源于海洋貝類蛋白的ACE抑制肽研究現(xiàn)狀

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(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023)

2017-06-26

基金頊目：黃渤海區(qū)域主要水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物高值化利用產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)集成及示范(201505030)；貝類高質(zhì)化加工裝備和綜合利用關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)與應(yīng)用(201505029).

李晶晶(1992-)，女，遼寧，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué).Tel：18742040621.E-mail：839405884@qq.com

盧 航(1982-)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與海洋資源利用.Tel：13842863331.E-mail：luhang@dlou.edu.cn

李晶晶 ，顏 澤，楊 敏，等.源于海洋貝類蛋白的ACE抑制肽研究現(xiàn)狀[J].漁業(yè)研究，2017，39(5)：411-418.

源于海洋貝類蛋白的ACE抑制肽研究現(xiàn)狀

李晶晶，顏澤，楊敏，吳兆明，丁宇寧，隋燕妮，盧航*

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023)

ACE抑制肽在血壓調(diào)節(jié)方面起著重要作用，而海洋貝類含有豐富的蛋白質(zhì)，并具有開發(fā)ACE抑制肽的潛能。本文主要簡述了源于海洋貝類蛋白源的ACE抑制肽的制備、分離純化、活性評價及構(gòu)效關(guān)系等方面，以期為海洋貝類蛋白的開發(fā)利用提供參考。

ACE抑制肽；貝類；蛋白源；降血壓

高血壓是因動脈血壓持續(xù)過高而引起中風(fēng)、冠心病、血管瘤、腎衰竭、動脈粥樣硬化等一類疾病，被認(rèn)定為生命“第一殺手”[1]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin convert enzyme，ACE)在生物體內(nèi)具有調(diào)節(jié)血壓的功能，是一種含Zn2+輔基的二肽羧肽酶[2]，在腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system，RAS)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Kallikrein - kinin system，KKS)中可催化無活性的血管緊張素Ⅰ(Ang Ⅰ)轉(zhuǎn)化成具有收縮血管作用的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)，促使血壓升高，因此可通過抑制ACE的活性，達(dá)到預(yù)防和治療高血壓等相關(guān)疾病[3-4]。目前，市面上常見的降血壓藥物，如卡托普利、依那普利、阿拉普利和賴諾普利等，均具有ACE抑制作用，雖然此類藥物藥效明顯，但由于其為化學(xué)合成藥物，存在一定的副作用，如過敏反應(yīng)、皮膚皮疹、咳嗽、味覺紊亂等[5]，因此研究者不斷探求具有ACE抑制活性的天然成分，如ACE抑制肽，作為合成藥物的替代品。本文主要簡述了源于海洋貝類蛋白源的ACE抑制肽的制備、分離純化、活性評價及構(gòu)效關(guān)系等方面，以期為海洋貝類蛋白的開發(fā)利用提供參考。

1 ACE抑制肽

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽(Angiotensin convert enzyme peptides， ACE抑制肽)是一類具有ACE抑制活性的多肽物質(zhì)，大多由2～12個氨基酸組成，極個別由更多個氨基酸組成。如今，ACE抑制肽的降壓機(jī)制通常采用Cushman等[6]所提出的抑制劑與ACE活性區(qū)域競爭性結(jié)合的假設(shè)模型來解釋(如圖1)。S1、S2、S3是ACE活性區(qū)域的三個必需結(jié)合點(diǎn)，X-H為氫鍵，而ACE抑制肽C端的氨基酸殘基或基團(tuán)與ACE的結(jié)合度高于AngⅠ，從而起到競爭性抑制作用。

目前，從植物(谷類[7]、豆類[8]、水果[9]等)、陸生動物(牛[10]、豬[11]等)和海洋生物(魚類[12]、藻類[13]、蝦類[14]、貝類[15]等)中均已發(fā)現(xiàn)大量結(jié)構(gòu)不同的ACE抑制肽，其中海洋生物因特殊的生活環(huán)境，導(dǎo)致其蛋白結(jié)構(gòu)組成及氨基酸序列異于陸生生物[16]，因此，許多研究學(xué)者對海洋生物中的貝類蛋白進(jìn)行開發(fā)，以期尋找高效安全的ACE抑制肽。

2 海洋貝類ACE抑制肽的制備

目前，研究學(xué)者已經(jīng)從牡蠣、扇貝、貽貝、文蛤及鮑魚等多種貝類中分離出具有ACE抑制活性的肽段。制備ACE抑制肽的步驟主要包括ACE抑制肽提取、純化、結(jié)構(gòu)鑒定、活性評估等幾方面。

