帕金森病模型小鼠脾懸液中輔助性T細(xì)胞17和髓系抑制性細(xì)胞數(shù)量的變化及其意義

陳思遠(yuǎn)，舒揚(yáng)，趙峰，于明

·論著·

帕金森病模型小鼠脾懸液中輔助性T細(xì)胞17和髓系抑制性細(xì)胞數(shù)量的變化及其意義

陳思遠(yuǎn)，舒揚(yáng)，趙峰，于明

目的探討帕金森病(PD)模型小鼠脾懸液中輔助性T細(xì)胞17(Th17)和髓系抑制性細(xì)胞(MDSC)數(shù)量的變化及其意義。方法將40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為PD組(A組)、PD+吉西他濱組(B組)、吉西他濱組(C組)與對照組(D組)，每組10只小鼠。A組和B組予1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶 (MPTP)(30 mg/kg)連續(xù)腹腔注射7 d；B組和C組于第1 d，7 d腹腔注射吉西他濱(120 mg/kg)；D組予等體積生理鹽水腹腔注射。第8 d進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，檢測各組小鼠黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶(TH)陽性細(xì)胞數(shù)量和脾懸液Th17和MDSC細(xì)胞百分率。結(jié)果與建模前比較，A組、B組小鼠調(diào)頭時間、爬桿時間明顯延長，懸掛時間明顯縮短(均P<0.05)。與C組、D組比較，建模后A組、B組小鼠調(diào)頭時間、爬桿時間明顯延長，懸掛時間明顯縮短(均P<0.05)。A組、B組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù)量較C組和D組明顯減少(均P<0.05)。A組、B組小鼠脾懸液中Th17、MDSC細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較C組和D組明顯升高(均P<0.05)；且B組小鼠脾懸液中Th17細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯高于A組(P<0.05)，A組小鼠脾懸液中MDSC細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯高于B組(P<0.05)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，A組和B組小鼠Th17和MDSC細(xì)胞百分?jǐn)?shù)間均無相關(guān)性(r=-0.319，r=0.04，均P>0.05)。結(jié)論P(yáng)D模型小鼠Th17、MDSC數(shù)量增加，可能參與了PD的發(fā)生發(fā)展。MDSC有可能發(fā)揮了抑制Th17擴(kuò)增的免疫調(diào)節(jié)作用。

帕金森病;輔助性T細(xì)胞17;髓系抑制性細(xì)胞;1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶;吉西他濱

帕金森病(PD)是常見的進(jìn)展性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡，紋狀體內(nèi)多巴胺供應(yīng)不足，進(jìn)而引起靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動遲緩、姿勢步態(tài)異常等癥狀[1]。神經(jīng)免疫炎性機(jī)制參與了PD的發(fā)生發(fā)展，主要表現(xiàn)為腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而誘發(fā)并加重PD的病理過程[2]。輔助性T細(xì)胞17(Th17)、髓系抑制性細(xì)胞(MDSC)在部分炎性疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3]，但其對PD作用如何尚未確定。吉西他濱作為可影響核酸生物合成的藥物，常用于腫瘤等疾病治療。由于其有選擇性消除MDSC的特點(diǎn)，且尚未發(fā)現(xiàn)對神經(jīng)系統(tǒng)的影響[4]，現(xiàn)普遍用于MDSC與神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系的研究中[5]。本研究通過1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶(MPTP)建立PD小鼠模型，檢測其脾懸液中Th17和MDSC的細(xì)胞百分率。并通過吉西他濱干預(yù)MDSC，初步探究Th17和MDSC在PD中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及分組 SPF級健康雄性6～8周齡C57BL/6小鼠40只，購買并飼養(yǎng)于江蘇大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，許可證：SCXK(蘇)2013-0011，分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，晝夜循環(huán)光照。適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)平均分為PD組(A組)、PD+吉西他濱組(B組)、吉西他濱組(C組)與對照組(D組)。

