環(huán)二鳥苷單磷酸核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)與功能

李新風(fēng)，陳芳，肖金鳳，何進(jìn)

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070

·生物技術(shù)與新方法·

環(huán)二鳥苷單磷酸核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)與功能

李新風(fēng)，陳芳，肖金鳳，何進(jìn)

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070

環(huán)二鳥苷單磷酸(c-di-GMP)是細(xì)菌中廣泛存在的一類核苷類第二信使分子，能夠調(diào)控細(xì)菌的生物被膜形成、運(yùn)動(dòng)性、黏附、毒力以及胞外多糖的產(chǎn)生等眾多生理活動(dòng)。核糖開關(guān)是 mRNA5′-非翻譯區(qū)(5′-Untranslational region,5′-UTR)的一段 RNA 序列，包含可以識(shí)別并結(jié)合配體的保守序列——適配體區(qū)(Aptamer domain, AD)，以及結(jié)構(gòu)多變、可以調(diào)控下游編碼基因的表達(dá)平臺(tái)區(qū)(Expression platform, EP)。當(dāng)代謝物分子濃度比較高時(shí)，其與適配體區(qū)結(jié)合，引起下游的表達(dá)平臺(tái)區(qū)發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)下游基因的調(diào)節(jié)。目前已發(fā)現(xiàn)c-di-GMP-Ⅰ和c-di-GMP-Ⅱ兩類c-di-GMP的核糖開關(guān)。它們通過(guò)特異性地結(jié)合c-di-GMP，調(diào)控種類繁多的下游基因的表達(dá)。c-di-GMP-I核糖開關(guān)分布廣泛，尤其在厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)的細(xì)菌中最為豐富。c-di-GMP-Ⅱ核糖開關(guān)具備變構(gòu)核酶的功能，結(jié)合c-di-GMP后在其非典型剪切位點(diǎn)處發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)。文中圍繞c-di-GMP核糖開關(guān)的發(fā)現(xiàn)、功能、分類以及下游調(diào)控基因的功能進(jìn)行綜述與分析。

核苷類第二信使分子，環(huán)二鳥苷單磷酸，核糖開關(guān)，基因調(diào)控

環(huán)二鳥苷單磷酸(Cyclic diguanosine monophosphate，c-di-GMP)是細(xì)菌體內(nèi)普遍存在的一類核苷類第二信使，在細(xì)菌的代謝調(diào)控中處于中心調(diào)節(jié)的地位，廣泛參與調(diào)控細(xì)菌的生長(zhǎng)和分化、群體感應(yīng)、生物被膜的形成和分泌、運(yùn)動(dòng)性、毒力等生理功能[1]。最近在產(chǎn)酶溶桿菌Lysobacter enzymogenes中發(fā)現(xiàn)c-di-GMP可以同時(shí)調(diào)節(jié)Ⅳ型菌毛以及抗真菌抗生素的生物合成[2]。c-di-GMP最早發(fā)現(xiàn)于1987年，是Benziman及其同事分析木駒形桿菌Komagataeibacter xylinus(當(dāng)時(shí)稱木醋酸桿菌Acetobacter xylinus)纖維素的產(chǎn)生機(jī)制時(shí)意外發(fā)現(xiàn)的[1,3]，c-di-GMP作為一種變構(gòu)激活劑能顯著提高纖維素合成酶的活性，自此開拓了c-di-GMP生理功能研究的新領(lǐng)域。目前對(duì)c-di-GMP的代謝和功能都有了較清楚的認(rèn)識(shí)，它由含有 GGDEF結(jié)構(gòu)域的二鳥苷酸環(huán)化酶(Diguanylate cyclases, DGC)合成[4]；通過(guò)含有EAL[5]或HD-GYP[6]結(jié)構(gòu)域的磷酸二酯酶(Phosphodiesterase, PDE)降解。c-di-GMP可以與下游受體或靶標(biāo)結(jié)合進(jìn)而行使其生物學(xué)功能，其下游受體/靶標(biāo)多種多樣，包括：含有PilZ結(jié)構(gòu)域的蛋白[7-8]、含有退化的GGDEF或EAL結(jié)構(gòu)域的蛋白[9]、轉(zhuǎn)錄因子[10-11]、含有 MshEN結(jié)構(gòu)域的蛋白[12]、核糖開關(guān)[13-14]以及一些其他蛋白(如 PNPase、YajQ、LCN2)[15-17]。其中，核糖開關(guān)是一種特殊的RNA類受體。

