響應(yīng)面與酶法優(yōu)化拐棗膳食纖維的提取工藝

盧忠英，王云洋，魯?shù)劳愂藢W(xué)，姚元勇

（銅仁學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州銅仁554300）

響應(yīng)面與酶法優(yōu)化拐棗膳食纖維的提取工藝

盧忠英，王云洋，魯?shù)劳?，陳仕學(xué)*，姚元勇

（銅仁學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州銅仁554300）

以拐棗為試驗(yàn)材料，采用酶法對(duì)可溶性膳食纖維進(jìn)行提取。在酶解溫度、酶解時(shí)間、pH值、酶用量4個(gè)單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝參數(shù)。結(jié)果表明：拐棗中可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）得率最佳提取工藝條件為酶解溫度60℃，酶解時(shí)間70 min，pH值為5.0，酶用量0.6%。拐棗中SDF得率可達(dá)14.22%，與SDF的提取理論值比較，其相對(duì)誤差約為0.42%，且重復(fù)性好，說(shuō)明響應(yīng)面法建立的數(shù)學(xué)模型對(duì)拐棗中SDF提取具有穩(wěn)定可靠性。

拐棗；可溶性膳食纖維；提取工藝；響應(yīng)面

拐棗（Hovenia dulcis）學(xué)名枳椇，俗稱萬(wàn)壽果，雞爪李，是枳椇屬鼠李科枳屬植物，食用部分是果柄，屬于藥食同源植物之一，在我國(guó)已有1500多年歷史[1]。拐棗食用部位營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，據(jù)資料顯示，富含生物活性成分多樣，有拐棗多糖、蘋果酸鈣、蛋白質(zhì)、維生素、有機(jī)酸、礦物質(zhì)及黃酮類等活性物質(zhì)，具有一定的營(yíng)養(yǎng)保健功能[2-4]?！侗静菥V目》中記載：枳椇味甘、性平、無(wú)毒，止渴除煩，去膈上熱，利大小便，功效同蜂蜜。據(jù)報(bào)道，拐棗提取物有解酒毒，具有促進(jìn)尿液排泄，健胃消食，提高免疫力等作用[5-6]。

膳食纖維（dietary fiber，DF）是一類特殊的碳水化合物，不能被人體消化道酶分解的多糖類的總稱，因其具有重要的生理功能，是人體不可缺少營(yíng)養(yǎng)素。根據(jù)其溶解性質(zhì)分為可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不可溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）[7-8]，可溶性膳食纖維在抗氧化、防治心血管疾病、糖尿病、肥胖等方面效果顯著[9-10]。拐棗中膳食纖維的提取工藝鮮為報(bào)道，本文以拐棗為試驗(yàn)材料，采用酶法提取拐棗中的SDF，并結(jié)合響應(yīng)面（responsesurface methodology，RSM）法對(duì)其工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，為提高拐棗的綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

拐棗采自貴州省銅仁市印江縣永安鄉(xiāng)，50℃烘干，粉碎成細(xì)粉，采用石油醚70℃浸泡1 h，連續(xù)回流2次，3 h/次，脫脂和去色素后過(guò)濾，濾渣60℃烘干，備用。

纖維素酶（活力值：15 000 U/g）：上海丹尼悅生物科技有限公司；95%乙醇（分析純）、氫氧化鈉、乙醇、鹽酸：成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

FW80型萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京科偉永興儀器有限公司；JJ-500精密電子天平：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì)：雷磁儀器廠；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海千載科技有限公司；DHG-9036A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TD5A臺(tái)式低速離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SDF提取工藝流程

脫脂樣品→蛋白酶→加壓滅酶→纖維素酶→滅酶→濃縮→醇提→離心過(guò)濾→干燥→成品SDF

1.3.2 操作要點(diǎn)

取10.00 g脫脂樣品，按1∶20（g/mL）料液比加水，在高壓滅菌鍋中進(jìn)行加壓預(yù)處理3.5 h，在60℃下恒溫水浴，在一定pH值的緩沖液中加纖維素酶進(jìn)行提取，過(guò)濾，重復(fù)一次；合并提取上清液并在3 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min，取上清液，加入4倍體積的無(wú)水乙醇對(duì)濾液進(jìn)行處理，靜置過(guò)夜，用已干燥至恒重的濾紙抽濾。將濾紙及沉淀物置于60℃干燥箱中干燥恒重為止，計(jì)算得率。SDF的測(cè)定方法[11]。公式為：

