10種免疫相關(guān)基因在斜帶石斑魚組織中的表達(dá)分析

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(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013)

2017-09-15

基金頊目：廈門南方海洋研究中心項(xiàng)目(14GZP75NE39)；產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新及科技合作項(xiàng)目(3502Z20172001)；

省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2014R1003-11)；福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)(2014NO.21).

葛 輝(1984-)，男，助理研究員，從事水產(chǎn)生物疾病研究.E-mail：gehuizlj@163.com

林克冰(1964-)，女，研究員，從事海洋生物病害防治技術(shù)研究.E-mail：kebingl@sina.com

葛 輝，林克冰，周 宸，等.10種免疫相關(guān)基因在斜帶石斑魚組織中的表達(dá)分析[J].漁業(yè)研究，2017，39(5)：379-385.

10種免疫相關(guān)基因在斜帶石斑魚組織中的表達(dá)分析

葛輝，林克冰，周宸，吳建紹，朱志煌，陸振，鄭樂云，吳水清，林琪，黃種持

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013)

采用相對實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的表達(dá)量作為內(nèi)參，對健康養(yǎng)殖斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)不同組織(頭腎、心臟、肝臟、脾臟、鰓、肌肉、鰭、眼、腸道)中的10種免疫相關(guān)基因：免疫球蛋白(IgM)、CD4、MHCIIa、TCRβ、CD8a、MHCIa、ISP16、Mx、TNFR14、HSP90的mRNA表達(dá)量進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，10種免疫相關(guān)基因在斜帶石斑魚的10種組織中均有表達(dá)。其中體液免疫相關(guān)基因[免疫球蛋白(IgM)、CD4和MHCIIa]在鰓中的表達(dá)量最高，在其他組織部位的表達(dá)量相對較少。細(xì)胞免疫相關(guān)基因(TCRβ、CD8a和MHCIa)也是在鰓中的表達(dá)量最高，在眼、肌肉、肝和腸的部位表達(dá)量相對較少。ISP16在鰓和肝中的表達(dá)量較高，在肌肉和腸中的表達(dá)量較低。Mx在鰓中的表達(dá)量較高，在肌肉和腸的表達(dá)量較低。TNFR14在眼的表達(dá)量較高，在腸的表達(dá)量較低。HSP90在鰓和肝中的表達(dá)量相對較高，在心和肌肉的表達(dá)量較低。

斜帶石斑魚；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)；免疫基因

斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)屬于鮨科(Serranidae)，石斑魚屬(Epinephelus)，屬廣鹽性魚類。2014年全國石斑魚的產(chǎn)量為88 130 t，其中廣東、海南和福建的產(chǎn)量分別為36 138 t、24 783 t和24 676 t。隨著石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)量的急劇增加，而養(yǎng)殖戶缺乏科學(xué)的病害防治技術(shù)，導(dǎo)致石斑魚的病害問題日趨嚴(yán)重。對石斑魚的疾病防治除了要保持良好的養(yǎng)殖水環(huán)境、合理的養(yǎng)殖密度和藥物治療外，增強(qiáng)石斑魚自身的免疫能力具有其獨(dú)特的優(yōu)越性。近年來，學(xué)者們陸續(xù)開展了益生菌、拮抗蛋白等研究來提高石斑魚的免疫能力。因此，開展石斑魚的免疫學(xué)相關(guān)的基礎(chǔ)研究具有很大的實(shí)踐意義[1-7]。

免疫(Immunity)是指機(jī)體對抗病原體引起疾病的能力，免疫系統(tǒng)是防御和維護(hù)自身穩(wěn)定的一個(gè)防衛(wèi)系統(tǒng)。魚類免疫系統(tǒng)包括免疫組織和器官、免疫細(xì)胞和體液免疫因子3大類。魚類的免疫相關(guān)器官和組織主要包括胸腺、腎臟、脾臟和粘膜相關(guān)淋巴組織等[8-9]。免疫球蛋白(IgM)、CD4和MHCIIa是體液免疫相關(guān)基因，TCRβ、CD8a和MHCIa是細(xì)胞免疫相關(guān)基因，ISP16、Mx和腫瘤壞死因子(TNFR14)是抗病毒通路相關(guān)蛋白，HSP90是分子伴侶。免疫組織和細(xì)胞是魚類防御系統(tǒng)的基礎(chǔ)，是魚類抵御病原入侵的最初防線，體液免疫因子作為免疫應(yīng)答的效應(yīng)分子對病原具有直接的防御作用[10-11]。本研究應(yīng)用相對定量RT-PCR技術(shù)對健康斜帶石斑魚的不同組織(頭腎、心臟、肝臟、脾臟、鰓、肌肉、鰭、眼、腸道)中10種免疫相關(guān)基因[免疫球蛋白(IgM)、CD4、MHCIIa、TCRβ、CD8a、MHCIa、ISP16、Mx、TNFR14、HSP90]的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行研究，希望在分子水平上為斜帶石斑魚的免疫學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)所用斜帶石斑魚來源于漳州漳浦海區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖，選擇20尾體色正常、體質(zhì)健壯、體表無損傷，平均體重在(80±3)g，養(yǎng)殖周期相同的個(gè)體用于實(shí)驗(yàn)研究。采集時(shí)間為2016年3月18日。