核糖開關(guān)一般位于 mRNA的5′-非翻譯區(qū)(5′-Untranslational region,5′-UTR)，由適配體區(qū)(Aptamer domain)和表達(dá)平臺(tái)區(qū)(Expression platform)兩部分組成。適配體區(qū)較為保守，可以特異性地結(jié)合某種小分子代謝物，感知并響應(yīng)其濃度變化；表達(dá)平臺(tái)區(qū)位于適配體區(qū)的下游，通常與適配體區(qū)有一定程度的重疊，序列多變。當(dāng)適配體區(qū)結(jié)合代謝物后使下游的表達(dá)平臺(tái)區(qū)發(fā)生構(gòu)象變化，“開啟”或“關(guān)閉”下游基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)下游基因的調(diào)節(jié)。核糖開關(guān)對(duì)下游基因的表達(dá)調(diào)控可以在轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)形成終止子(Terminator)或抗終止子(Anti-terminator)實(shí)現(xiàn)；也可以在翻譯水平通過(guò)掩蓋SD序列形成隔離子(Sequestor)或通過(guò)釋放 SD序列形成抗隔離子(Anti-sequestor)實(shí)現(xiàn)。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20多種核糖開關(guān)，它們響應(yīng)的代謝物即配體分子種類繁多，包括核苷酸代謝物、氨基酸、單糖衍生物、金屬離子等，其中核苷類代謝物最為豐富，它們包括輔酶、維生素、第二信使分子等[18-19]。第二信使分子c-di-GMP核糖開關(guān)最初由耶魯大學(xué)Breaker團(tuán)隊(duì)于2008年發(fā)現(xiàn)[13]，2010年 Breaker團(tuán)隊(duì)又發(fā)現(xiàn)一種不同類別的c-di-GMP核糖開關(guān)[14]，根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)和作用方式的不同分別將其命名為Ⅰ類(ClassⅠ)c-di-GMP核糖開關(guān)(c-di-GMP-Ⅰ)和Ⅱ類(Class Ⅱ)c-di-GMP核糖開關(guān)(c-di-GMP-Ⅱ)。c-di-GMP核糖開關(guān)的發(fā)現(xiàn)不僅拓寬了核糖開關(guān)感知的范圍，也豐富了c-di-GMP的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本文圍繞c-di-GMP核糖開關(guān)的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)以及下游調(diào)控基因的功能進(jìn)行綜述與分析。

1 c-di-GMP核糖開關(guān)的發(fā)現(xiàn)

c-di-GMP核糖開關(guān)最早發(fā)現(xiàn)于2008年，早在2006年時(shí)，Jenal和Malon就推測(cè)可能存在RNA分子識(shí)別并結(jié)合c-di-GMP[20]。2007年，Breaker團(tuán)隊(duì)通過(guò)比較基因組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)了一類保守的RNA序列，這類序列通常存在于環(huán)境、膜組裝和細(xì)菌運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的5′-UTR中，并將其命名為GEMM(Genes for the environment, membranes and motility)，并將其視為一種潛在的核糖開關(guān)[21]。GEMM廣泛分布于細(xì)菌中，尤其是在變形菌門和厚壁菌門中。2008年，Breaker團(tuán)隊(duì)在體外證明了來(lái)自霍亂弧菌Vibrio cholerae的GEMM RNA序列能夠與c-di-GMP特異性結(jié)合，解離常數(shù)KD≈1 nmol/L[13]。至此，他們正式提出這類GEMM RNA序列是一類能夠特異性結(jié)合c-di-GMP的核糖開關(guān)。GEMM在結(jié)構(gòu)上一般由3個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)(P1、P2和P3)組成(圖1A)，P1序列比較保守，起到穩(wěn)定構(gòu)象的作用；P2的序列也比較保守，其末端通常是由 GNRA組成的四元環(huán)(Tetraloop)；P3發(fā)夾結(jié)構(gòu)則根據(jù)其是否含有四元環(huán)的受體分成兩種類型。Ⅰ型(TypeⅠ)GEMM P2上的四元環(huán)通常為GRRA，第二位堿基為R(嘌呤)，P3上含有相應(yīng)的四元環(huán)受體。Ⅱ型(TypeⅡ)GEMM P2上的四元環(huán)通常為GYRA，第二位堿基為Y(嘧啶)，P3上沒有對(duì)應(yīng)的四元環(huán)受體[21]。

