲醇和乙腈均為色譜級，實(shí)驗(yàn)中所用其他試劑均為分析純。高效液相色譜檢測所用樣品均用0.45 μm 的有機(jī)相針式過濾。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基（TYC）：5 g 胰蛋白胨，5 g 酵母粉，1 g K2HPO4，1 g 葡萄糖，蒸餾水1 000mL。無機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM）：1 g NH4NO3，1 g NaCl，0.5 g KH2PO4，1.5 g K2HPO4，0.1 g MgSO4· 7H2O，蒸餾水1 000 mL。

LB培養(yǎng)基：5 g酵母膏，10 g蛋白胨，10 g NaCl，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 富集，分離咪唑乙煙酸降解菌 稱取10 g長期施用咪唑乙煙酸的大豆田土壤樣品并加入到含有100 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃、160r/min培養(yǎng)24 h，取上清液10 mL置于含100 mg/L咪唑乙煙酸的100 mL液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min黑暗培養(yǎng)，7 d后取10 mL轉(zhuǎn)接至含200 mg/L咪唑乙煙酸的100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d。以此類推，連續(xù)富集培養(yǎng)至咪唑乙煙酸終濃度為800 mg/L。吸取100 μL富集液涂布于含800 mg/L咪唑乙煙酸的無機(jī)鹽平板上，28℃培養(yǎng)，直到平板上長出肉眼可見的菌落，挑取菌落進(jìn)一步分離純化。共分離到12株形態(tài)差異的菌株。

將這12株菌株接種于液體LB培養(yǎng)基中，28℃生長24 h，離心收集菌體并用液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基清洗菌體，調(diào)節(jié)OD600使OD600值為1，吸取以上菌懸液1 mL于100 mL含50 mg/L咪唑乙煙酸的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中28℃、160 r/min黑暗培養(yǎng)，7 d后吸取培養(yǎng)液并用0.45 μm有機(jī)相針式過濾器過濾，用高效液相色譜（HPLC）測定菌株降解率。

1.2.2 降解菌的鑒定 選取降解率最高的菌株IM9603進(jìn)行下一步研究。通過形態(tài)學(xué)，生理生化鑒定［14］及16S rDNA鑒定該菌株。16S rDNA擴(kuò)增引物為通用引物：27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和 1492R（TACGGTTACCTTGTTACGACTT）。 將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物公司測序，測得序列提交至NCBI，并在網(wǎng)站EzTaxon 在線比對，采用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 咪唑乙煙酸降解菌降解條件優(yōu)化 影響菌株降解的重要因素包括溫度、pH和接菌量［15］。本實(shí)驗(yàn)所采用溫度范圍：20-40℃；pH：5.0-9.0；接菌量：1-3 mL（OD600= 1）。

采用Box-Behnken統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對以上3個(gè)影響因素進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2，試驗(yàn)結(jié)果為菌株IM9603在含有50 mg/L咪唑乙煙酸無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長第7天的降解率。

應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對表2結(jié)果進(jìn)行分析，同時(shí)繪制三維響應(yīng)面圖，從而獲得最優(yōu)降解條件的理論值。二項(xiàng)式如下所示：

Yi表示除草劑殘余量；Xi，Xj表示可變量；b0表示恒變量；bi表示線性系數(shù)；bij表示相互系數(shù)；bii表示二項(xiàng)系數(shù)。

1.2.4 菌株的生長以及咪唑乙煙酸降解率的測定 在最優(yōu)條件（pH5.5，溫度26.2℃，接菌量1mL（OD600=1））下，將菌株IM9603接種于咪唑乙煙酸濃度為50 mg/L的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔12 h取樣，并用分光光度計(jì)測定600 nm下的吸光值，繪制菌株IM9603的生長曲線。

在上述最優(yōu)條件下每隔12 h取樣，經(jīng)0.45 μm有機(jī)相針式過濾器過濾，將濾液置于4℃冰箱保存，并用高效液相色譜測定其峰面積。

高效液相色譜測定條件：Agilent 1100 Series（具有可調(diào)波長紫外分光檢測器），帶色譜工作站；色譜柱：C18 DiamosilTM 反相柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），粒徑5 μm（迪馬公司）。流動相：乙腈 ∶水（冰乙酸調(diào)pH3.0）=40∶60檢測波長：258 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：30℃。

1.2.5 降解菌對咪唑乙煙酸的降解動力曲線 向100 mL液體無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加入96%的咪唑乙煙酸，使其終濃度依次為50、100、200、300、400mg/L，各接入 1 mL菌懸液（OD600=1），于 28℃、160 r/min、黑暗條件下培養(yǎng)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行，每12 h之后取樣并測其峰面積計(jì)算降解率。

2 結(jié)果

2.1 降解菌的分離和生理生化特性

從東北大豆田土壤樣品中經(jīng)過富集、篩選共分離到12株形態(tài)不同，具有降解咪唑乙煙酸能力的菌株，選取降解能力最強(qiáng)的菌株IM9603做進(jìn)一步研究。菌株IM9603為革蘭氏陽性菌，在MSM培養(yǎng)基上呈圓形，中間凸，表面光滑，淡黃色，表面潮濕，不透明。生理生化特性測定結(jié)果，見表1。