2.1 ACE抑制肽的提取方法

源于海洋貝類蛋白源的ACE抑制肽[17]制備方法主要有三種：物理及化學(xué)提取法、合成法、酶解法。

2.1.1 物理及化學(xué)提取法

采用加熱、劇烈振蕩、超聲波破碎等物理方法，或通過添加適宜的溶劑、調(diào)節(jié)適宜的pH值等化學(xué)方法(如鹽析法、層析法、沉淀法[18])將蛋白質(zhì)變成短肽，此類方法工藝簡單、成本低，但水解程度難以控制，影響肽的結(jié)構(gòu)和功能，所能提取到的ACE抑制肽資源有限，不僅浪費(fèi)了原料的營養(yǎng)成分，而且提取過程可能殘存有機(jī)溶劑，導(dǎo)致安全問題[19]。

2.1.2 合成法

合成法包括化學(xué)合成法和DNA重組法?；瘜W(xué)合成法[20]是指將已知氨基酸序列的目標(biāo)多肽的C端羧基與一個不溶性的高分子樹脂之間形成共價鍵，另一端的氨基與下一個氨基酸的羧基形成肽鍵，以此類推，便可形成目標(biāo)多肽，此技術(shù)比較成熟，可實(shí)現(xiàn)自動化，但設(shè)備及試劑昂貴，又存在消旋化、毒性殘留等問題；DNA重組法是指根據(jù)已知的mRNA和肽鏈，以堿基互補(bǔ)配對法推算DNA序列，再經(jīng)PCR技術(shù)得到目的基因，此方法可大量合成所需要的活性肽，但其主要用于大分子肽段的制備，限制了應(yīng)用于ACE抑制肽的合成。目前，未見合成法應(yīng)用于海洋貝類ACE抑制肽的制備中，但Xie Cheng-liang等[21]將來自于牡蠣水解產(chǎn)物的YA、KY和TAY，通過在C末端修飾Trp合成四種新型三肽VKW、YAW、KYW和TAW，測得它們的IC50分別為0.009、0.232、0.228和0.259 μg/mL，比相應(yīng)的原始肽段的ACE抑制活性增加了27～1 450倍。

2.1.3 酶解法

利用酶解法制備ACE抑制肽的研究最為廣泛，主要包括蛋白酶直接酶解和微生物發(fā)酵間接酶解。酶解法制備ACE抑制肽具有反應(yīng)條件溫和、成本低、安全性高、無副作用等優(yōu)點(diǎn)，是目前海洋貝類蛋白源ACE抑制肽提取最常采用的方法。各蛋白酶因其來源、反應(yīng)條件、酶切位點(diǎn)等不同，可得到不同結(jié)構(gòu)的多肽混合物，這決定了ACE抑制肽的不同抑制效果[22]。白仁奧等[23]以水解度為評定指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)確定復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶等五種單一酶酶解文蛤的最適條件，結(jié)果得出，當(dāng)五種蛋白酶的水解產(chǎn)物濃度為2 mg/mL時，其ACE抑制率達(dá)到最高，分別為復(fù)合蛋白酶42.33%、中性蛋白酶41.8%、木瓜蛋白酶50.22%、堿性蛋白酶64.01%、風(fēng)味蛋白酶35.92%；陳應(yīng)運(yùn)等[24]以ACE抑制率和總肽含量為指標(biāo)，采用五因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化納豆菌液態(tài)法發(fā)酵蛤蜊制備ACE抑制肽，得到在發(fā)酵溫度45℃、發(fā)酵時間24 h、接種量5%、料液比1∶25、蔗糖添加量10%的條件下，發(fā)酵產(chǎn)物的ACE抑制率達(dá)80.49%，總肽含量達(dá)11.53 mg/mL。

2.2 ACE抑制肽的分離純化

分離純化是ACE抑制肽制備過程中最重要的環(huán)節(jié)，主要是因?yàn)槎嚯奶崛∥锍煞謴?fù)雜，且ACE抑制肽含量甚少。分離純化的方法有鹽析法、電泳法、超濾法、色譜法、聯(lián)用技術(shù)等[25]，其中常用于海洋貝類蛋白ACE抑制肽分離純化的方法是超濾法和色譜法。