1.1.2 藥品和試劑 鹽酸吉西他濱(澤菲)購于江蘇豪森藥業(yè)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20030104。紅細(xì)胞裂解液、DAB顯色試劑盒、RPMI-1640培養(yǎng)基和HRP-羊抗兔購于碧云天公司。MPTP、Th17刺激劑(50 ng/ml PMA、1 μg/ml 離子霉素和1 μg/ml 莫能霉素)、Fix&Perm液、CD3-APC、CD8-FITC、IL-17A-PE、CD11b-PE、Gr-1-FITC及相關(guān)同型對照抗體均購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 各組小鼠處理方法 各組小鼠于建模前1 d予行為學(xué)試驗(yàn)排除有明顯個體差異的小鼠。A組和B組小鼠予MPTP(30 mg/kg)連續(xù)腹腔注射7 d建立亞急性PD模型；B組和C組小鼠于第1 d、7 d予腹腔注射吉西他濱(120 mg/kg)；D組小鼠予等體積生理鹽水腹腔注射。第8 d進(jìn)行行為學(xué)試驗(yàn)后，二氧化碳麻醉處死小鼠，酒精中浸泡5 min，取小鼠脾臟，腦組織留待相關(guān)細(xì)胞因子檢測和酪氨酸羥化酶(TH)免疫組化染色。

1.2.2 行為學(xué)試驗(yàn)

1.2.2.1 爬桿試驗(yàn) 將長30 cm木桿豎立固定，并用直徑5 cm的泡沫板固定于木桿頂部。試驗(yàn)時將小鼠頭朝上放置于木桿頂端，分別記錄小鼠調(diào)轉(zhuǎn)方向頭朝下和小鼠爬至桿底的時間。每只小鼠檢測3次，每次間隔2 min。

1.2.2.2 懸掛試驗(yàn) 透明有機(jī)玻璃制作懸掛試驗(yàn)箱，水平放置一根直徑0.5 cm，距離地面30 cm的木桿，木桿上約0.8 cm加蓋。試驗(yàn)中將小鼠懸掛于木桿，記錄小鼠落地時間，若超過3 min仍未落地，則記為180 s。每只小鼠檢測3次，每次間隔2 min。

1.2.3 免疫組化檢測小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)的TH陽性細(xì)胞 小鼠腦組織固定于4%甲醛溶液，常規(guī)石蠟包埋切片，脫蠟至水后高壓抗原修復(fù)，PBS清洗后依次分別予0.25%Triton-X100、3%H2O2浸泡10 min，2.5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h后加入TH抗體稀釋液(1∶100)，4 ℃過夜后加入二抗，室溫孵育1 h，滴加DAB顯色液， Nikon ECLIPSE Ti 顯微鏡(×40)下拍攝每張切片中腦右側(cè)黑質(zhì)區(qū)，采用Image J軟件處理后，每張切片取400 μm × 400 μm視野的五個不同區(qū)域，計平均TH陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 脾懸液制備 取小鼠脾臟置入300目篩網(wǎng)研磨、過濾，收集細(xì)胞懸液入EP管，4 ℃，500 g離心5 min。棄上清，紅細(xì)胞裂解液處理后，收集細(xì)胞并加RPMI-1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞數(shù)約為2×106/ml的脾細(xì)胞懸液備用。

1.2.5 Th17數(shù)量的檢測 流式管內(nèi)加入100 μl上述脾懸液和1 μl Th17刺激劑，在37 ℃、5%CO2環(huán)境下孵育5 h后加入5 μl CD3-APC和2 μl CD8-FITC。避光孵育后均分兩管，F(xiàn)ix&Perm 液破膜、固定后，樣本管內(nèi)加入5 μl IL-17A-PE，與同型對照管避光孵育后，利用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，選取CD3+標(biāo)記的細(xì)胞群，隨后選取IL-17+CD8-細(xì)胞作為Th17。

1.2.6 MDSC數(shù)量的檢測 流式管內(nèi)加入上述脾懸液50 μl，并加5 μl CD11b-PE，2 μl Gr-1-FITC，同型對照管內(nèi)加入等量脾懸液和對應(yīng)同型對照抗體，避光孵育后利用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測MDSC細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。選取CD11b+Gr-1+細(xì)胞作為MDSC。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般運(yùn)動行為觀察 建模前各組小鼠運(yùn)動方面均無明顯差異。建模結(jié)束后A組和B組小鼠出現(xiàn)震顫、運(yùn)動減少、步態(tài)不穩(wěn)、豎尾豎毛等表現(xiàn)，C組和D組較建模前無明顯異常。

2.2 各組間行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)果的比較 見表1。建模前，各組小鼠行為學(xué)試驗(yàn)中均未見表現(xiàn)明顯異常的小鼠，各組間行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。與建模前比較，A組、B組小鼠調(diào)頭時間、爬桿時間明顯延長，懸掛時間明顯縮短(均P<0.05)。與C組、D組比較，建模后A組、B組小鼠調(diào)頭時間、爬桿時間明顯延長，懸掛時間明顯縮短(均P<0.05)。