1.2試劑、耗材和儀器

無菌水；0.9%生理鹽水；75%酒精；無菌吸管；解刨工具；凍存管；qPCR儀器，勻漿機(jī)。

1.3取樣方法

在取樣前，將取回的斜帶石斑魚暫養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室，暫養(yǎng)用水取自其養(yǎng)殖場。取樣解剖前饑餓24 h。從養(yǎng)殖箱中隨機(jī)選取10尾石斑魚，解剖前測量體長、體重。先用無菌生理鹽水沖洗實(shí)驗(yàn)用石斑魚體表，無菌條件下，用滅菌剪刀剪開魚體璧，分別取出頭腎、心臟、肝臟、脾臟、鰓、肌肉、鰭、眼、腸道，置于1.5 mL凍存管內(nèi)，并立刻將其放入液氨中保存。

1.4 RNA提取

將樣品置于1 mL Trizol試劑(Qiagen)中，并分別勻漿。按照Trizol試劑使用說明書，從不同組織提取總RNA，并在1.5%變性瓊脂糖凝膠上電泳以測試完整性。使用Nanodrop ND-1000UV分光光度計(jì)(Nanodrop TM)測定RNA的數(shù)量和質(zhì)量(Technologies，Wilmington，DE，USA)。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增反應(yīng)(qRT-PCR)

根據(jù)制造商的方案，使用QuantScript RT Kit(TIANGEN)進(jìn)行cDNA合成，然后將cDNA儲(chǔ)存在-20℃下備用。三個(gè)重復(fù)的反應(yīng)以總體積為25 μL進(jìn)行，其中含有12.5 μL 2×SYBR Premix Ex Taq II(Perfect Real Time)(TaKaRa，Japan)、1.0 μL cDNA模板、0.8 μL 10 μmol·L-1每個(gè)正向和反向引物以及9.9 μL Milli-Q水。

PCR程序是：95℃進(jìn)行5 min，然后是95℃持續(xù)10 s、退火溫度58℃持續(xù)20 s和72℃持續(xù)30 s的40個(gè)循環(huán)。在每次運(yùn)行結(jié)束時(shí)，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析(60～95℃)，以確保單個(gè)產(chǎn)物被擴(kuò)增。使用cDNA的稀釋系列監(jiān)測每個(gè)引物對的擴(kuò)增效率。所有放大效率在98%和101%之間。用比較Ct法2△△Ct法計(jì)算靶基因的相對表達(dá)，用β-actin標(biāo)準(zhǔn)化。采用SPSS 20.0對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan氏多重檢驗(yàn)(P<0.05)。

使用Primer Express 2.0軟件(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)并從Invitrogen公司合成所有引物(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

續(xù)表1

2 結(jié)果

如圖1所示，本文通過qRT-PCR技術(shù)分析10種體液、細(xì)胞和先天免疫相關(guān)的基因，觀察其在健康斜帶石斑魚不同組織中的免疫力。其中免疫球蛋白(IgM)、CD4和MHCIIa在鰓中的表達(dá)量最高，與其他組具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，在其他組織部位的表達(dá)量相對較少。TCR-β、CD8a和MHCIa也是在鰓中的表達(dá)量最高，在眼、肌肉、肝和腸的部位表達(dá)量相對較少。ISP16在鰓和肝中的表達(dá)量較高，在肌肉和腸中的表達(dá)量較低。Mx在鰓中的表達(dá)量較高，在肌肉和腸的表達(dá)量較低。TNFR14在眼的表達(dá)量較高，在腸的表達(dá)量較低。HSP90在鰓和肝中的表達(dá)量相對較高，在心和肌肉的表達(dá)量較低。

A：IgM mRNA； B：CD4 mRNA；C：MHCIIa mRNA；D：TCRβ mRNA ；E：CD8a mRNA；F：MHCIa mRNA；G：ISP16 mRNA ；H：Mx mRNA ；I：TNFR14 mRNA ；J：HSP90 mRNA

注：具有不同字母的值在0.05的顯著性水平上表示顯著差異(P<0.05)。

Note：Values with different letters represented significant difference at the significance level of 0.05(P<0.05).