超濾法是膜分離技術(shù)中的一種方法，即在壓力差的作用下，以過膜孔徑的大小使多肽混合物進(jìn)行分離[26]，而在分離純化過程中，通常采用一種或多種不同孔徑的超濾膜進(jìn)行分離，從而可獲得不同分子量范圍的多肽組分，提高樣品的純度。該方法進(jìn)樣量大、成本低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。張艷萍等[27]將紫貽貝酶解物先后經(jīng)10 kDa、1 kDa超濾膜分離，得到截留分子量小于10 kDa的酶解物，并且其ACE抑制率提高到89.42 %、IC50降低到40.03 μg/mL。但由于超濾法不能將分子量極其相近的多肽進(jìn)行分離，故在后續(xù)的純化工作中往往還采用色譜法對目標(biāo)多肽進(jìn)行純化。

色譜法在貝類蛋白源ACE抑制肽分離純化過程中起到至關(guān)重要的作用。常采用的色譜法有凝膠過濾色譜法(GFC)、離子交換層析法(IEC)和反相高效液相色譜法(RP-HPLC)等[28]，其中凝膠過濾色譜法即分子篩，根據(jù)多肽分子量的大小進(jìn)行初步分離，其實(shí)驗(yàn)條件溫和、填料可反復(fù)使用；離子交換層析法即陰陽離子柱，根據(jù)被分離組分與固定相之間的離子交換能力進(jìn)行分離，該方法分離效果差，主要用于粗分離；反相高效液相色譜法具有高效、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但其設(shè)備及試劑昂貴，處理量少，主要用于精細(xì)分離純化?，F(xiàn)大多數(shù)研究學(xué)者將上述三種色譜法聯(lián)合使用，取長補(bǔ)短以達(dá)到更好的純化效果。如Je J Y等[29]將藍(lán)貽貝在20℃溫度下用25% NaCl(w/w)發(fā)酵6個月，經(jīng)40目過篩和電滲析儀脫鹽后凍干，得到的樣品IC50值為1 010 μg/mL，之后通過Sephadex G-75凝膠色譜、SP-Sephadex C-25離子交換層析及反相高效液相色譜法(C18柱)純化后，獲得N-末端序列為EVMAGNLYPG的10個氨基酸殘基，其ACE抑制活性升高，IC50值為19.34 μg/mL。

除此之外，將超濾法與色譜法結(jié)合應(yīng)用于貝類蛋白源ACE抑制肽分離純化，可以使分離效果更為清晰，純化后的樣品更可能為單一組分，也是目前許多研究學(xué)者常常采用的方法之一，如陳小藝等[30]將皺紋盤鮑內(nèi)臟膠原經(jīng)3 kDa超濾膜分離，分子量小于3 kDa的組分通過DEAE-52纖維素柱層析分離后，再用葡聚糖凝膠G-25分子篩柱洗脫，得到單一組分峰，ACE抑制率為82.12%，經(jīng)傅里葉紅外光譜分析，初步認(rèn)為得到的鮑魚內(nèi)臟膠原ACE抑制肽中具有的β-折疊和α-螺旋結(jié)構(gòu)對ACE抑制活性起到重要作用。

2.3 ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)鑒定

多肽的結(jié)構(gòu)鑒定即為其氨基酸序列的確定，氨基酸的排列順序是蛋白質(zhì)或多肽高級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，決定著空間結(jié)構(gòu)及功能特性等。多肽的氨基酸序列測定最初采用的是Edman降解法，該方法分為耦合、切割、萃取、轉(zhuǎn)化、鑒定等步驟，程序復(fù)雜且工作量大，所需的樣品量較多，對待測樣品的純度要求更高，并且由于降解過程始于蛋白N-末端的第一個氨基酸，因此Edman降解法不能用于N-末端封閉或是經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)樣品的鑒定[31]。

如今，隨著科技的發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)已成為多肽序列測定最廣泛使用的方法之一，該方法能精準(zhǔn)地測定蛋白質(zhì)或多肽的分子質(zhì)量及在分析過程中可能產(chǎn)生的碎片離子的分子質(zhì)量，具有快速、高靈敏度的特點(diǎn)。吳體智等[15]以超濾技術(shù)與離子交換法對雜色蛤酶解物進(jìn)行分離，通過質(zhì)譜分析與已有序列比對得到67個多肽，用Chem Bio Draw Ultra13.0軟件繪制已知的67個多肽的分子結(jié)構(gòu)式，用DS中CleanGeometry 工具對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，然后再利用CHARMm工具對其進(jìn)行能量優(yōu)化，即為配體；再根據(jù)ACE-lisinopril復(fù)合物(1O86.pdb)X衍射三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(PDB code：1O86)，確定抑制肽與ACE相互作用的結(jié)合位點(diǎn)，并利用Discovery Studio3.0軟件處理該蛋白質(zhì)，即為受體蛋白；最后按照計算機(jī)模擬分子對接程序，使用CDDOCK程序?qū)⑴潴w對接到受體中去。根據(jù)所得結(jié)果中-CDOCKER_ENERGY值，發(fā)現(xiàn)QIIVQDLTKR、LDYRPGDKFKGT、NTQIIVQDLTKR和LLFDRAPVNFGNYR這四個多肽能與ACE穩(wěn)定結(jié)合，從而建立了一種能快速地從混合多肽中篩選、鑒定活性多肽的方法。

