生物被膜在病原細(xì)菌與植物識(shí)別中的作用

宋麗陽，方榮祥，賈燕濤

1 中國科學(xué)院微生物研究所 植物基因組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

生物被膜在病原細(xì)菌與植物識(shí)別中的作用

宋麗陽1,2，方榮祥1，賈燕濤1

1 中國科學(xué)院微生物研究所 植物基因組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

生物被膜是微生物附著在生物或非生物表面所形成的一種三維結(jié)構(gòu)，細(xì)胞被其自身所產(chǎn)生的胞外聚合物所包圍，生物被膜的形成被認(rèn)為是微生物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫時(shí)所產(chǎn)生的一種自我防御機(jī)制。眾多微生物能夠在植物葉、維管束和根等組織中生長(zhǎng)，并在植物不同組織表面附著形成生物被膜，病原細(xì)菌的生物被膜隨植物內(nèi)部環(huán)境動(dòng)態(tài)變化是其有效發(fā)揮致病作用的關(guān)鍵，研究植物病原細(xì)菌生物被膜調(diào)控機(jī)制是認(rèn)識(shí)植物-病原菌互作的重要方面。文中將系統(tǒng)地介紹植物病原細(xì)菌生物被膜特征、組成成分、分子調(diào)控機(jī)制及最新研究進(jìn)展。

植物病原細(xì)菌，生物被膜，脅迫，調(diào)控機(jī)制

在自然界中，生物被膜的形成是影響大多數(shù)微生物定殖與生存的重要機(jī)制之一。處于生物被膜中的細(xì)菌彼此相互接觸，被細(xì)菌自身產(chǎn)生的胞外聚合物所包圍。這些胞外聚合物的主要成分有胞外多糖、胞外DNA(eDNA)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等[1]，形成復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。微生物利用生物被膜附著在生物或非生物表面，以應(yīng)對(duì)外界自然環(huán)境、與其他微生物競(jìng)爭(zhēng)以及與宿主相互識(shí)別等[1–3]。針對(duì)病原細(xì)菌銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa生物被膜已有較系統(tǒng)的研究，研究人員發(fā)現(xiàn)生物被膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，包括細(xì)菌起始粘附期、形成單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)的粘附期、菌落生長(zhǎng)期、復(fù)雜菌落結(jié)構(gòu)成熟期和浮游細(xì)胞播散期，而處于生物被膜中的細(xì)菌在各階段具有不同的生理生化特性[2,4–5]。當(dāng)細(xì)菌處于惡劣環(huán)境時(shí)，生物被膜可以保護(hù)其內(nèi)部的細(xì)胞，聚集的細(xì)胞群落表現(xiàn)出不同于浮游單細(xì)胞的特性，并提高對(duì)環(huán)境的適應(yīng)力[6]，無論是植物或動(dòng)物病原細(xì)菌在不同的組織表面所形成的生物被膜，都可以增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)抗生素的抗性，以及幫助細(xì)菌逃逸宿主的免疫反應(yīng)[7–8]。植物病原細(xì)菌借助生物被膜可以成功地在葉、莖、種子或根等組織生存和定殖。植物病原細(xì)菌生物被膜的形成除了作為細(xì)菌應(yīng)對(duì)脅迫的重要手段，還成為細(xì)菌致病過程中的重要致病因素，例如，葡萄皮爾斯病病原菌苛養(yǎng)木桿菌Xylella fastidiosa(Xf)和十字花科黑腐病病原菌野油菜黃單胞菌Xanthomonas campestrispv.campestris(Xcc)的生物被膜阻塞植物維管束組織，造成葉片萎蔫和焦枯[3,9–10]。

目前對(duì)于植物病原細(xì)菌生物被膜的研究尚有待進(jìn)一步深入，特別是在植物-病原細(xì)菌相互識(shí)別過程中，細(xì)菌生物被膜形成和維持穩(wěn)態(tài)的分子調(diào)控機(jī)制等的研究是值得特別關(guān)注的問題。文中將集中闡述參與植物病原細(xì)菌生物被膜的遺傳調(diào)控機(jī)制方面的研究進(jìn)展。

1 植物病原細(xì)菌生物被膜組成成分

生物被膜中的細(xì)菌包埋于自身所產(chǎn)生的胞外聚合物中，這種聚合狀態(tài)影響細(xì)菌生理生態(tài)特征，包括細(xì)胞間相互作用、營養(yǎng)利用、細(xì)菌群體環(huán)境適應(yīng)力等[11]。由于細(xì)菌種類和生物被膜所處環(huán)境不同，胞外聚合物的組成也會(huì)有所變化。