3 討論

近年來受養(yǎng)殖密度不斷增大和水質(zhì)污染的影響，斜帶石斑魚的病害明顯增多。斜帶石斑魚病害的防治，除了需要良好的養(yǎng)殖環(huán)境和藥物治療外，還需要提高魚體自身的免疫能力，特別對于與病毒相關(guān)的病害，更需要卓有成效的免疫防治。因此有必要進(jìn)行與免疫相關(guān)的基礎(chǔ)研究。目前對斜帶石斑魚的基礎(chǔ)免疫學(xué)研究報(bào)道較少，所以本研究選用斜帶石斑魚為實(shí)驗(yàn)對象，分析了10種免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體液免疫相關(guān)基因[免疫球蛋白(IgM)、CD4和MHCIIa]的表達(dá)量在各組織中高低不一，在鰓中的表達(dá)量相對較高，在肌肉、肝和腸的表達(dá)量相對較低。這可能與鰓是斜帶石斑魚的呼吸器官，接觸水環(huán)境較多有關(guān)，且鰓是血液豐富的部位，所以體液免疫相關(guān)基因在鰓中的表達(dá)量相對較高。CD4、MHCIIa和某些免疫球蛋白通常用作體液免疫的標(biāo)志物，IgM是腫瘤免疫的直接指標(biāo)[12]。在本研究中，CD4、MHCIIa和IgM在鰓、頭腎和脾臟中均表現(xiàn)出大量的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。當(dāng)石斑魚、鱸魚和大西洋大比目魚患有β-亞麻病毒感染時(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)IgM也大量表達(dá)[13-15]。所以可根據(jù)IgM在石斑魚抵抗病毒感染時(shí)會(huì)大量表達(dá)的現(xiàn)象來進(jìn)行病害防御。鰓、頭腎和脾臟是表達(dá)IgM的活躍組織。

與體液免疫相似，細(xì)胞免疫在宿主抗病毒反應(yīng)中起到重要作用。TCR-β是一種重要的T細(xì)胞標(biāo)記，通常與CD8/MHCIa復(fù)合物配合以介導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)[16-18]。曾有研究報(bào)道感染期間TCR-β、CD8a和MHCIa的表達(dá)上調(diào)[19-23]，表明這些分子可能在抗病毒免疫中起重要作用。因此，本研究觀察到在鰓、頭腎、脾臟和心中，TCR-β、CD8a和MHCIa的相對表達(dá)量較高，表明這幾個(gè)部位可能是斜帶石斑魚抵抗病毒進(jìn)行細(xì)胞免疫的主要器官。

通常，當(dāng)脊椎動(dòng)物遭受病毒感染時(shí)，干擾素信號(hào)通路首先被激活。在神經(jīng)壞死病毒(NNV)感染斑馬魚的實(shí)驗(yàn)中，干擾素途徑涉及急性和持續(xù)性感染[24]。Mx和ISP16是表現(xiàn)出抗病毒活性的干擾素途徑因子[25-26]。在甜菜堿病毒感染幾種魚類過程中觀察到Mx的mRNA表達(dá)量劇烈上調(diào)[27]。此外，注射干擾素可以拯救感染神經(jīng)壞死病毒(NNV)的魚[24]。在本研究中，ISP16在心、鰓、脾臟和肝臟中的相對表達(dá)量較高，Mx在眼、心臟、頭腎、鰓、脾臟和肝臟中的表達(dá)量較高，TNFR14在眼和鰓中的表達(dá)量較高。表明當(dāng)斜帶石斑魚遭受病毒感染時(shí)，干擾素途徑將會(huì)為這些組織器官提供保護(hù)。在斜帶石斑魚的應(yīng)激過程中，一些病毒會(huì)引起熱休克反應(yīng)，HSP90通常參與應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用[27]。在本研究中HSP90在多個(gè)組織中均有表達(dá)，在眼、鰓、鰭、肝和腸的表達(dá)量相對較高。多個(gè)研究報(bào)道說明當(dāng)宿主感染病毒時(shí)HSP90會(huì)大量表達(dá)，表明HSP90在宿主體內(nèi)抗病毒的重要作用[28-29]。

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mRNAexpressionoftenimmunegenesintissuesofEpinepheluscoioides

GEHui，LINKebing*，ZHOUChen，WUJianshao，ZHUZhihuang，LUZhen，ZHENGLeyun，WUShuiqing，LINQi，HUANGZhongchi

(Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian， Fisheries Research Institute of Fujian Province，Xiamen 361013，China)

In this study，β-actin mRNA expression was used as the internal reference，the mRNA expression of ten immune genes[(IgM)，CD4，MHCIIa，TCRβ，CD8a，MHCIa，ISP16，Mx，TNFR14，HSP90]were analyzed in tissues (head kidney，heart，liver，spleen，gill，muscle，fin，eye and intestine) ofEpinepheluscoioideswith quantitative Real-time PCR.The results showed that mRNA expressions of ten genes were observed in all of the above tissues.And the humoral immunity factors (IgM，CD4，MHCIIa) showed a highest expression in the gill，cellular immunity factors (TCR-β，CD8a and MHCIa) also showed a higher expression in the gill and lower in the eyes，muscles，liver and intestine.The expression of ISP16 in gill and liver was higher，and lower in muscle and intestine.TNFR14 in the eye was higher and the expression level in the intestine was lower.The expression of HSP90 in the gills and liver was relatively high，while the expression of HSP90 was lower in the heart and muscle.

Epinepheluscoioides；quantitative Real-time PCR；immune genes

S917.4

A

1006-5601(2017)05-0379-07