2.4 ACE抑制肽的活性評估

目前，ACE抑制肽的活性評估方法主要采取體外檢測和體內(nèi)檢測兩種。

2.4.1 貝類蛋白源ACE抑制肽體外活性檢測

體外檢測是指根據(jù)ACE具有可特異性地切除多肽C末端兩個氨基酸的這一特點(diǎn)，利用人工合成的馬尿酸-組氨酸-亮氨酸(HHL)或呋喃丙烯酰三肽(FA-Phe-Gly-Gly，F(xiàn)APGG)為底物進(jìn)行檢測分析。

ACE抑制肽的體外活性檢測主要有三種方法：1)分光光度法，以Cushman等[32]首創(chuàng)的紫外分光光度法最為經(jīng)典，即以HHL為底物，在37℃條件下，同時加入ACE和ACE抑制劑，其中ACE可將HHL分解成馬尿酸(Hippuric Acid，Hip)和二肽(His-Leu，HL)，根據(jù)Hip的生成量來判斷ACE抑制劑的強(qiáng)弱，然而HHL和Hip在波長228 nm處均有特征吸收峰，故必須用乙酸乙酯萃取Hip，但操作繁瑣，易使實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏高；2)可見光光度法，即ACE可將藍(lán)色的FAPGG水解成氨基酸(FA-Phe)和二肽(Gly-Gly)，通過測定加入ACE抑制劑前后，F(xiàn)APGG在波長340 nm下光吸收減弱的程度來評價ACE抑制劑作用的強(qiáng)弱；3)高效液相色譜法，以紫外分光光度法原理為基礎(chǔ)，使實(shí)驗(yàn)操作簡便且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確，是最常用的測定方法。部分源于海洋貝類蛋白源ACE抑制肽體外檢測結(jié)果如表1所示。

表1 源于海洋貝類蛋白源ACE抑制肽體外檢測結(jié)果

注：IC50即抑制50% ACE活性所需的ACE抑制劑濃度。

Note：IC50was the ACE inhibitor concentration that required to inhibit 50% ACE activity.

2.4.2 貝類蛋白源ACE抑制肽體內(nèi)活性檢測

體內(nèi)檢測，是指通過動物實(shí)驗(yàn)來證明ACE抑制肽的降血壓效果，較體外活性檢測更能準(zhǔn)確地評估ACE抑制肽的活性強(qiáng)弱，這是因?yàn)橐恍┦吃葱訟CE抑制肽在消化道內(nèi)，可能會被消化酶分解，而降低其ACE抑制活性[42]。

動物實(shí)驗(yàn)有兩種方法：1)對原自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHRs大鼠)通過直接灌胃、胃插管或靜脈注射等方式給予ACE抑制劑。2)首先對麻醉的大鼠靜脈注射六甲胺(排除其他對腎素-血管緊張素系統(tǒng)干擾的藥物)，再繼續(xù)靜脈注射ACE抑制劑；通過測定動脈收縮壓的大小(鼠尾套法)或各血脂指標(biāo)的含量(試劑盒法)來評價其降血壓的效果。Zhang Li等[43]混合使用中性蛋白酶與胰蛋白酶酶解扇貝裙邊，得到的酶解液中含有大量的Glu、Gly、Asp、Arg、Ala和Pro等氨基酸，體外檢測IC50值為10.28 mg/mL，用該酶解液灌胃高脂癥大鼠56 d后，通過試劑盒法測出大鼠血清中膽固醇和甘油三酯含量降低，高密度脂蛋白含量升高，表明該酶解液對高脂大鼠有降脂作用。Shiozaki K等[34]發(fā)現(xiàn)用胰蛋白酶酶解牡蠣后得到的酶解液具有ACE抑制活性，將酶解液分別短期和長期地灌胃高脂癥大鼠，通過鼠尾套法測得短期給藥6 h時的大鼠心臟收縮壓最小，長期給藥可以有效降低大鼠的心臟收縮壓，可能是因?yàn)槟迪牂M紋肌中所發(fā)現(xiàn)肽段為Asp-Leu-Thr-Asp-Tyr(IC50值為0.089 4 mg/mL)的ACE抑制肽抑制了ACE活性，進(jìn)而降低了大鼠的心臟收縮壓。