1.1 胞外多糖

胞外多糖是生物被膜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的重要結(jié)構(gòu)成分，幫助細(xì)菌附著在生物或非生物表面，抵抗各種環(huán)境脅迫[12]。研究發(fā)現(xiàn)處于不同環(huán)境中的不同細(xì)菌，其胞外多糖成分不同，有些是由單一的同多糖組成，如根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens的纖維素；大部分的胞外多糖是異多糖，如斯氏泛菌Pantoea stewartii的斯氏多糖、解淀粉歐文氏菌Erwinia amylovora的胞外多糖、P.aeruginosa的海藻酸、Xcc的黃原膠[1,13]。P.aeruginosa作為動(dòng)物和植物共同的病原細(xì)菌，生物被膜中主要有3種胞外多糖：海藻酸、Pel多糖和Psl多糖[14]。海藻酸主要在生物被膜形成初期和維持成熟生物被膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中具有重要作用[1,15]；Pel多糖由pel操縱子編碼合成，是富含葡萄糖的多糖，它對(duì)生物被膜的形成起著至關(guān)重要的作用[16]；Psl多糖由psl操縱子編碼合成，是甘露糖、葡萄糖和鼠李糖組成的戊多糖，參與細(xì)菌與生物或非生物表面的接觸和維持生物被膜結(jié)構(gòu)[17]。在很多細(xì)菌中，胞外多糖是生物被膜形成不可或缺的[18]。在一定生長(zhǎng)條件下，Xcc胞外多糖黃原膠合成基因簇gum突變，影響生物被膜的形成[19]。

1.2 蛋白質(zhì)

在生物被膜基質(zhì)中含有大量的蛋白質(zhì)，包括一些酶類和結(jié)構(gòu)蛋白。生物被膜中的胞外酶可參與降解生物聚合物或作為細(xì)菌毒力因子發(fā)揮作用。大多數(shù)病原細(xì)菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)分泌的酶可以降解植物細(xì)胞壁的不同組分[20]，使植物感病，如Xcc分泌的蛋白酶和木聚糖酶[21]；XfⅡ型分泌系統(tǒng)分泌的脂肪酶 LesA，與生物被膜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，可作為一個(gè)關(guān)鍵的毒力因子觸發(fā)葡萄皮爾斯病[22]。另外一些非酶類的胞外蛋白：菌毛結(jié)構(gòu)蛋白，是生物被膜組分之一；Bap(Biofilm-associated protein)家族蛋白或位于細(xì)胞表面、或被分泌到胞外，通過與鄰近細(xì)胞表面蛋白結(jié)合，將細(xì)胞固定于生物被膜內(nèi)；另一類蛋白，與凝集素和糖結(jié)合，可以識(shí)別其碳水化合物部分，通過結(jié)合基質(zhì)中的多糖成分或其他細(xì)胞表面的糖基促進(jìn)細(xì)胞-基質(zhì)或細(xì)胞-細(xì)胞的相互作用[12]。

1.3 eDNA

eDNA是大多數(shù)細(xì)菌生物被膜基質(zhì)的重要組分，如在P.aeruginosa生物被膜中就有大量的eDNA[23]。eDNA可以減少細(xì)胞與接觸物表面的排斥力、維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，所以 eDNA對(duì)生物被膜的形成和穩(wěn)定性至關(guān)重要[24]。eDNA還可與陽性螯合離子Mg2+結(jié)合，誘導(dǎo)特定基因表達(dá)，從而增加細(xì)菌對(duì)宿主抗菌肽或抗生素的抗性[25]。用 DNA酶處理成熟的P.aeruginosa生物被膜，生物被膜瓦解，也證明了在生物被膜中 eDNA的重要性[23]。生物被膜中的eDNA主要來源是細(xì)胞主動(dòng)分泌或細(xì)胞裂解釋放的基因組DNA[23,26]。

1.4 脂質(zhì)

在生物被膜基質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)[1]。脂質(zhì)在生物被膜中通常具有一定的生物功能，例如具有表面活性劑特性，提高對(duì)疏水物質(zhì)的生物利用效率，抗細(xì)菌和抗真菌，調(diào)節(jié)細(xì)菌表面吸附和脫離等[27]。脂質(zhì)可在生物被膜發(fā)展的不同階段起作用，包括與接觸物表面相互作用、微菌落形成、生物被膜結(jié)構(gòu)維持和消散等[28]。在A.tumefaciens中，卵磷脂缺失降低細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性，促進(jìn)生物被膜形成，減弱其致病性，不利于根瘤的形成；而鳥氨酸脂缺失的細(xì)菌能夠使宿主防御反應(yīng)降低，促進(jìn)根瘤的快速形成和發(fā)育[29]。

2 植物病原細(xì)菌的生物被膜

植物病原細(xì)菌可以通過植物表面進(jìn)入組織內(nèi)部，并在應(yīng)對(duì)宿主植物環(huán)境時(shí)形成復(fù)雜的多層復(fù)合體，從小型聚集體到三維結(jié)構(gòu)化的生物被膜復(fù)合體。對(duì)植物病原細(xì)菌生物被膜形成過程顯微觀察發(fā)現(xiàn)，成熟的生物被膜包裹多層細(xì)胞，形成纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[30–31]。病原細(xì)菌生物被膜的結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)變化及內(nèi)部細(xì)胞密度因植物類型、植物組織、生長(zhǎng)階段、環(huán)境條件等不同而不同，其變化對(duì)植物造成不同程度的影響[21]。細(xì)菌生物被膜的形成是一個(gè)高度協(xié)調(diào)的過程，此過程還受其他眾多因素的影響，包括環(huán)境溫度、水飽和度、pH值和營養(yǎng)成分等[2]。

