超濾濃縮腦脊液ESAT-6對(duì)結(jié)核性腦膜炎的診斷價(jià)值

黃 剛，胡 凡，柴 文，文 安，劉詩(shī)英，吳曉牧

(江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南昌 330006)

超濾濃縮腦脊液ESAT-6對(duì)結(jié)核性腦膜炎的診斷價(jià)值

黃 剛，胡 凡，柴 文，文 安，劉詩(shī)英，吳曉牧

(江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南昌 330006)

目的探討離心超濾技術(shù)濃縮腦脊液檢查結(jié)核桿菌早期分泌性抗原靶蛋白6(ESAT-6)在診斷結(jié)核性腦膜炎(TBM)中的價(jià)值。方法選取TBM患者40例(TBM組)和非TBM患者20例(非TBM組)，每位患者留取2份腦脊液(一份為原液，另一份為離心超濾濃縮)，使用ELlSA法檢測(cè)其ESAT-6水平。結(jié)果TBM組中濃縮ESAT-6的敏感性高于原液(P<0.05)，而非TBM組中濃縮ESAT-6的敏感性與原液比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論利用離心超濾濃縮技術(shù)能提高腦脊液ESAT-6檢查的敏感性，且操作簡(jiǎn)單，可作為快速診斷TBM的參照指標(biāo)。

結(jié)核性腦膜炎； 早期分泌性抗原靶蛋白-6； 超濾濃縮;免疫組織化學(xué)； 腦脊液;診斷

結(jié)核性腦膜炎(TBM)是由結(jié)核分枝桿菌感染所致的高致殘率及高致死率的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，在肺外結(jié)核所占的比例逐年增加。因其臨床、癥狀體征無(wú)特異性，且腦脊液方面的檢查特異性及敏感性亦較低，使得TBM早期診斷極易被誤診及漏診。而腦脊液中的早期分泌性靶抗原-6(ESAT-6)檢查被用于診斷TBM，其無(wú)濃縮的腦脊液ESAT-6檢查特異性較高約為96.49%，而陽(yáng)性率較低約為67.35%[1]，限制了其在臨床的應(yīng)用。因此，本研究利用離心超濾濃縮腦脊液技術(shù)提高ESAT-6檢出的敏感性，以期達(dá)到快速診斷TBM的目的。

1 資料與方法

1.1病例資料

研究對(duì)象來(lái)自于2014—2016年江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院患者，其中TBM患者40例(TBM組)：依據(jù)Marais等[2]的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診，均為初次確診未進(jìn)行抗結(jié)核治療，男20例，女20例，年齡14～72歲；非TBM患者20例(非TBM組)：男7例，女13例，年齡18～80歲，真菌性腦炎并肺結(jié)核1例，多發(fā)性硬化并肺結(jié)核1例，自身免疫性腦炎3例，單純皰疹病毒性腦炎8例，帶狀皰疹病毒性腦炎7例。

1.2方法

檢測(cè)方法：患者均在發(fā)病2周內(nèi)行腰穿檢查留取2份腦脊液，每份為3 mL。其中一份腦脊液通過(guò)超濾離心管，2500 r·min-1，30 min，濃縮為100 μL。均于-80 ℃保存，采用ELISA方法檢測(cè)2份腦脊液中的ESAT-6水平，取9個(gè)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品(200、150、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 ng·mL)及TBM組(原液和濃縮液)、非TBM組(原液和濃縮液),各100 μL，加入反應(yīng)孔,置4 ℃冰箱過(guò)夜。沖洗2次，牛血清37 ℃封閉1 h；沖洗5次，加入二抗37 ℃孵育2 h；沖洗5次，加入辣根過(guò)氧化物酶20 min顯色，然后加入100 μL終止反應(yīng)的液體。按試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品為定性值，顏色較深為陽(yáng)性，顏色較淡為陰性。敏感性=陽(yáng)性數(shù)/總樣本量×100%。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS16.0)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，2組比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2組原液和濃縮液ESAT-6檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。TBM組中濃縮ESAT-6的敏感性高于原液(P<0.05)，而非TBM組中濃縮ESAT-6的敏感性與原液比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。非TBM組2例陽(yáng)性分別為真菌性腦炎合并肺結(jié)核、多發(fā)性硬化合并肺結(jié)核患者。