此后，人們又通過(guò)比較基因組學(xué)的方法預(yù)測(cè)出大量的保守 RNA元件，其中有一類 RNA元件的下游基因廣泛參與c-di-GMP的代謝及信號(hào)通路，但這類 RNA元件與之前報(bào)道的c-di-GMP核糖開關(guān)大不相同(圖1A)[4,22]。2010年，Breaker團(tuán)隊(duì)證明了此類 RNA元件能夠與c-di-GMP特異結(jié)合，艱難梭菌Clostridium difficile中的該類RNA元件84 Cd與c-di-GMP解離常數(shù)KD≈200 pmol/L[14]。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明84 Cd的表達(dá)平臺(tái)區(qū)是1種Ⅰ型核酶，兩者組成1個(gè)變構(gòu)核酶，c-di-GMP與變構(gòu)核酶非典型剪切位點(diǎn)處結(jié)合，通過(guò)調(diào)節(jié)其自剪切能力來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)下游基因的調(diào)控。為了區(qū)別之前發(fā)現(xiàn)的c-di-GMP-Ⅰ核糖開關(guān)，將該類變構(gòu)核酶命名為c-di-GMP-Ⅱ核糖開關(guān)。至此，兩類調(diào)節(jié)機(jī)制完全不同的c-di-GMP核糖開關(guān)被發(fā)現(xiàn)，其保守序列如圖1所示。c-di-GMP核糖開關(guān)的發(fā)現(xiàn)使人們認(rèn)識(shí)到c-di-GMP不僅作用于蛋白類受體，還可以通過(guò)RNA類受體調(diào)節(jié)細(xì)菌的生理功能，不僅豐富了c-di-GMP受體的種類，也為揭示c-di-GMP的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新的線索。

圖1 Ⅰ類與Ⅱ類c-di-GMP核糖開關(guān)適配體區(qū)的保守序列[14]Fig.1 The aptamer domain consensus of classⅠ and class Ⅱc-di-GMP riboswitches[14].

2 c-di-GMP核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)和功能

2.1 c-di-GMP-Ⅰ核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)與功能

c-di-GMP-Ⅰ核糖開關(guān)自2008年發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直受到廣泛關(guān)注，2009年Smith等對(duì)來(lái)自霍亂弧菌的核糖開關(guān) Vc2進(jìn)行了晶體結(jié)構(gòu)解析，獲得了2.7 ?分辨率的晶體結(jié)構(gòu)(圖2)[23]。晶體結(jié)構(gòu)清晰地展示了核糖開關(guān)Vc2的兩個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)P2和P3之間的相互聯(lián)系以及c-di-GMP與Vc2之間的相互作用。P2和P3分別形成螺旋結(jié)構(gòu)，其中，P2頸上第44位的C與P3頸上第83位的G形成堿基互補(bǔ)配對(duì)，四聚環(huán)與其受體通過(guò)氫鍵相互連接使兩個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)緊密靠近，起到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用。雖然c-di-GMP分子結(jié)構(gòu)自身對(duì)稱，但它以非對(duì)稱的方式結(jié)合于Vc2的三螺旋交界處。c-di-GMP中的一個(gè)G(Gα)通過(guò)Hoogsteen配對(duì)方式與Vc2上第20位的G相互作用，除此之外Gα與第46位的C以及48位的A也存在相互作用；而另一個(gè)G(Gβ)與Vc2上92位的C形成典型的Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對(duì)，同時(shí)Gβ的7位N與Vc2第47位A的2′-OH也會(huì)通過(guò)氫鍵相互作用。