2.1 葉際病原細(xì)菌與生物被膜

病原細(xì)菌從植物葉表面入侵時(shí)，光、熱、干燥等因素對(duì)于細(xì)菌定殖均造成不利影響，單個(gè)細(xì)胞分散在葉表面并不利于細(xì)菌存活，觀察發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌聚集體常常出現(xiàn)在植物葉片的氣孔、表皮毛和葉脈周圍，這些細(xì)菌聚集的位置具有濕度較大和營養(yǎng)物質(zhì)濃度較高的特點(diǎn)，有利于細(xì)菌存活[32]。以引起擬南芥、豆科植物褐斑病的丁香假單胞菌Pseudomonassyringae為例，細(xì)菌主要以聚集體的形式附著在葉片表面，聚集體形式的細(xì)胞適應(yīng)干燥的能力顯著強(qiáng)于單個(gè)細(xì)胞[32]。研究還發(fā)現(xiàn)，在草莓葉片定殖的P.syringae和成團(tuán)泛菌Pantoea agglomerans，形成包含眾多細(xì)胞的聚集體，聚集體內(nèi)部細(xì)胞受細(xì)菌釋放的信號(hào)分子調(diào)控，這些信號(hào)不僅調(diào)控細(xì)菌的聚集狀態(tài)，還能幫助細(xì)菌抵抗競(jìng)爭(zhēng)菌[30]。可見，生物被膜使細(xì)菌的聚集狀態(tài)更有利于協(xié)調(diào)細(xì)菌的群體行為，增強(qiáng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。

2.2 植物維管束病原細(xì)菌與生物被膜

某些病原細(xì)菌通過直接入侵、從受傷組織入侵或由刺吸式昆蟲傳播進(jìn)入植物維管組織，并利用生物被膜粘附在植物的木質(zhì)部和韌皮部。高密度的生物被膜和胞外多糖阻塞植物木質(zhì)部導(dǎo)管，造成組織損傷。例如，玉米細(xì)菌枯萎病的病原細(xì)菌P.stewartii、葡萄皮爾斯病的病原細(xì)菌Xf、十字花科植物黑腐病的病原細(xì)菌Xcc、馬鈴薯軟爛病菌Pectobacterium carotovorumsubsp.brasiliense和馬鈴薯環(huán)腐病菌Clavibacter michiganensissubsp.sepedonicus在植物維管組織中形成生物被膜，阻塞并破壞受感染的組織[21,30,33–34]。生物被膜甚至在昆蟲傳播病原細(xì)菌的過程中也起到重要作用，如Xf可在葉蟬腸道組織形成生物被膜[22]，有效保護(hù)病原細(xì)菌傳播到植物體內(nèi)[20]。成功定殖的病原細(xì)菌還能通過平衡細(xì)胞聚集和擴(kuò)散狀態(tài)以利于其擴(kuò)大侵染范圍。例如Xf的凝集素介導(dǎo)細(xì)胞間的聯(lián)系，凝集素缺失導(dǎo)致生物被膜形成受阻，但是由于突變體能夠較快地在植物體內(nèi)散播，可導(dǎo)致宿主植物組織更嚴(yán)重的損傷[35]。類似的現(xiàn)象也存在于Xcc致病過程中，β-1,4-甘露聚糖酶促進(jìn)細(xì)菌由聚集狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦∮螤顟B(tài)，有利于Xcc在宿主植物中有效擴(kuò)散[9]。

2.3 根際病原細(xì)菌與生物被膜

植物根際病原細(xì)菌與根際促生細(xì)菌在根部定殖的方式相似，但是致病性假單胞菌較益生假單胞菌形成更厚的生物被膜，這種不同可能是由于致病菌更需要利用生物被膜抵抗植物根部產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)[36–37]。A.tumefaciens可造成宿主植物冠癭病，從受傷的根部感染植物。A.tumefaciens一旦接觸根組織就可形成生物被膜，但是生物被膜在其致病過程中的作用機(jī)制還不清楚，推測(cè)生物被膜可能與促進(jìn)細(xì)菌接近植物根部合適的侵染位置，或逃避局部植物防御反應(yīng)有關(guān)[38–39]。具有類似特性的根際病原細(xì)菌還有發(fā)根土壤桿菌Agrobacterium rhizogenes和葡萄土壤桿菌Agrobacterium vitis。

3 生物被膜相關(guān)的調(diào)控機(jī)制

3.1 群體感應(yīng)與群體淬滅

群體感應(yīng)(Quorum sensing，QS)是一種細(xì)胞間信息交流的調(diào)控機(jī)制，細(xì)菌通過感知細(xì)胞密度和周圍微生物群落的物種組成變化調(diào)控自身基因表達(dá)，而通常細(xì)菌生物被膜受群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控[40]，因此通過干擾QS來影響細(xì)菌生物被膜形成，為防治植物細(xì)菌病害提供了一個(gè)重要手段。植物病原細(xì)菌中有幾種不同的QS信號(hào)分子，如?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHLs)、呋喃酰硼酸二酯(AI-2)、丁酸內(nèi)酯和甲基正十二烷酸(DSF)等，細(xì)胞通過感應(yīng)信號(hào)分子密度調(diào)控細(xì)胞種間和種內(nèi)信息交流，促進(jìn)細(xì)菌在植物體內(nèi)定殖與致病[41–42]。