2.3 各組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù)的比較 見圖1、表2。C組和D組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞豐富， A組和B組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù)較C組和D組明顯減少(均P<0.05)。

表1 各組小鼠行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)果的比較(x±s,s,n=10)組別建模前調(diào)頭時間爬桿時間懸掛時間建模后調(diào)頭時間爬桿時間懸掛時間A組0.87±0.162.51±0.28171.40±9.721.35±0.41*△▲4.78±0.87*△▲134.40±22.23*△▲B組0.89±0.122.55±0.33173.50±6.111.25±0.34*△▲4.96±0.80*△▲132.80±25.94*△▲C組0.84±0.152.57±0.41172.60±7.900.82±0.182.58±0.45171.70±9.23D組0.89±0.182.60±0.42172.50±6.330.88±0.202.64±0.48169.90±14.26 注:與建模前比較*P<0.05;與D組比較△P<0.05;與C組比較▲P<0.05

圖1 小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞染色呈黃褐色，方框內(nèi)為小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)。A組(A)和B組(B)小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù)較C組(C)和D組(D)明顯減少(免疫組化染色，×40)

表2 各組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù)和脾懸液中Th17與MDSC細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(x±s,n=10)組別TH陽性細(xì)胞數(shù)(個)Th17細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(%)MDSC細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(%)A組 5.87±2.01*△ 0.54±0.07*△▲ 11.17±0.68*△▲B組5.39±2.63*△1.35±0.09*△4.66±0.35*△C組11.27±1.870.26±0.072.71±0.26D組10.16±2.300.28±0.062.40±0.28 注:與D組比較*P<0.05;與C組比較△P<0.05;與B組比較▲P<0.05

2.4 各組小鼠Th17細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的比較 見表2。A組、B組小鼠脾懸液中Th17細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較C組和D組明顯升高(均P<0.05)；且B組小鼠脾懸液中Th17細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較A組明顯升高(P<0.05)。

2.5 各組小鼠MDSC細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的比較 見表2。A組、B組小鼠脾懸液中MDSC細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較C組和D組明顯升高(均P<0.05)；且A組小鼠脾懸液中MDSC細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較B組明顯升高(P<0.05)。

2.6 A組和B組小鼠Th17和MDSC細(xì)胞百分?jǐn)?shù)相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，A組和B組小鼠Th17和MDSC細(xì)胞百分?jǐn)?shù)間均無相關(guān)性(r=-0.319，r=0.04，均P>0.05)。

3 討 論

近年研究[6]認(rèn)為，CNS小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞過度激活后，釋放多種炎性細(xì)胞因子(如IFN-γ、IL-6、IL-1β等)介導(dǎo)腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的免疫炎性反應(yīng)，引起多巴胺能神經(jīng)元死亡，從而誘發(fā)和加重PD的病理過程。除了小膠質(zhì)細(xì)胞激活，PD患者和小鼠黑質(zhì)區(qū)域均存在CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤，說明免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞在PD進(jìn)程中也參與介導(dǎo)了神經(jīng)免疫炎性反應(yīng)[7-8]。由于血-腦屏障的存在，外周免疫細(xì)胞無法通過并進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)中。而在PD中，血-腦屏障功能受損，T淋巴細(xì)胞可在趨化因子作用下通過受損的血-腦屏障，進(jìn)入CNS發(fā)揮免疫應(yīng)答作用[2]。有研究[9]報道，Th17在CD4+T細(xì)胞參與的PD免疫炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，可通過釋放IL-17，激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1等炎性因子，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元受損，進(jìn)而引起PD癥狀。MDSC是一群重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，在許多病理條件下被認(rèn)為是免疫網(wǎng)絡(luò)中干擾T細(xì)胞應(yīng)答的重要組成部分[10]。