近年來(lái)除了結(jié)構(gòu)外，對(duì)c-di-GMP-Ⅰ核糖開關(guān)功能的研究也有報(bào)道。研究結(jié)果表明c-di-GMP結(jié)合核糖開關(guān)后對(duì)下游基因的調(diào)節(jié)既有“開啟”作用也有“關(guān)閉”作用，這種調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，通過(guò)形成終止子/抗終止子來(lái)實(shí)現(xiàn)。2008年Breaker團(tuán)隊(duì)報(bào)道，霍亂弧菌N16961中的Vc2以及蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereusATCC10987中的Bc1核糖開關(guān)在高濃度c-di-GMP時(shí)呈現(xiàn)“開啟”狀態(tài)，促進(jìn)下游基因表達(dá)；蠟樣芽胞桿菌ATCC14579中的Bc2以及艱難梭菌ATCC9689中的Cd1核糖開關(guān)在高濃度c-di-GMP時(shí)呈現(xiàn)“關(guān)閉”狀態(tài)，抑制下游基因表達(dá)[13]。在此之后更多的c-di-GMP-Ⅰ核糖開關(guān)調(diào)控機(jī)制被報(bào)道，艱難梭菌630中的Cdi1_1[24]、霍亂弧菌C6706中的Vc1[25]以及蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensisCT-43中3個(gè)串聯(lián)排布的c-di-GMP-Ⅰ核糖開關(guān) Bc3、Bc4、Bc5[26]在高濃度c-di-GMP時(shí)呈現(xiàn)“開啟”狀態(tài)，在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)下游基因表達(dá)；艱難梭菌630中的Cdi1_2、Cdi1_3、Cdi1_4、Cdi1_5、Cdi1_6、Cdi1_7、Cdi1_8、Cdi1_9、Cdi1_10、Cdi1_11、Cdi1_12 呈現(xiàn)“關(guān)閉”狀態(tài)，在轉(zhuǎn)錄水平抑制下游基因表達(dá)[24]。

圖2 c-di-GMP-Ⅰ核糖開關(guān)Vc2適配體區(qū)結(jié)構(gòu)[23]Fig.2 Structure of thec-di-GMP-Ⅰ riboswitch Vc2 aptamer domain[23].

2.2 c-di-GMP-Ⅱ核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)與功能

c-di-GMP-Ⅱ核糖開關(guān)是一種變構(gòu)核酶，自2010年發(fā)現(xiàn)以來(lái)對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的研究也比較清楚。2011年，Smith等對(duì)來(lái)自丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum的c-di-GMP-Ⅱ核糖開關(guān)進(jìn)行了晶體結(jié)構(gòu)解析，獲得了2.5 ?分辨率的晶體結(jié)構(gòu)(圖3)[27]。晶體結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示c-di-GMP-Ⅱ核糖開關(guān)存在4個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)P1、P2、P3和P4，它們以螺旋的形式存在。其中，第34位的堿基 A與45位的U非典型配對(duì)(A34/U45)，第31位的U與46位的G配對(duì)(U31/G46)，A34/U45與U31/G46堿基四聚化有利于P3和P4交界處“急轉(zhuǎn)彎”結(jié)構(gòu)的形成。c-di-GMP結(jié)合c-di-GMP-Ⅱ核糖開關(guān)也是非對(duì)稱的，與識(shí)別c-di-GMP-Ⅰ核糖開關(guān)不同的是這里沒有典型的堿基互補(bǔ)配對(duì)，主要通過(guò)堿基堆積作用力以及非典型配對(duì)方式結(jié)合于P1、P2和P4的交界處。第70位的A夾在c-di-GMP的2個(gè)鳥嘌呤(Gα和Gβ)中間，除此之外，Gα還與61位的A和69位的A相互作用，Gβ與13位的A和73位的G相互作用。c-di-GMP-Ⅱ核糖開關(guān)的調(diào)控過(guò)程比較復(fù)雜，整個(gè)過(guò)程除了c-di-GMP外還需要 GTP的參與，GTP負(fù)責(zé)攻擊Ⅰ型核酶，實(shí)現(xiàn)剪接。與c-di-GMP-Ⅰ核糖開關(guān)不同，c-di-GMP-Ⅱ核糖開關(guān)不是通過(guò)形成終止子/抗終止在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控下游基因表達(dá)量，而是通過(guò)改變Ⅰ型核酶的剪接位點(diǎn)，進(jìn)而通過(guò)形成或者刪除RBS在翻譯水平對(duì)其進(jìn)行調(diào)控[28]。艱難梭菌中的84 Cd是非常典型的c-di-GMP-Ⅱ核糖開關(guān)，當(dāng) GTP和c-di-GMP充足時(shí)，c-di-GMP結(jié)合到84 Cd，改變下游核酶的剪接位點(diǎn)，最終形成的剪接體含有完整RBS(AGGAGG)，促進(jìn)下游基因翻譯；當(dāng)缺乏c-di-GMP時(shí)，GTP攻擊位點(diǎn)在起始密碼子上游4個(gè)核苷酸處，最終無(wú)法形成完整RBS，抑制下游基因翻譯。艱難梭菌630中存在4個(gè)c-di-GMP-Ⅱ核糖開關(guān)Cdi2_1、Cdi2_2、Cdi2_3以及Cdi2_4，當(dāng)c-di-GMP充足時(shí)它們均呈現(xiàn)“開啟”狀態(tài)，促進(jìn)下游基因表達(dá)，但這種促進(jìn)體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平(qRT-PCR結(jié)果)[24]，這可能是由于結(jié)合c-di-GMP后改變了它們的構(gòu)象，最終影響了轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性。