P.syringae利用 AHLs信號(hào)控制其在宿主葉片上胞外多糖的合成和細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性，AHL合成酶基因缺失突變體胞外多糖合成途徑受損，細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)[43]。有趣的是在高等植物中存在細(xì)菌QS信號(hào)分子的類似物，該類似物能夠被植物病原細(xì)菌QS系統(tǒng)識(shí)別，干擾細(xì)菌對(duì)自身產(chǎn)生的信號(hào)的響應(yīng)[44–45]。植物產(chǎn)生的迷迭香酸(Rosmarinic acid，RA)是高絲氨酸內(nèi)酯(HSL)的類似物，它可與P.aeruginosa的QS調(diào)節(jié)子RhiR結(jié)合，相比于細(xì)菌的HSL可更有效地激活RhiR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)QS基因表達(dá)，促進(jìn)生物被膜的形成和綠膿菌素及彈性蛋白的產(chǎn)生[46]。因?yàn)?RA產(chǎn)生于被致病菌感染的植物根部，Corral-Lugo等假設(shè) RA的作用可能與植物防御機(jī)制相契合，但需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證[46–47]。此外，最近Hazan等發(fā)現(xiàn)P.aeruginosa產(chǎn)生的小分子化合物2-庚基-4-羥基喹啉-N-氧化物(HQNO)可以破壞細(xì)胞色素bc1復(fù)合體電子傳遞，引起氧爆，從而破壞細(xì)胞膜的完整性，最終導(dǎo)致細(xì)菌 QS調(diào)節(jié)分子介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡——自噬，細(xì)胞發(fā)生自溶和DNA釋放[26]。而自噬釋放的胞外DNA隨后促進(jìn)生物被膜的形成、增加細(xì)菌對(duì)抗生素的耐受性，因此這種細(xì)菌QS調(diào)節(jié)分子引起的自噬對(duì)其本身生存是有益的，可促進(jìn)細(xì)菌長(zhǎng)期慢性感染[26]。如果能有效地干擾這個(gè)過程，將為干擾植物病原細(xì)菌生物被膜形成、減弱其致病力提供新的途徑。

破壞QS調(diào)控系統(tǒng)有望成為阻止細(xì)菌產(chǎn)生致病性的一種有效方式，破壞QS的方法稱為群體淬滅(Quorum quenching，QQ)[48]，主要有3種途徑：抑制與QS信號(hào)合成相關(guān)酶的表達(dá)或抑制其活性，直接破壞QS信號(hào)分子和抑制其信號(hào)分子積累及其受體活性[49–53]。抑制或酶解 AHLs是控制革蘭氏陰性病原細(xì)菌致病性和生物被膜形成的有效措施。目前主要有3類群體淬滅酶：水解酶、內(nèi)酯酶、氧化還原酶[54–55]。例如，植物病原細(xì)菌黑脛病菌Pectobacterium atrosepticum(PaPVA)和A.tumefaciens所產(chǎn)生的青霉素酰化酶(Penicillin V acylase，PVA)降解長(zhǎng)鏈AHLs，可以抑制銅綠假單胞菌綠膿菌素的產(chǎn)生和生物被膜的形成，從而削弱細(xì)菌的致病力[56]；P.syringaeB728a有2個(gè) AHLs?；窰acA和HacB，通過斷裂AHLs酰胺鍵而使底物分子失活，從而影響周圍細(xì)菌的生物被膜狀態(tài)和致病 力[57]。此外益生菌淬滅病原細(xì)菌 QS是一種有效的生物防治方法，芽孢桿菌Bacillus是從土壤中鑒定到的第一個(gè)具有QQ功能的細(xì)菌，其產(chǎn)生的AiiA酶可使胡蘿卜軟腐歐文氏菌Erwinia carotovoraQS信號(hào)AI失活，降低病原細(xì)菌致病性[58]。胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacterium carotovorumsubsp.Carotovorum(Pcc)病原細(xì)菌能夠在馬鈴薯等寄主上引起嚴(yán)重的細(xì)菌性軟腐病，Garge等分離到了3種Bacillus菌株，可高效降解Pcc產(chǎn)生的AHLs并顯著降低其致病性，利用Bacillus進(jìn)行生物防治的方法已在許多植物病害防治中得到應(yīng)用[59]。另外，將細(xì)菌AHL降解酶在植物中表達(dá)可以減緩細(xì)菌毒力因子的產(chǎn)生，同時(shí)可增強(qiáng)植物的抗病能力[58]。未來可以進(jìn)一步關(guān)注對(duì)宿主植物無害的QS信號(hào)分子降解酶的發(fā)掘，為更好地利用這種生物防治方法提供有效資源。