2.2 菌株IM9603 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

對菌株IM9603進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增并測序，序列在GenBank中的注冊號為（KX098473），經(jīng)過EzTaxon在線比對發(fā)現(xiàn)菌株IM9603的16S rDNA與表皮短桿菌的16S rDNA相似度最高，相似性達(dá)99.19%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，初步鑒定該菌株為表皮短桿菌（Brevibacterium epidermidis）。

表1 菌株IM9603 KX098473 生理生化反應(yīng)測定

2.3 菌株降解條件的優(yōu)化

應(yīng)用SAS軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行了回歸分析，得到咪唑乙煙酸殘留量（Y）對自變量溫度（X1），pH值（X2）和接種量（X3）的二次多項(xiàng)式方程如下：

結(jié)果分析顯示溫度，pH值對菌株降解咪唑乙煙酸影響顯著（P＜0.05），而菌體接種量和各因素之間的相互作用影響不顯著（P＞0.05）。

在接種量為1 mL（OD600=1）的條件下，應(yīng)用Box-Behnken繪制溫度、pH與咪唑乙煙酸殘留量之間的響應(yīng)面圖（圖2）。在駐點(diǎn)處的溫度為26.2℃，pH為5.5時(shí)，咪唑乙煙酸殘留量最低。因此得出菌株IM9603降解咪唑乙煙酸的最優(yōu)條件為：溫度26.2℃，pH5.5，接種量為1 mL（OD600=1）。

2.4 菌株生長和降解能力的測定

如圖3所示，在最優(yōu)條件下第4天時(shí)菌株IM9603的生長和降解率均達(dá)到了最大值，咪唑乙煙酸的降解率在65%以上。4 d以后駐點(diǎn)開始衰退，降解能力隨之下降。在第7天時(shí)IM9603的降解率達(dá)到了90%以上。

圖1 菌株IM9603（KX098473）16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

圖2 接菌量為1 mL（OD600 =1），溫度和pH值對菌株IM9603降解咪唑乙煙酸的響應(yīng)面圖

圖3 最優(yōu)條件下菌株IM9603的生長曲線和咪唑乙煙酸的降解

2.5 菌株在不同濃度咪唑乙煙酸的降解動力曲線

在最優(yōu)條件下菌株IM9603的降解動力學(xué)曲線，如圖4所示，在第5天時(shí)咪唑乙煙酸初始濃度為50 mg/L和100 mg/L時(shí)，降解率分別達(dá)到了89.98% 和87.05%，咪唑乙煙酸初始濃度為200 mg/L和300 mg/L時(shí)降解率分別達(dá)到77.49% 和 69.43%。然而，咪唑乙煙酸初始濃度為400 mg/L時(shí)，降解率只有64.56%。

圖4 最優(yōu)條件下菌株IM9603對除草劑咪唑乙煙酸的降解動力曲線

3 討論

本研究以咪唑乙煙酸為唯一碳源，從土壤樣品中分離得到一株高效降解菌IM9603。經(jīng)過形態(tài)學(xué)特征觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)、16S rDNA序列分析，將其鑒定為表皮短桿菌屬。到目前為止，研究者已經(jīng)分離到多種可以降解咪唑乙煙酸的微生物，包括細(xì)菌、真菌和放線菌等［16］，其中對細(xì)菌及真菌的研究較為深入。在細(xì)菌降解除草劑的研究中，假單胞菌屬、芽孢菌屬、黃桿菌屬和產(chǎn)堿菌屬等研究較多，對咪唑乙煙酸的降解能力較強(qiáng)［17］。本研究分離得到的表皮短桿菌具有高效降解咪唑乙煙酸的能力，目前尚未見該菌屬對咪唑乙煙酸降解的相關(guān)報(bào)道。

除草劑的生物降解是目前除草劑降解研究的熱點(diǎn)，并且已經(jīng)取得了相當(dāng)大的研究進(jìn)展，但是應(yīng)用微生物進(jìn)行實(shí)際的生物修復(fù)往往受到環(huán)境中很多因素的影響，如環(huán)境樣品中的pH，水分及有機(jī)質(zhì)的含量、溫度等都影響著除草劑的降解［18］。研究表明，不同比例的腐殖酸可以加快咪唑乙煙酸的降解速率［19］。本研究針對性的選擇了pH（5.0-9.0）和溫度（20-40）℃接菌量（1-3 mL）為影響因子通過Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化菌株IM9603對咪唑乙煙酸在不同溫度以及pH條件下的降解，探究其在不同條件下的降解能力，從而達(dá)到應(yīng)用的潛力。結(jié)果表明在最優(yōu)條件（pH5.5，溫度26.2℃，接菌量1 mL（OD600=1））下，菌株IM9603降解能力最強(qiáng)。