圖3 c-di-GMP-Ⅱ核糖開關(guān)適配體區(qū)結(jié)構(gòu)[27]Fig.3 Structure of thec-di-GMP-Ⅱ riboswitch aptamer domain[27].

3 c-di-GMP核糖開關(guān)下游調(diào)控基因的功能分析

c-di-GMP具有廣泛的調(diào)控作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)菌生長(zhǎng)和分化、群體感應(yīng)、生物被膜的形成、運(yùn)動(dòng)性以及毒力等重要生理生化功能，這些功能的行使需要借助其下游受體，通過(guò)核糖開關(guān)調(diào)控下游基因是最直接的受體介導(dǎo)的調(diào)控方式。c-di-GMP核糖開關(guān)下游調(diào)控基因種類繁多，在艱難梭菌中c-di-GMP-Ⅰ核糖開關(guān)Cd1位于flgB操縱子(編碼早期鞭毛蛋白)上游，2012年P(guān)urcell等研究表明，提高胞內(nèi)c-di-GMP濃度下調(diào)flgB操縱子的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力降低[29]。有趣的是sigD基因位于flgB操縱子中，即c-di-GMP可以調(diào)控sigD的表達(dá)，進(jìn)一步研究表明sigD調(diào)控103個(gè)基因的表達(dá)，包括鞭毛相關(guān)基因、趨化蛋白、膠原黏附蛋白以及一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這意味著c-di-GMP可以間接調(diào)控這些基因及相關(guān)過(guò)程[30-31]。c-di-GMP-Ⅱ核糖開關(guān)Cdi2_4位于Ⅳ型菌毛編碼相關(guān)基因的上游，Ⅳ型菌毛參與調(diào)節(jié)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性、黏附、生物被膜的形成以及菌體的聚集、沉降等行為。Bordeleau等研究表明c-di-GMP上調(diào)Ⅳ型菌毛編碼基因的轉(zhuǎn)錄[32]，這為c-di-GMP參與調(diào)控相關(guān)表型提供了可能。在蘇云金芽胞桿菌中，Bc2位于膠原黏附蛋白(Collagen adhesion protein)編碼基因cap的上游，2016年Tang等研究表明：當(dāng)c-di-GMP濃度較高時(shí)，Bc2處于“開啟”狀態(tài)，激活下游cap基因的表達(dá)，最終影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性、聚集、胞外多糖分泌、生物被膜形成以及毒力等多種重要表型[33]。噬菌蛭弧菌Bdellovibrio bacteriovorus中存在1個(gè)表達(dá)量特別高的c-di-GMP-Ⅰ核糖開關(guān)merRNA，由于c-di-GMP核糖開關(guān)與c-di-GMP有非常高的特異性及結(jié)合能力，作者認(rèn)為merRNA可能通過(guò)海綿效應(yīng)吸附游離的c-di-GMP，進(jìn)而調(diào)控噬菌蛭弧菌在自由生長(zhǎng)狀態(tài)和在宿主細(xì)菌中寄生狀態(tài)的轉(zhuǎn)換[34]。除此之外，其他的一些研究表明c-di-GMP核糖開關(guān)還參與調(diào)控細(xì)菌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分泌、膜蛋白以及肽的合成等過(guò)程[21,24]。

圖4 c-di-GMP核糖開關(guān)下游調(diào)控基因COG注釋Fig.4 COG annotation ofc-di-GMP riboswitches downstream genes.