3.2 離子通道介導(dǎo)的電信號(hào)

細(xì)菌可以通過不同的通訊方式協(xié)調(diào)它們的行為，2015年，Süel實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了一種新的細(xì)胞間信息交流機(jī)制：生物被膜群落中的細(xì)菌彼此間在電學(xué)上通過被稱作“離子通道”的蛋白進(jìn)行通信，這種離子通道實(shí)施遠(yuǎn)程電信號(hào)，協(xié)調(diào)生物被膜內(nèi)部和外周細(xì)胞的代謝狀態(tài)[60–61]。最近Süel實(shí)驗(yàn)室又發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生物被膜包裹的細(xì)胞群落能夠通過遠(yuǎn)程電信號(hào)招募不同細(xì)菌物種到它們的生物被膜中[62]，他們將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與數(shù)學(xué)建模整合，發(fā)現(xiàn)由枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis單個(gè)菌株組成的生物被膜能夠通過電信號(hào)招募另一不同菌株P(guān).aeruginosa[62]。生物被膜這種特性，無論是對(duì)人類健康還是植物健康都具有較高的應(yīng)用價(jià)值，比如破壞病原細(xì)菌電信號(hào)使其不能招募周圍的細(xì)菌，從而抑制其生物被膜的生長(zhǎng)。

3.3 Cyclic dimeric(3′→5′)GMP

Cyclic dimeric(3′→5′)GMP(c-di-GMP)環(huán)二鳥苷酸是細(xì)菌內(nèi)重要的第二信使，1987年首次發(fā)現(xiàn)其在木醋桿菌Acetobacter xylinum中可激活纖維素合酶[63]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，c-di-GMP可參與多種細(xì)菌生理過程的調(diào)控，包括毒力、細(xì)胞周期和分化、胞外多糖的合成、從浮游狀態(tài)轉(zhuǎn)變到聚集狀態(tài)和生物被膜形成[64–65]。細(xì)菌一旦與生物或非生物表面接觸，迅速改變它們的行為，釋放粘附素，激活細(xì)胞表面的細(xì)胞器，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)并保護(hù)正在生長(zhǎng)的菌落。例如，c-di-GMP可以參與調(diào)控多種細(xì)菌的表面粘附和運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器——Ⅳ型菌毛(Type Ⅳ pili，T4P)的合成[66]。細(xì)胞內(nèi)的c-di-GMP水平由雙鳥苷酸環(huán)化酶(DGCs)和磷酸二酯酶(PDEs)控制，帶有GGDEF結(jié)構(gòu)域的DGCs合成c-di-GMP，帶有EAL或 HD-GYP結(jié)構(gòu)域的PDEs則起降解作用[67–70]，增加或減少c-di-GMP都會(huì)改變細(xì)菌的生物被膜狀態(tài)。高濃度的c-di-GMP誘導(dǎo)胞外多糖的生物合成，隨后促進(jìn)生物被膜形成，反之，則抑制生物被膜的形成。在動(dòng)、植物病原細(xì)菌中c-di-GMP調(diào)控生物被膜的分子機(jī)制是保守的[71]，這也反映了生物被膜在細(xì)菌感侵宿主過程中起著非常重要的作用。

在植物病原細(xì)菌E.amylovora中過表達(dá)DGCs能夠提高細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP水平，促進(jìn)胞外多糖合成和生物被膜形成；而c-di-GMP合成基因的缺失突變導(dǎo)致細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)，生物被膜減少，致病能力增強(qiáng)，推測(cè)該突變體運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)，促進(jìn)了E.amylovora從葉片侵染部位迅速擴(kuò)散[72]。此外，c-di-GMP可與E.amylovora纖維素合成酶亞基BcsA結(jié)合，正調(diào)控纖維素的合成，纖維素含量影響生物被膜的三維結(jié)構(gòu)，生物被膜有助于細(xì)菌系統(tǒng)地侵染宿主[73]。Xcc毒力因子的合成與生物被膜的擴(kuò)散受一個(gè)雙組分系統(tǒng)和細(xì)胞可擴(kuò)散信號(hào)分子(DSF)正調(diào)控，雙組分系統(tǒng)由帶有HD-GYP結(jié)構(gòu)域的RpfG 和同源的RpfC組成。由于RpfG帶有HD-GYP結(jié)構(gòu)域，所以它具有降解c-di-GMP的作用，ΔrpfG突變體生物被膜增加，證實(shí)了c-di-GMP對(duì)生物被膜的形成具有正調(diào)控作用[74]。先前研究報(bào)道，細(xì)菌在高細(xì)胞密度時(shí)，信號(hào)分子DSF可以被RpfC感知，從而激活RpfG降解c-di-GMP，并激活毒力相關(guān)基因表達(dá)[9,75–76]。最近有證據(jù)表明DSF分子可直接結(jié)合在RpfC蛋白N端的一段長(zhǎng)22個(gè)氨基酸的信號(hào)感應(yīng)區(qū)上，激活RpfC蛋白的激酶活性[77]。Engl等在丁香假單胞菌番茄變種Pseudomonas syringaepv.tomato DC3000 中也發(fā)現(xiàn)c-di-GMP可以誘導(dǎo)細(xì)菌生物被膜形成和逃避宿主免疫。在這個(gè)病原細(xì)菌中Chp8的表達(dá)受植物信號(hào)誘導(dǎo)，基因產(chǎn)物具有合成和降解c-di-GMP的雙重功能，但是chp8突變使細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP水平降低，抑制胞外多糖的合成及生物被膜的形成，誘導(dǎo)病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)鞭毛蛋白的表達(dá)，由于植物識(shí)別PAMP而積累水楊酸(Salicylic acid，SA)，啟動(dòng)植物免疫反應(yīng)[11]。