拐棗SDF得率/%=（濾紙及沉淀物置于60℃烘箱中干燥至恒重-干燥至恒重的定量濾紙）/1.00（g）×100

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)定溶液pH值為5.0、酶解時(shí)間70 min、酶用量0.6%，考察酶解溫度在 50、55、60、65、70、75 ℃對(duì) SDF得率的影響；設(shè)定溶液pH值為5.0、酶用量0.7%、酶解時(shí)間 60 min，考察酶解時(shí)間在 40、50、60、70、80、90 min對(duì)SDF得率的影響；每個(gè)單因素設(shè)3次重復(fù)試驗(yàn)。設(shè)定酶用量0.6%、酶解時(shí)間70 min、酶解溫度60℃，考察溶液 pH 值在 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 對(duì) SDF 得率的影響；設(shè)定溶液pH為5.0、酶解時(shí)間70 min、酶解溫度60℃，考察酶用量0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%對(duì)SDF得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，按Box-Behnken Design中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以酶解溫度、酶解時(shí)間、pH、酶用量為自變量，以拐棗中SDF得率為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法求取優(yōu)化的工藝參數(shù)[12]，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 The factors，levels and codes of Box-Behnken design

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Office Excel2007分析作圖。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-ExpertV8.0進(jìn)行分析處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析

2.1.1 酶解溫度對(duì)拐棗SDF得率的影響

酶解溫度對(duì)拐棗SDF得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 酶解溫度對(duì)拐棗SDF得率的影響Fig.1 Effects of enzymolysis temperature on the rate of Hovenia dulcis SDF

如圖1所示，酶解溫度50℃～60℃范圍內(nèi)SDF得率隨酶解溫度的上升而增大，在60℃達(dá)到最大，當(dāng)酶解溫度繼續(xù)升高，SDF得率卻逐漸下降，分析由于纖維素酶在一定溫度范圍內(nèi)，酶解溫度越高，活性越強(qiáng)，作用SDF分子越強(qiáng)，易于SDF的溶出，但溫度過(guò)高也會(huì)降低酶活性，甚至使酶失活。因此，最佳酶解溫度60℃為宜。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)拐棗SDF得率的影響

酶解時(shí)間對(duì)拐棗SDF得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)拐棗SDF得率的影響Fig.2 Effects of enzymolysis time on the rate of Hovenia dulcis SDF

由圖2可知，在40 min～60 min內(nèi)，拐棗SDF得率增加幅度較小，可能酶解時(shí)間過(guò)短，使提取SDF不徹底；當(dāng)酶解時(shí)間在60 min～70 min時(shí)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，拐棗中大部分SDF被纖維素酶酶解出來(lái)，使SDF得率顯著上升，在70 min時(shí)SDF得率達(dá)到最大，分析原因可能纖維素酶使細(xì)胞壁破裂致多糖類物質(zhì)大量溶出，增大拐棗SDF得率，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，使果膠發(fā)生酯解、裂解反應(yīng)，使SDF得率略有下降。因此，最佳酶解時(shí)間在70 min為宜。

2.1.3 pH值對(duì)拐棗SDF得率的影響

pH值對(duì)拐棗SDF得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 pH值對(duì)拐棗SDF得率的影響Fig.3 Effects of pH on the rate of Hovenia dulcis SDF

由圖3可知，pH值在3.5～4.5范圍內(nèi)，拐棗SDF得率緩慢上升；當(dāng)pH值在4.5～5.0范圍內(nèi)，拐棗SDF得率顯著上升，當(dāng)pH值為5.0時(shí)，拐棗SDF達(dá)到最大，分析可能是pH過(guò)小或過(guò)大時(shí)，影響了纖維素酶活性，因此最佳pH值控制在5.0為宜。

2.1.4 酶用量對(duì)拐棗SDF得率的影響

酶用量對(duì)拐棗SDF得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 酶用量對(duì)拐棗SDF得率的影響Fig.4 Effects of enzyme dosage on the rate of Hovenia dulcis SDF

由圖4可得，增加纖維素酶用量，拐棗SDF得率增大，當(dāng)酶用量增至0.6%時(shí)，拐棗中SDF得率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加酶用量，SDF得率不再增加，分析原因可能由于增加酶用量，使部分IDF降解，繼續(xù)用濃醇沉淀時(shí)不能沉淀，從而使SDF得率下降。因此選酶用量應(yīng)在0.6%為宜。

2.2 拐棗SDF提取工藝優(yōu)化

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立與檢驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，采用Design Expert 8.0.6中的Box-Behnken設(shè)計(jì)，SDF提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2，回歸方差分析見(jiàn)表3。擬合所得多元二次回歸方程如下：Y=14.24A-0.25B+0.59C+0.27D-0.25AB+0.045AC-0.045AD-0.14BC-0.46BD+0.055CD-3.21A2-2.76B2-3.28C2-2.88D2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The experimental design and results for response surface analysis