我們對(duì)3079株已完成全基因組測(cè)序的細(xì)菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)存在989個(gè)c-di-GMP-Ⅰ核糖開關(guān)和167個(gè)c-di-GMP-Ⅱ核糖開關(guān)。通過(guò)生物信息學(xué)分析得到核糖開關(guān)下游相關(guān)基因序列，并對(duì)這些序列進(jìn)行COG(Cluster of orthologous groups of proteins, 蛋白質(zhì)直系同源簇)注釋，如圖4所示，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[T]以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[N]兩條通路被明顯富集。富集結(jié)果中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制主要包括二鳥苷酸環(huán)化酶、磷酸二酯酶以及細(xì)菌趨化性等相關(guān)系統(tǒng)；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)主要包括細(xì)菌趨化性以及鞭毛合成、組裝等相關(guān)系統(tǒng)。這說(shuō)明c-di-GMP直接通過(guò)核糖開關(guān)調(diào)控細(xì)菌間的信息交流、運(yùn)動(dòng)以及趨化等相關(guān)過(guò)程，并且近些年研究表明運(yùn)動(dòng)性和趨化性等相關(guān)過(guò)程會(huì)影響細(xì)菌的胞外基質(zhì)、生物被膜、致病性以及毒力等。除此之外，轉(zhuǎn)錄[K]、細(xì)胞壁細(xì)胞膜生物發(fā)生[M]以及糖轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝[G]通路相關(guān)基因也被明顯富集，進(jìn)一步豐富了c-di-GMP調(diào)控的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。

4 c-di-GMP通過(guò)RNA類和蛋白類受體調(diào)控的基因功能比較

與調(diào)控其RNA類受體——核糖開關(guān)相比，c-di-GMP通過(guò)其蛋白類受體介導(dǎo)的調(diào)控方式更為復(fù)雜：如通過(guò)結(jié)合后改變其蛋白類受體的構(gòu)象，直接調(diào)節(jié)其酶活力[35]；與蛋白類受體結(jié)合后再與其他蛋白相互作用影響細(xì)菌的生理功能[36]；影響轉(zhuǎn)錄因子類受體對(duì)目的基因啟動(dòng)子的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)其調(diào)節(jié)功能[10-11]。