3.4 分泌系統(tǒng)

病原細(xì)菌具有多種分泌系統(tǒng)，而一些分泌系統(tǒng)跟細(xì)胞聚集和生物被膜形成相關(guān)。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)是一種非常重要的動(dòng)植物分泌系統(tǒng)，是大部分革蘭氏陰性病原細(xì)菌致病所必需的，P.syringaeT3SS缺失突變體不能在宿主煙草葉片上聚集，并且致病力減弱[38]。同樣柑桔潰瘍病菌Xanthomonas citrisubsp.citriT3SS缺失突變體ΔhrpB不能在植物葉表面形成生物被膜[78]。此外能夠調(diào)節(jié)T3SS的基因，也參與生物被膜合成相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。例如，E.amylovoraHrpL不僅可以調(diào)控 T3SS結(jié)構(gòu)元件的表達(dá)，還可調(diào)控其他基因——脂蛋白基因nlpl和轉(zhuǎn)錄因子基因ydcN的轉(zhuǎn)錄，這兩個(gè)基因的突變導(dǎo)致細(xì)菌表現(xiàn)出更加聚集的表型，及生物被膜的增加[79]。雖然T3SS與生物被膜形成之間有一定關(guān)系，但是在植物病原細(xì)菌中尚未發(fā)現(xiàn)明確的或特殊的T3SS效應(yīng)蛋白參與調(diào)控生物被膜形成[80]。

某些革蘭氏陰性菌依賴Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)發(fā)揮毒力作用，T6SS可以正調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)因子和QS調(diào)節(jié)因子表達(dá)，增加細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力[81]，影響生物被膜的形成[82]。瓜類果斑病菌Acidovorax citrulli，一種可以引起瓜類蔬菜細(xì)菌性果斑病的病原細(xì)菌，在其基因組中有一個(gè)編碼 T6SS的基因簇，其包含17個(gè)基因，分別單獨(dú)敲除這17個(gè)基因，其中4個(gè)T6SS關(guān)鍵基因突變體ΔvasD、ΔimpK、ΔimpJ和ΔimpF在甜瓜種子上定殖和形成生物被膜的能力減弱，但這并不影響它們對(duì)幼苗組織的致病力，說明 T6SS可能在細(xì)菌致病早期起作用[83]。

3.5 其他信號(hào)

病原細(xì)菌在與宿主植物互作時(shí)，其生物被膜的形成依賴于對(duì)植物的營養(yǎng)狀態(tài)、植物的特殊代謝產(chǎn)物、QS信號(hào)分子、金屬離子和氧濃度等的感應(yīng)。其中一些關(guān)鍵營養(yǎng)元素被證實(shí)可控制細(xì)菌聚集及在介質(zhì)表面附著，如在大多數(shù)細(xì)菌中存在的PhoR-PhoB雙組分系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細(xì)菌在缺磷脅迫下細(xì)胞的附著和生物被膜形成，A.tumefaciens利用此雙組分系統(tǒng)在缺磷脅迫下增加細(xì)胞在介質(zhì)表面附著量、聚集體平均厚度、平均覆蓋率，促進(jìn)形成生物被膜[84]。斯氏泛菌斯氏亞種Pantoea stewartiisubsp.stewartii是造成甜玉米萎蔫病的致病菌，其在缺鐵狀態(tài)下，產(chǎn)生載鐵蛋白幫助捕獲鐵元素，若載鐵蛋白缺失突變，則細(xì)菌在宿主植物表面的運(yùn)動(dòng)性降低[85]，而運(yùn)動(dòng)性對(duì)細(xì)菌的生物被膜形成的初始階段、細(xì)菌在宿主木質(zhì)部移動(dòng)和致病性都至關(guān)重要[36]。細(xì)菌在植物體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)依賴于載體蛋白的合成，更重要的是載體蛋白捕獲鐵元素的功能是發(fā)揮毒力所必需的，因此活性鐵是這個(gè)重要的木質(zhì)部定殖的病原細(xì)菌致病性所必不可少的元素[85]。Cruz等還發(fā)現(xiàn)在Xf中鈣離子濃度可以影響細(xì)菌附著、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞聚集及生物被膜厚度[86]；此外鈣離子與胞外DNA的結(jié)合也可促進(jìn)細(xì)胞聚集及生物被膜的形成[87]。