表1 2組腦脊液ESAT-6表達(dá)情況

*P<0.05，#P>0.05與同組原液比較。

3 討論

TBM是一種比較嚴(yán)重的肺外結(jié)核，占肺外結(jié)核的7%～10%[3]。其近年來(lái)發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)，死亡率約為30%，致殘率約為25%[4]，診斷治療的延誤是死亡率和致殘率高的主要原因。但是現(xiàn)有的檢查手段對(duì)該病的早期診斷、早期治療仍然十分困難。目前臨床上涉及TBM診斷的檢查有腦脊液生化常規(guī)及細(xì)胞學(xué)、影像學(xué)檢查、病原學(xué)檢查、免疫學(xué)檢查等。這些檢查中：1)腦脊液生化常規(guī)及細(xì)胞學(xué)在TBM方面有特征性表現(xiàn)(如細(xì)胞學(xué)呈混合細(xì)胞反應(yīng))，但是TBM的腦脊液非常不典型，因此該檢查只能作為參考。2)頭CT或MRI在TBM診斷沒(méi)有特征性表現(xiàn)故只能作為輔助。3)病原學(xué)檢查是目前確診TBM的方法，腦脊液抗酸染色的方法檢出率較低，結(jié)核桿菌培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，通常要4～6周，陽(yáng)性檢出率只有20%～30%[5]，不利于TBM早期診斷。4)免疫學(xué)檢查方法有兩種，第一種為干擾素-γ釋放試驗(yàn)，但它不能分辨結(jié)核感染是活動(dòng)期還是既往感染，故不能作為單獨(dú)診斷結(jié)核病的方法；第二種是腦脊液中的早期ESAT-6檢查目前處于實(shí)驗(yàn)室研究，其特異性均在90%以上[1，6-7]。因此，檢測(cè)TBM患者腦脊液中的ESAT-6很有可能成為早期快速精準(zhǔn)診斷TBM的方法。

ESAT-6主要是結(jié)核桿菌早期分泌的抗原，具有較好的免疫原性，因此其特異性也較高，但是腦脊液原液檢查ESAT-6不穩(wěn)定，其敏感性在67.35%～88%[1，6-7]之間，使得其臨床應(yīng)用前景并不樂(lè)觀。造成ESAT-6不穩(wěn)定的原因可能為：與患者顱內(nèi)結(jié)核桿菌感染的嚴(yán)重程度有一定的相關(guān)性，感染重的患者顱內(nèi)結(jié)核桿菌數(shù)量較多，其分泌的ESAT-6抗原的量較大，濃度高，容易檢測(cè)到；而感染較輕的患者結(jié)核桿菌數(shù)量少，其腦脊液的ESAT-6抗原量少濃度低，檢測(cè)時(shí)容易出現(xiàn)陰性的結(jié)果。故本研究利用離心超濾的技術(shù)解決腦脊液原液中ESAT-6抗原濃度較低的缺點(diǎn)，濃縮TBM患者的腦脊液，提高腦脊液中ESAT-6抗原的濃度。

本研究中，TBM組選取首次確診為TBM的患者(未使用抗結(jié)核治療)40例，留取2份腦脊液(一份為原液，另一份為離心超濾濃縮)，原液檢測(cè)ESAT-6抗原發(fā)現(xiàn)有32例為陽(yáng)性，8例為陰性，敏感性為80%，8例陰性患者病情都較輕；通過(guò)離心超濾濃縮腦脊液檢測(cè)ESAT-6抗原，其敏感性為100%，TBM組中濃縮ESAT-6的敏感性高于原液(P<0.05)。提示通過(guò)離心超濾技術(shù)能夠改善輕癥患者的假陰性的結(jié)果。另外，非TBM組中出現(xiàn)了2例腦脊液原液檢測(cè)為陰性，但是濃縮后腦脊液檢測(cè)為陽(yáng)性,1例為多發(fā)性硬化合并肺結(jié)核的患者，另一例為真菌性腦膜炎合并肺結(jié)核患者，進(jìn)一步檢測(cè)這2例患者血中的ESAT-6抗原亦為陽(yáng)性，出現(xiàn)這種情況的原因筆者考慮：1)這2例患者患有肺結(jié)核，肺部的結(jié)核桿菌會(huì)產(chǎn)生ESAT-6抗原并釋放進(jìn)入血液。2)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病破壞了患者的血腦屏障，導(dǎo)致血液中的ESAT-6抗原部分進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，腦脊液中的ESAT-6抗原濃度較低，導(dǎo)致了原液檢測(cè)為陰性，濃縮后檢測(cè)為陽(yáng)性。臨床對(duì)于這類患者可通過(guò)腦脊液生化、常規(guī)、細(xì)胞學(xué)、抗酸染色及影像學(xué)等進(jìn)行鑒別診斷。

總之，利用離心超濾濃縮技術(shù)能顯著提高腦脊液ESAT-6檢查的敏感性，可以作為TBM快速診斷的方法之一。由于ELISA是通過(guò)定性的方法進(jìn)行判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有其局限性，但是這種方法操作簡(jiǎn)單，容易判定結(jié)果，無(wú)需特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，適合在基層醫(yī)院使用。

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(責(zé)任編輯：羅芳)

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10.13764/j.cnki.lcsy.2017.08.010