c-di-GMP通過(guò) RNA類與蛋白類受體調(diào)控下游基因的生理功能有許多相似之處，涉及細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性、胞外多糖、生物被膜、毒性等生理表型。c-di-GMP通過(guò)核糖開關(guān)調(diào)控下游基因引起的相關(guān)表型在上文已有詳細(xì)介紹(圖4)，我們?cè)诖酥攸c(diǎn)討論其蛋白受體介導(dǎo)的相關(guān)表型。目前，已經(jīng)報(bào)道了多種由c-di-GMP蛋白類受體介導(dǎo)的細(xì)菌鞭毛運(yùn)動(dòng)調(diào)控方式。PilZ結(jié)構(gòu)域是最早發(fā)現(xiàn)可以與c-di-GMP結(jié)合的蛋白結(jié)構(gòu)域，伯氏疏螺旋體Borrelia burgdorferi中的PlzA蛋白是1個(gè)含有PilZ 結(jié)構(gòu)域的c-di-GMP受體蛋白，通過(guò)其PilZ結(jié)構(gòu)域與c-di-GMP相互作用，PlzA/c-di-GMP復(fù)合物能夠結(jié)合CheY的磷酸化酶 CheX，激活 CheX，從而降低 CheY的磷酸化水平，促進(jìn)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)[36]。在大腸桿菌Escherichia coli和沙門氏菌Salmonella中，受體蛋白YcgR結(jié)合c-di-GMP后與FliG-FliM-FliN復(fù)合物緊密結(jié)合，調(diào)節(jié)鞭毛旋轉(zhuǎn)的方向[37]。新月柄桿菌Caulobacter crescentus中，結(jié)合c-di-GMP后促進(jìn)受體蛋白DgrA與FliL的結(jié)合，抑制鞭毛運(yùn)動(dòng)[38]。此外，巴西固氮螺菌Azospirillum brasilense的甲基趨化蛋白Tlp1[39]、地毯草黃單胞菌Xanthomonas axonopodis轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Clp[40]、霍亂弧菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 VspT[41]等蛋白類受體結(jié)合c-di-GMP后通過(guò)不同的方式調(diào)節(jié)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)。除了影響運(yùn)動(dòng)性外，c-di-GMP蛋白類受體介導(dǎo)的胞外多糖、生物被膜、毒性等生理表型的調(diào)控也有很多報(bào)道。銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosaFleQ蛋白是第一個(gè)被鑒定的可以作為信號(hào)受體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在結(jié)合c-di-GMP后，F(xiàn)leQ無(wú)法結(jié)合胞外多糖合成相關(guān)基因pel的啟動(dòng)子，解除對(duì)相關(guān)基因的抑制，促進(jìn)胞外多糖和生物被膜的形成[10]。野油菜黃單胞菌Xanthomonas campestris中，YajQ受體蛋白突變后降低菌體生物被膜的形成以及對(duì)植物的侵染能力。并且YajQ在銅綠假單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas maltophilia中的同源蛋白也調(diào)節(jié)細(xì)菌的毒性[16]。水稻黃單胞菌Xanthomonas oryzae敲除c-di-GMP合成酶后影響其生物被膜、運(yùn)動(dòng)性、胞外多糖以及毒性[42]，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Clpxoo蛋白與cAMP受體蛋白CRP同源，參與調(diào)控類似生理功能[43-44]。MshEN結(jié)構(gòu)域蛋白是最近報(bào)道的一類c-di-GMP受體蛋白，與c-di-GMP有極強(qiáng)的結(jié)合能力，廣泛分布于細(xì)菌中[12,45]。銅綠假單胞菌中 MshE蛋白的c-di-GMP關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)突變影響菌體的運(yùn)動(dòng)性、表面附著能力以及生物被膜的形成，同時(shí)還影響細(xì)菌Ⅱ型和Ⅳ型分泌系統(tǒng)[45]。此外，新月柄桿菌GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白PopA[46]、霍亂弧菌GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白CdgG[47]都可通過(guò)其Ⅰ位點(diǎn)與c-di-GMP結(jié)合，參與調(diào)控細(xì)菌細(xì)胞周期進(jìn)程、菌體褶皺狀態(tài)以及生物被膜的形成。以上研究都表明了c-di-GMP的蛋白類受體和核糖開關(guān)受體下游調(diào)控基因在生理表型上的共性。此外，兩者也都可以通過(guò)各自的方式調(diào)控其他方面的功能，如c-di-GMP胞內(nèi)濃度/代謝以及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。圖4的分類結(jié)果顯示，c-di-GMP核糖開關(guān)下游調(diào)控基因中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[T]被顯著富集，其中包含很多 DGC和 PDE，表明c-di-GMP通過(guò)核糖開關(guān)來(lái)控制自身合成酶和降解酶的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控其代謝方式及細(xì)胞內(nèi)濃度；而其蛋白類受體則主要通過(guò)結(jié)合c-di-GMP改變自身構(gòu)象，調(diào)節(jié)其酶活力。例如，很多c-di-GMP合成酶都含有1個(gè)由RXXD模體組成的反饋抑制位點(diǎn)(Ⅰ位點(diǎn))，c-di-GMP與Ⅰ位點(diǎn)結(jié)合能夠抑制 DGC的活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP的濃度[48-49]。關(guān)于轉(zhuǎn)錄，c-di-GMP核糖開關(guān)調(diào)控的下游基因中轉(zhuǎn)錄[K]被顯著富集，其中很多基因?qū)儆?σ因子，所以核糖開關(guān)通過(guò)調(diào)控 σ因子來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控；而蛋白類受體則主要通過(guò)影響CRP以及其他一些轉(zhuǎn)錄因子的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控[10-11,50]。

綜上，c-di-GMP的RNA類受體和蛋白類受體調(diào)控下游基因的功能總體上比較相似，但是它們調(diào)控的方式有所不同，這可能與細(xì)菌所處的環(huán)境以及長(zhǎng)期的進(jìn)化有關(guān)。此外，目前對(duì)其蛋白類受體的研究還不夠充分，很多受體還沒有被發(fā)現(xiàn)，更多c-di-GMP介導(dǎo)的調(diào)控方式有待于進(jìn)一步揭示。