在植物病原細(xì)菌中，氧也影響生物被膜的形成。在Xf和A.tumefaciens中，翼狀螺旋蛋白BigR是金屬傳感器ArsR/SmtB家族的一員，其通過占據(jù)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)抑制bigR操縱子的轉(zhuǎn)錄，參與生物被膜形成[88]，而BigR作為一種新的氧化還原開關(guān)，在有氧的條件下抑制bigR操縱子轉(zhuǎn)錄[89]。細(xì)菌在木質(zhì)部或根部定殖形成生物被膜，被膜內(nèi)部細(xì)菌處于缺氧狀態(tài)，硫化氫含量增加，細(xì)菌細(xì)胞色素 c氧化酶活性受到抑制，此時(shí)BigR解除對(duì)bigR操縱子轉(zhuǎn)錄的抑制，bigR操縱子表達(dá)對(duì)硫化氫解毒是非常重要的，去除硫化氫可以使細(xì)菌在缺氧的條件下進(jìn)行有氧生長(zhǎng)[89]。在P.aeruginosa中，氧化還原代謝產(chǎn)物吩嗪參與調(diào)控生物被膜形成、毒性、慢性感染等過程，吩嗪以多種形式存在，其中綠膿菌素是最常見的一種形式[90–95]。Costa等研究發(fā)現(xiàn)偶發(fā)分歧桿菌Mycobacterium fortuitum分泌的一種名為綠膿菌素脫甲基酶(Pyocyanin demethylase，PodA)的小分子蛋白，可以將綠膿菌素的甲基氧化為醛基，當(dāng)將PodA酶加入到培養(yǎng)基中，綠膿桿菌生物被膜的形成被阻斷。由于生物被膜成熟后，位于被膜更深層次的細(xì)胞逐漸面臨缺氧和氧化還原脅迫，綠膿菌素可緩解該脅迫，利于細(xì)菌生存；外加PodA酶則可抑制綠膿菌素的作用，限制成熟生物被膜內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量[96]。

病原細(xì)菌與植物之間復(fù)雜的相互識(shí)別過程可以改變宿主內(nèi)部環(huán)境，影響細(xì)菌生物被膜相應(yīng)生長(zhǎng)階段及調(diào)節(jié)生物被膜相關(guān)基因表達(dá)[2,80]。例如，X.citri自然變種X.citriAT，具有與A型致病菌X.citriT大于90%的遺傳相似性而被命名為X.citriAT[37]，由于細(xì)菌觸發(fā)了宿主植物檸檬特異性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致植物轉(zhuǎn)錄重編程，造成植物細(xì)胞壁增厚、氧化爆發(fā)、SA和酚類化合物積累，所以生物被膜生成和細(xì)菌生長(zhǎng)受到阻滯，致使細(xì)菌致病力減弱[97]。研究表明植物SA免疫途徑與其自噬機(jī)制有關(guān)，盡管X.citriAT可在葉片表面及葉肉組織的細(xì)胞間隙定殖，但細(xì)菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的自噬空泡釋放水解酶，抑制細(xì)菌生物被膜的成熟[97]。

4 展望

病原細(xì)菌在植物各組織表面形成生物被膜對(duì)細(xì)菌致病性、細(xì)菌與宿主互作、宿主植物生理特性、生物被膜外圍其他細(xì)菌物種都有深遠(yuǎn)的影響。已有的研究揭示了一些與生物被膜密切相關(guān)的機(jī)制，如QS、離子通道介導(dǎo)的電信號(hào)、第二信使c-di-GMP和分泌系統(tǒng)等，均能調(diào)控生物被膜的形成和消解；另外，生物被膜的形成還依賴于細(xì)菌對(duì)宿主植物信號(hào)和細(xì)菌胞外非生物環(huán)境條件的識(shí)別(圖1)。這些影響生物被膜形成因素之間的相互調(diào)控關(guān)系仍需要進(jìn)一步研究，以充分闡釋細(xì)菌關(guān)鍵信號(hào)通路之間的相互作用，揭示生物被膜群落和復(fù)雜的多菌種組合形成的機(jī)理。植物信號(hào)分子是調(diào)控植物表面生物被膜至關(guān)重要的因素，在病原細(xì)菌與宿主植物相互識(shí)別過程中具有重要作用，宿主植物產(chǎn)生的信號(hào)分子對(duì)細(xì)菌生物被膜代謝調(diào)控的分子機(jī)理值得進(jìn)一步探索。