3 ACE抑制肽的構(gòu)效關(guān)系

目前，國內(nèi)外研究表明，ACE抑制肽的活性大小與其分子量大小、氨基酸序列及氨基酸構(gòu)象密切相關(guān)。普遍認(rèn)為分子量越小的肽段，其ACE抑制能力越大[44]，但有相關(guān)文獻(xiàn)表明并不是所有的ACE抑制肽都符合這一規(guī)律，如于婭等[45]用堿性蛋白酶將牡蠣蛋白酶解后，通過Sephadex G-15得到的具有ACE抑制活性的短肽，其中相對分子質(zhì)量較大和較小的部分抑制率均較低，當(dāng)相對分子質(zhì)量在202～602 Da之間時，即大致為2肽到5肽的牡蠣短肽具有很強(qiáng)的ACE抑制活性。

此外，不同原料中得到的ACE抑制肽，因氨基酸序列差異大，而表現(xiàn)出參差不齊的ACE抑制能力。相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，ACE抑制肽C末端三個氨基酸的種類是抑制ACE活性強(qiáng)弱的關(guān)鍵[46]，當(dāng)C末端氨基酸為芳香族氨基酸(Trp、Tyr、Phe)、脂肪族氨基酸(Ile、Ala、Leu、Met)或倒數(shù)第二個氨基酸為脂肪族氨基酸(Val、Ile、Ala)、堿性(Lys、Arg、His)和芳香族氨基酸(Tyr、Phe)時，ACE抑制肽具有較強(qiáng)的ACE抑制能力，并且N末端為脂肪族氨基酸(Val、Ile)時，也可增強(qiáng)抑制ACE的能力。Suetsunl等[47]通過分析源于貝類ACE抑制肽的氨基酸組成，發(fā)現(xiàn)來源于貝類的ACE抑制肽中富含Asp、Gly、Lys。

ACE抑制能力的大小除了與ACE抑制肽的一級結(jié)構(gòu)氨基酸的數(shù)量、種類和序列有關(guān)外，也與其構(gòu)象存在一定的關(guān)系，如裙帶菜經(jīng)酶解[48]和熱水浸提[49]得到的ACE抑制肽肽段的氨基酸序列均為FY，但它們的IC50卻有所不同，分別為14.639 μg/mL、1.280 μg/mL，可能是由于提取的手段不同，導(dǎo)致氨基酸構(gòu)象存在差異，以致ACE抑制能力大小也不同。

4 展望

以天然、健康為主題的21世紀(jì)，食療和保健已成為當(dāng)今社會的熱門話題之一，其中來源于食物蛋白源的ACE抑制類降血壓藥物的開發(fā)已受到人們的關(guān)注[50]。目前，國內(nèi)外提取ACE抑制肽的手段主要是發(fā)酵或酶解法，分離純化過程較復(fù)雜，仍需要更多的關(guān)鍵性技術(shù)使研究過程更為方便、快捷。對于未來海洋貝類ACE抑制肽的研究應(yīng)更傾向于海洋低值貝類或人工養(yǎng)殖品種的加工副產(chǎn)物，如扇貝裙邊、鮑魚性腺、蒸煮液、牡蠣汁等，它們本身含有豐富的蛋白質(zhì)，且不遜色于肉，因此如何更高效、綜合地利用貝類蛋白資源以制備出更多新型ACE抑制肽可能會成為未來研究的熱點(diǎn)。

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ResearchstatusofACEinhibitorypeptidesfrommarineshellfishprotein

LIJingjing，YANZe，YANGMin，WUZhaoming，DINGYuning，SUIYanni，LUHang*

(College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China)

ACE inhibitory peptides play an important role in blood pressure regulation，while marine shellfish are rich in proteins and have the potential to develop ACE inhibitory peptides.The paper reviewed the antihypertensive principle，preparation，separation and purification，activity determination methods and structure-activity relationship of ACE inhibitory peptides derived from marine shellfish protein in order to provide reference for the development and utilization of marine shellfish protein.

ACE inhibitory peptide；shellfish；protein source；hypertension

TS254.9

A

1006-5601(2017)05-0411-08