降解動力學(xué)的研究為實(shí)際生產(chǎn)過程中除草劑的處理提供了理論依據(jù)，進(jìn)而達(dá)到減少能耗同時(shí)縮短降解周期的目的［20］。本研究發(fā)現(xiàn)在不同濃度咪唑乙煙酸的降解動力曲線中，菌株IM9603均表現(xiàn)出降解能力，在咪唑乙煙酸含量為50 mg/L降解能力最強(qiáng)，降解率可達(dá)93%。在咪唑乙煙酸濃度為400 mg/L時(shí)降解能力最差，降解率僅為64%。因此，在菌株IM9603實(shí)際應(yīng)用過程中可以通過稀釋等方法調(diào)整咪唑乙煙酸的濃度，從而實(shí)現(xiàn)對咪唑乙煙酸的高效降解。

隨著研究的進(jìn)一步深入以及研究者對除草劑降解規(guī)律的掌握，除草劑的生物降解將會有很大的發(fā)展空間，在除草劑環(huán)境污染的治理過程中將發(fā)揮巨大的作用［21］，如何實(shí)現(xiàn)高效、安全、低成本、無二次污染［22］降解是咪唑乙煙酸生物降解未來發(fā)展方向。有關(guān)該菌株對咪唑乙煙酸的代謝產(chǎn)物的測定，其在土壤中的生態(tài)學(xué)行為，以及其降解基因的克隆及調(diào)控和降解酶制劑等相關(guān)研究還待深入。

4 結(jié)論

從大豆田土壤樣品中分離到一株高效咪唑乙煙酸降解菌IM9603，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化以及16S rDNA初步鑒定為表皮短桿菌Brevibacterium epidermidis?；贐ox-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合SAS軟件進(jìn)行了響應(yīng)面分析，優(yōu)化得到了菌株IM9603對除草劑咪唑乙煙酸降解的最優(yōu)條件（溫度26.2℃；pH為5.5）在此最優(yōu)條件下，菌株IM9603在7 d時(shí)對50 mg/L濃度的咪唑乙煙酸降解率達(dá)到了90%以上，同時(shí)，測定了菌株IM9603在最優(yōu)條件下對咪唑乙煙酸降解的動力學(xué)曲線，結(jié)果表明在低濃度咪唑乙煙酸含量情況下降解率更高。

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Isolation and Identification of an Imazethapyr-degrading Bacterium，and Optimization of Biodegradation Conditions

Lü Fan-yang1XU Ze-hua2MAO Xiao-jie1SUN Jian-guang1
（1. Key Laboratory of Microbial Resources，Ministry of Agriculture / Institute of Agricultural Resources and Regional Planning，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081 ；2. Germplasm Resources Institute，Ningxia Academy of Agriculture and forestry Sciences，Yinchuan 750002）

This work aims to isolate and identify the strain IM9603 degrading herbicide imazethapyr，and optimize the degradation condition. IM9603 was identified as Brevibacterium sp. based on morphological，physio-biochemical characteristics，and analysis of 16S rDNA.Response surface methodology Box-Behnken was applied to optimize the degradation conditions. As results，strain IM9603 degraded 93.08% of the initial 50 mg/L supply of imazethapyr under the optimal condition（pH5 and 26.2℃）within 7 days，which was its best degradability. The isolated imazethapyr-degrading strain was Brevibacterium epidermidis，and presented high degradability to imazethapyr，suggesting that is owns a great potential in the environmental rehabilitation caused by imazethapyr.

imazethapyr；biodegradation；Brevibacterium sp.；response surface methodology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0076

咪唑酮類除草劑從20世紀(jì)80年代開始被廣泛應(yīng)用于大豆田化學(xué)除草［1］。該類除草劑主要通過抑制植物乙酰乳酸合酶（ALS）合成，阻斷植物必需氨基酸的合成從而使植物死亡［2］，目前已經(jīng)被證實(shí)該類除草劑殘留時(shí)間較長，不僅對后茬作物造成嚴(yán)重危害，導(dǎo)致輪作困難，同時(shí)還給環(huán)境帶來了嚴(yán)重的污染［3］。

咪唑乙煙酸（imazethapyr）是咪唑酮類除草劑的種類之一，它具有殺草譜廣、選擇性強(qiáng)、活性高等優(yōu)點(diǎn)［4］。在20世紀(jì)90年代它曾是美國大豆田的第一大除草劑品種，目前主要在中國東北地區(qū)大豆田中使用［5］，主要用來控制一年生及多年生闊葉雜草。該類除草劑有效期長，在土壤中的吸附系數(shù)較低，而且在水中的溶解度較大，不僅對下茬敏感作物產(chǎn)生要害，同時(shí)有可能對地下水造成一定程度的污染［6］。García-Garijo［7-8］發(fā)現(xiàn)咪唑乙煙酸可以快速積累在下茬作物中，如大豆和野豌豆中，在植物組織中抑制ALS的產(chǎn)生。鑒于咪唑乙煙酸的廣泛使用和相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，快速有效去除農(nóng)田土壤中咪唑乙煙酸殘留物是至關(guān)重要的問題。

2017-02-13

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203045）

呂翻洋，女，碩士研究生，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：lvfanyang150@163.com

孫建光，男，博士后，研究員，研究方向：農(nóng)業(yè)微生物資源，環(huán)境污染修復(fù)；E-mail：jgsun@caas.ac.cn

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