圖1 影響植物病原細(xì)菌生物被膜形成的因素(HQNO為2-庚基-4-羥基喹啉-N-氧化物，可以抑制細(xì)胞色素bc1復(fù)合體電子傳遞，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞自溶，釋放營養(yǎng)物質(zhì)和eDNA，釋放的eDNA促進(jìn)生物被膜形成；植物所產(chǎn)生的群體感應(yīng)(QS)信號(hào)分子類似物具有促進(jìn)或干擾細(xì)菌QS系統(tǒng)的作用，影響生物被膜的形成；DGCs和PDEs分別為雙鳥苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶，它們分別具有合成和消解c-di-GMP的功能，而c-di-GMP正調(diào)控生物被膜的形成；細(xì)菌的分泌系統(tǒng)促進(jìn)形成生物被膜，如Ⅲ和Ⅵ型分泌系統(tǒng)；細(xì)菌生物被膜包裹的細(xì)胞群落能夠通過遠(yuǎn)程電信號(hào)招募周圍細(xì)菌；不同的環(huán)境因素也可影響細(xì)菌生物被膜的形成。)Fig.1 Diverse factors regulating bacterial biofilm formation.HQNO,2-n-heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide, can inhibit bacterial respiration via the cytochromebc1complex, then causes bacterial autolysis leading to release of nutrients and eDNA and promoting biofilm formation.Plant-derived quorum sensing(QS)signal-mimics have the ability to affect bacterial QS system which also influences bacterial biofilm formation.High level ofc-di-GMP promotes biofilm formation.The Intracellular level ofc-di-GMP is controlled by diguanylate cyclases(DGCs)and phosphodiesterases(PDEs), DGCs synthesizec-di-GMP, whereas PDEs carry out its degradation.Type III and VI secretion systems are essential for bacterial biofilm formation.Pre-existing bacterial biofilms mediate ion-channel-based electrical signaling which recruits surrounding cells into the biofilm community.Some environmental cues can also affect biofilm formation.

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從圖3中可以看出，ICSA-ECOC編碼選擇方法在大部分情況下的分類正確率要優(yōu)于經(jīng)典的事前編碼和基于數(shù)據(jù)的編碼.經(jīng)典的一對(duì)一編碼和基于混淆矩陣的編碼方法在部分?jǐn)?shù)據(jù)集上也能取得很好的分類效果.一對(duì)一編碼通過成對(duì)編碼充分考慮了每個(gè)兩類劃分，而基于混淆矩陣的編碼能夠利用預(yù)分類器對(duì)原始類別的可分性進(jìn)行評(píng)估，為子類劃分提供依據(jù)，能獲得比事前編碼更優(yōu)秀的分類性能.

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

February28,2017;Accepted:May5,2017

s:Yantao Jia.Tel: +86-10-64861838; Fax: +86-10-64858245; E-mail: jiayt@im.ac.cn Rongxiang Fang.E-mail: fangrx@im.ac.cn

Function of biofilms in phytopathogenic bacterial-host interactions

Liyang Song1,2, Rongxiang Fang1, and Yantao Jia1
1State Key Laboratory of Plant Genomics,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China
2University of Chinese Academy of Sciences,Beijing100049,China

Biofilms are complex three-dimensional bacterial assemblages that attach to biotic or abiotic solid surfaces,and frequently embed within a self-produced matrix of extracellular polymeric substances.Biofilm formation is a microbial defense response to biotic and abiotic stresses, and a key factor for survival in adverse environments.A wide variety ofmicroorganisms can colonize distant tissues of higher plants, such as leaves, vascular network and roots, and adhere to the surface of the tissues to form biofilms.The dynamic processes in forming biofilms in response to plant internal environment are key steps required for full virulence of phytopathogenic bacteria.Exploring the mechanisms involved in regulation of bacterial biofilms is important for understanding the plant-pathogens interactions.In this review, we summarized the research progresses related to the biofilms of bacterial phytopathogens, including biofilm characteristics,essential regulatory mechanisms and key signals affecting the transition between a planktonic lifestyle and multicellular behavior.

phytopathogenic bacteria, biofilms, stress, regulatory mechanism

宋麗陽, 方榮祥, 賈燕濤.生物被膜在病原細(xì)菌與植物識(shí)別中的作用.生物工程學(xué)報(bào),2017,33(9):1640–1653.

Song LY, Fang RX, Jia YT.Function of biofilms in phytopathogenic bacterial-host interactions.Chin J Biotech,2017,33(9):1640–1653.

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2015CB150604), National Key Research and Development Program of China(No.2016YFD0100601), National Natural Science Foundation of China(No.31370161).

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2015CB150604)，國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(No.2016YFD0100601)，國家自然科學(xué)基金(No.31370161)資助。

時(shí)間：2017-05-24

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170524.0906.002.html

方榮祥 中國科學(xué)院微生物研究所研究員，博士生導(dǎo)師，中國科學(xué)院院士，《生物工程學(xué)報(bào)》副主編。研究方向?yàn)椋褐参锘虮磉_(dá)的調(diào)控機(jī)制及其在植物生物技術(shù)上的應(yīng)用，植物病原細(xì)菌致病相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，植物病毒致病因子的功能分析及其與寄主防衛(wèi)系統(tǒng)的相互作用。在國內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表論文110余篇。2016年獲得“中國植物病理學(xué)會(huì)終身成就獎(jiǎng)”。

賈燕濤 博士，中國科學(xué)院微生物研究所研究員。研究方向?yàn)橹参锱c病原菌互作分子機(jī)理。曾參加野油菜黃單胞菌全基因組序列分析工作，是該項(xiàng)目的主要完成人之一，目前主要從事細(xì)菌群體感應(yīng)跨界信號(hào)途徑及植物抗病機(jī)理方面的研究。