在人體中，初始CD4+T細(xì)胞的分化可能會受CD14+HLA-DR+單核細(xì)胞和CD14+HLA-DR-MDSC的影響，前者可誘導(dǎo)Th17的分化，通過釋放炎性因子促進(jìn)免疫炎性反應(yīng)，后者可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增，并通過IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β的釋放抑制Th17介導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元免疫損傷，進(jìn)而對免疫炎性反應(yīng)負(fù)調(diào)控[11]。有研究[12]表明，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的病理過程中，MDSC自身亦可通過產(chǎn)生精氨酸酶-1來促使Th17擴(kuò)增。這提示在不同環(huán)境下，MDSC可通過對Th17及相關(guān)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，影響機(jī)體免疫炎性反應(yīng)[11]。本研究通過MPTP建立PD模型，行為學(xué)試驗(yàn)和小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞檢測對PD小鼠進(jìn)行驗(yàn)證，檢測小鼠脾懸液中Th17和MDSC細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，初步探究Th17與MDSC在PD進(jìn)程中的機(jī)制。結(jié)果顯示，Th17細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和MDSC細(xì)胞百分?jǐn)?shù)在PD中有不同程度的升高，在吉西他濱對MDSC進(jìn)行干預(yù)后，Th17細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)一步升高，提示在MPTP建立的PD模型中，二者共同參與了PD的發(fā)生發(fā)展，且在PD免疫炎性反應(yīng)進(jìn)程中，MDSC可能發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用抑制Th17擴(kuò)增。但Th17與MDSC在PD中如何相互影響，對二者免疫炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。同時限于本研究樣本數(shù)量少，尚未證明PD中MDSC與Th17之間的相關(guān)性。本研究通過初步探討Th17和MDSC在PD中的可能作用，拓寬了PD機(jī)制研究的視野，為延緩PD進(jìn)程及治療提供了新的研究方向和依據(jù)。

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ChangesandtheirsignificancesofthenumbersofThelper17cellsandMyeloid-derivedsuppressorcellsinthespleensuspensionofmodelmousewithParkinson’sdisease

CHENSi-yuan,SHUYang,ZHAOFeng,etal.

DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,China

ObjectiveTo observe the changes and their significances of the numbers of T helper 17 cells (Th17) and Myeloid-derived suppressor cells (MDSC) in the spleen suspension of model mouse with Parkinson’s disease (PD).MethodsForty C57BL/6 mouse were randomly divided into PD group (A group), PD+Gemcitabine group (B group), Gemcitabine group (C group) and control group (D group), with 10 mouse in each group. Mouse in group A and B were injected intraperitoneally with 1-Methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine (MPTP) (30 mg/kg) for 7 d continuously. Mouse in group B and C were injected intraperitoneally with Gemcitabine (120 mg/kg) at 1 d and 7 d. After behavioral experiment at 8 d, the number of tyrosine hydroxylase (TH) positive cells in the substantia nigra and the cell percentage of Th17 and MDSC in the spleen suspension of mouse in each group were detected.ResultsCompared with before modeling, the turning around time and pole climbing time of mouse in A group and B group after modeling were significantly longer, while the suspension time was significantly shortened (allP<0.05). Compared with C group and D group, the turning around time and pole climbing time of mouse in A group and B group after modeling were significantly longer, while the suspension time was significantly shortened (allP<0.05). Compared with C group and D group, the numbers of TH positive cells in substantia nigra of mouse in A group and B group were significantly reduced (allP<0.05). Compared with C group and D group, the cell percentages of Th17 and MDSC in the spleen suspension of mouse in A group and B group were significantly increased (allP<0.05). The cell percentage of Th17 in the spleen suspension of mouse in B group was significantly higher than A group (P<0.05), while the cell percentage of MDSC in the spleen suspension of mouse in A group was significantly higher than B group (P<0.05). Pearson correlation analysis results showed that there was no correlation between the cell percentages of Th17 and MDSC in A group and B group (r=-0.319,r=0.04, allP>0.05).ConclusionsTh17 and MDSC are increased in PD model mice. They may be involved in the occurrence and development of PD. MDSC maybe plays an immune role in inhibition of Th17 amplification.

Parkinson’s disease; T helper 17 cells; Myeloid-derived suppressor cells; 1-Methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine; Gemcitabine

R742.5

A

1004-1648(2017)05-0369-04

江蘇省自然科學(xué)基金(BK20160548)；江蘇省“333工程”科研項目(BRA2014173)；江蘇省“六大人才高峰”科研項目(WSN038)；鎮(zhèn)江市重點(diǎn)研發(fā)計劃(SH2016032)；鎮(zhèn)江市社會發(fā)展科技計劃項目(SH2015047)

212001 鎮(zhèn)江，江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科[陳思遠(yuǎn)(在讀碩士研究生)，趙峰，于明]，中心實(shí)驗(yàn)室(舒揚(yáng))

于明

2017-02-03

2017-04-20)