5 小結(jié)與展望

c-di-GMP是細(xì)菌體內(nèi)一種重要的第二信使分子，在調(diào)控細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性、生物被膜的形成、胞外多糖的合成、胞外酶分泌、致病性以及毒性等方面發(fā)揮重要的作用。近年來(lái)，對(duì)c-di-GMP的代謝、調(diào)控及功能的研究取得了很大的進(jìn)展。c-di-GMP核糖開關(guān)作為c-di-GMP的RNA受體，直接或間接介導(dǎo)c-di-GMP調(diào)控多種生理生化過(guò)程，具有重要作用。越來(lái)越多的研究表明c-di-GMP在細(xì)菌的致病性方面具有重要作用，c-di-GMP核糖開關(guān)調(diào)控的基因通常是編碼細(xì)菌生存或致病必需的基因，而在動(dòng)物和植物中至今還沒有發(fā)現(xiàn)c-di-GMP核糖開關(guān)，這為我們提供了1個(gè)新的藥物靶點(diǎn)，為藥物研發(fā)提供了可能。此外，c-di-GMP核糖開關(guān)還可以應(yīng)用到c-di-GMP合成酶DGC和降解酶PDE的鑒定、c-di-GMP濃度的檢測(cè)以及合成生物學(xué)領(lǐng)域。相信在科學(xué)家們的共同努力下c-di-GMP核糖開關(guān)會(huì)有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Structure and function ofc-di-GMP riboswitches

Xinfeng Li, Fang Chen, Jinfeng Xiao, and Jin He
State Key Laboratory of Agricultural Microbiology,College of Life Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan430070,Hubei,China

Cyclic diguanosine monophosphate(c-di-GMP)is a ubiquitous nucleotide second messenger present in a wide variety of bacteria.It regulates many important bacterial physiological functions such as biofilm formation, motility,adhesion, virulence and extracellular polysaccharide synthesis.It binds with many different proteins or RNA receptors, one of which is called riboswitch that is usually located at the5′-untranslational region(5′-UTR)in some mRNA.Riboswitch usually comprises a specific ligand-binding(sensor)domain(named aptamer domain, AD), as well as a variable domain,termed expression platform(EP), to regulate expression of downstream coding sequences.When a specific metabolite concentration exceeds its threshold level, it will bind to its cognate riboswitch receptor to induce a conformational change of5′-UTR, leading to modulation of downstream gene expression.Two classes ofc-di-GMP-binding riboswitches(c-di-GMP-Ⅰ andc-di-GMP-Ⅱ)have been discovered that bind with this second messenger with high affinity to regulate diverse downstream genes, underscoring the importance of this unique RNA receptor in this pathway.Class Ⅰc-di-GMP riboswitches are present in a wide variety of bacteria, and are most common in the phyla Firmicutes and Proteobacteria,while class Ⅱc-di-GMP riboswitches typically function as allosteric ribozymes, binding toc-di-GMP to induce folding changes at atypical splicing site junctions to modulate downstream gene expression.This review introduces the discovery,classification, function, and also the affected downstream genes ofc-di-GMP riboswitches.

nucleotide second messenger,c-di-GMP, riboswitch, gene regulation

March4,2017;Accepted:May3,2017

Jin He.Tel/Fax: +86-27-87280670; E-mail: hejin@mail.hzau.edu.cn

李新風(fēng), 陳芳, 肖金鳳, 等.環(huán)二鳥苷單磷酸核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)與功能.生物工程學(xué)報(bào),2017,33(9):1357?1368.

Li XF, Chen F, Xiao JF, et al.Structure and function ofc-di-GMP riboswitches.Chin J Biotech,2017,33(9):1357?1368.

Supported by:National Natural Science Foundation of China(No.31270105), the Fundamental Research Funds for the Central Universities(No.2662015PY175).

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.31270105)，中央高?；究蒲袑ｍ?xiàng)資金(No.2662015PY175)資助。

何進(jìn) 博士，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院教授，博導(dǎo)，生物工程系主任，生物工程專業(yè)負(fù)責(zé)人，農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室固定研究人員。1994年6月留校任教至今。其中2007?2008年在伊利諾伊大學(xué)微生物學(xué)系從事博士后研究。主要研究方向?yàn)槲⑸锏拇x調(diào)控、細(xì)菌核苷類第二信使分子及非編碼RNA的功能等。以責(zé)任作者身份發(fā)表SCI論文36篇。獲武漢市科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)1項(xiàng)。任Current Bioinformatics、《微生物學(xué)雜志》及《生物資源》等期刊的編委。