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 2 The experimental design and results for response surface analysis

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression equation

由表3數(shù)據(jù)顯示，模型P值＜0.000 1，說(shuō)明該模型達(dá)到極顯著水平，同時(shí)失擬項(xiàng)P值為0.8097，大于0.05，說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)值和實(shí)際值非常吻合，模型成立。相關(guān)系數(shù)R2=0.995 6，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有99.56%來(lái)源于所選變量[13]，該回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以用其確定最佳提取工藝條件。此外，各因素中一次項(xiàng)B、C、D及二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì) SDF 得率均表現(xiàn)出了差異顯著水平，AB、BD交互作用的影響差異顯著（p＜0.05），因此，各因素對(duì)SDF得率的影響大小順序?yàn)閜H＞酶用量＞酶解時(shí)間＞微波功率。

2.2.2 各交互項(xiàng)對(duì)SDF得率影響的分析

各交互項(xiàng)對(duì)SDF得率影響的分析見(jiàn)圖5。

由圖5各響應(yīng)面可以看出，隨著各因素的增大，響應(yīng)值逐漸增大；其中BD的響應(yīng)面曲線陡峭，對(duì)SDF得率影響顯著，AB的響應(yīng)面曲線僅次于BD、AC、BC、AD、CD響應(yīng)面曲線較平緩，SDF得率影響不顯著，與方差分析一致。

圖5 各兩因素交互作用的響應(yīng)面Fig.5 Response surface and contour plots for pairwise factors interaction

2.3 工藝優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析，得到影響拐棗SDF得率的理論最佳條件為：酶解溫度60.02℃，酶解時(shí)間69.47 min，pH值為5.05，酶用量0.61%，其拐棗SDF得率14.28%。為檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的可靠性，考慮試驗(yàn)操作的可行性，分別取各因素的整數(shù)值，酶解溫度60℃，酶解時(shí)間70 min，pH值為5.0，酶用量0.6%。在此最優(yōu)條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，拐棗SDF得率可達(dá)14.22%，與SDF的提取理論值比較，其相對(duì)誤差約為0.42%，且重復(fù)性也很好，因此該優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

本文采用響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取拐棗中SDF，結(jié)果表明：拐棗中SDF得率的最佳提取工藝條件為酶解溫度60℃，酶解時(shí)間70 min，pH為5.0，酶用量0.6%。拐棗中SDF得率可達(dá)14.22%，與SDF的提取理論值比較，其相對(duì)誤差約為0.42%，且重復(fù)性也很好，說(shuō)明響應(yīng)面法建立的數(shù)學(xué)模型對(duì)拐棗中SDF提取具有穩(wěn)定可靠性。

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Optimization Extraction of Dietary Fiber from Hovenia dulcis by Enzymolysis and Response Surface Methodology

LU Zhong-ying，WANG Yun-yang，LU Dao-wang，CHEN Shi-xue*，YAO Yuan-yong
（Institute of Material and Chemical Engineering，Tongren University，Tongren 554300，Guizhou，China）

The soluble dietary fiber were extracted from Hovenia dulcis with the enzymolysis and response surface methodology.Based on the single factor experiments，Box-Behnkencentral composite design principles were used to select enzyme temperature，pH，enzyme time and dosage as four parameters of response surface design to optimize extraction process.The results showed that the optimum extraction conditions of the extraction rate of Hovenia dulcis SDF enzyme temperature 60 ℃ ，pH 5.0，enzyme time 70 min and enzyme dosage 0.6%.The extraction rate of soluble dietary fiber reached 14.22%，compared with the theoretical value，the relative error was about 0.42%，and the repeatability was also very good，that was to say using the model of response surface extracting the Hovenia dulcis SDF was stability and reliability.

Hovenia dulcis；soluble dietary fiber；extraction technology；response surface

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.006

梵凈山特色苗藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)產(chǎn)學(xué)研基地（黔教合KY字[2014]233）；教育廳省級(jí)重點(diǎn)支持學(xué)科（黔學(xué)位合字ZDxk[2015]34號(hào)）

盧忠英（1987—），女（苗），講師，碩士，研究方向：天然藥物化學(xué)成分與新藥研發(fā)。

*通信作者：陳仕學(xué)（1979—），教授，碩士，研究方向：天然藥物化學(xué)成分與新藥研發(fā)。

2017-01-16