益腎解毒方對肺腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠JNK/Bcl-2信號傳導(dǎo)通路的影響

孫凱 張平 李永秀 胡佩巖 陳冠敏

·論著·

益腎解毒方對肺腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠JNK/Bcl-2信號傳導(dǎo)通路的影響

孫凱 張平 李永秀 胡佩巖 陳冠敏

目的探討益腎解毒方對肺腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠JNK/Bcl-2信號傳導(dǎo)通路的影響。方法本研究在前期成功建立的裸鼠肺腺癌轉(zhuǎn)移模型的基礎(chǔ)上，運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色法檢測各組JNK、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)，圖像分析使用MIA 4.0圖像分析軟件，觀察和測量顯微鏡400倍視野下表達(dá)的陽性物質(zhì)的光密度值。結(jié)果模型組與益腎解毒方高劑量組JNK蛋白的表達(dá)最低，兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；帕米磷酸二鈉組JNK蛋白的表達(dá)最高，低劑量組、中劑量組及中+西藥組次之，與模型組和高劑量組相比都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；模型組Bcl-2蛋白的表達(dá)最高，其次是益腎解毒方高劑量組、中劑量組、帕米磷酸二鈉組，Bcl-2蛋白表達(dá)最低的是低劑量組與中+西藥組，與模型組比較得出，各實(shí)驗(yàn)組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組Bax蛋白表達(dá)最低，與其他實(shí)驗(yàn)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中+西藥組Bax蛋白表達(dá)最高，其次是帕米磷酸二鈉組、低劑量組、高劑量組、中劑量組；益腎解毒方高劑量組與中劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；益腎解毒方低劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)最高，其次是中劑量組、中+西藥組、帕米磷酸二鈉組，益腎解毒方高劑量組和模型組Caspase-3蛋白表達(dá)最低；與模型組相比，除高劑量組外其余各實(shí)驗(yàn)組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論肺腺癌骨轉(zhuǎn)移與JNK/Bcl-2信號傳導(dǎo)通路密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明益腎解毒方對該信號通路上的關(guān)鍵分子JNK、Bcl-2、Bax 及Caspase-3蛋白有明顯的調(diào)控作用，證實(shí)了這可能是其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為中醫(yī)藥臨床有效防治惡性腫瘤提供了一定的理論依據(jù)。

益腎解毒方； c-Jun氨基末端激酶； B淋巴細(xì)胞瘤-2； B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)的X蛋白； 天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3； 肺腺癌骨轉(zhuǎn)移

肺癌是威脅人類生命健康的重大疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均居首位[1]。骨相關(guān)組織是癌癥發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的好發(fā)部位，是肺癌主要的血行轉(zhuǎn)移部位之一[2]，肺癌骨轉(zhuǎn)移可引起病理性骨折、局部功能受限等一系列與骨相關(guān)的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生存時間和生活質(zhì)量[3]。JNK信號通路是MAPK (mitogen activatedprotein kinase)一條經(jīng)典的信號通路，JNK/Bcl-2信號傳導(dǎo)通路與腫瘤細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，在腫瘤的研究當(dāng)中具有舉足輕重的地位。有研究表明，JNK通過誘導(dǎo)Bcl-2磷酸化，激活Caspase-3蛋白，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax二者的相互拮抗作用共同決定腫瘤細(xì)胞的歸宿，Caspase-3蛋白作為執(zhí)行分子，在調(diào)控細(xì)胞凋亡的過程中同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4-7]。本實(shí)驗(yàn)采用的益腎解毒方為中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院樸炳奎教授臨床經(jīng)驗(yàn)方，課題組在前期研究中證明其具有較好的臨床療效[8]。肺癌溶骨性骨轉(zhuǎn)移的中醫(yī)病機(jī)為肺腎虧虛、邪毒壅滯不通，治療以益氣補(bǔ)腎、通絡(luò)散結(jié)、活血解毒為主。本實(shí)驗(yàn)在前期基礎(chǔ)上，觀察益腎解毒方對凋亡相關(guān)蛋白JNK、Bcl-2、Bax及Caspase-3調(diào)控的作用，進(jìn)一步探討其在促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)動物為8～10周齡雄性裸鼠共60只，體重每只為18～20 g，在上海市西浦爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司購買[SCXK(滬)2008-0043]。購回后在SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器

BX51顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；Ti-U(TE2000-S)型倒置顯微鏡(日本Nikon株式會社)；EG1150H包埋機(jī)(德國LEICA公司)；RM2235切片機(jī)(德國LEICA公司)；H I1 210 攤片機(jī)(德國LEICA公司)；不銹鋼高壓蒸汽鍋(北京中科試驗(yàn)儀器公司)；小型臺式離心機(jī)(鄭州儀器設(shè)備有限公司)等。

1.3試劑及藥品

1.3.1 試劑 乙醇(北京市化工廠，規(guī)格：500 mL，批號：20120507)；蘇木素染液(北京市世濟(jì)合力生物科技有限公司，規(guī)格：1.5 L，批號：20121203)；EDTA(北京市化工廠，規(guī)格：250 g，批號：20120418)；二抗(德國DAKO公司，規(guī)格：15 mL，批號：10063211)；DAB(德國DAKO公司，規(guī)格：5 mL，批號：00080066)；JNK抗體(北京博士德生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：0.1 mL，批號：A04297)；Bcl-2抗體(北京市博士德生物技術(shù)有限公司，規(guī)格:0.2 mL，批號:BM4985)；Bax抗體(北京博士德生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：0.2 mL，批號：BM3964)；Caspase-3抗體(北京博士德生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：0.2 mL，批號：BM3937)。

1.3.2 藥物 帕米磷酸二鈉(規(guī)格：5 mL：15 g, 浙江奧托康制藥集團(tuán)生產(chǎn)，批號：120106)；中藥“益腎解毒方”：主要由熟地黃20 g、懷山藥15 g、茯苓10 g、山茱萸15 g、骨碎補(bǔ)10 g、牡丹皮10 g、白僵蠶10 g、澤瀉10 g、白花蛇舌草10 g、半枝蓮10 g組成。

由中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院中藥煎藥室負(fù)責(zé)藥物煎煮、濃縮、過濾等，按濃度差異制成高、中、低劑量實(shí)驗(yàn)組。制備每克浸膏劑折合成生藥量為3.4 g，保留于4℃冰箱中備用。

1.4分組及給藥

將裸鼠按照隨機(jī)分組原則隨機(jī)分為6組，每組6只，按不同分組進(jìn)行藥物干預(yù)。給藥濃度按照臨床實(shí)際用藥劑量，即成人每日服1劑算，并根據(jù)人與小鼠體表面積進(jìn)行換算，給藥劑量如下：模型組：生理鹽水0.5 mL，2次/周×5周，皮下注射；同時1 mL，1次/日×5周，灌胃；低劑量組：益腎解毒中藥浸膏劑混懸液3 g/kg，1次/日×5周，灌胃；中劑量組：益腎解毒中藥浸膏劑混懸液12 g/kg，1次/日×5周，灌胃；高劑量組：益腎解毒中藥浸膏劑混懸液24 g/kg，1次/日×5周，灌胃；西藥組：帕米磷酸二鈉4.5 mg/kg，2次/周×5周，皮下注射給藥；中+西藥組：益腎解毒中藥浸膏劑混懸液3 g/kg，1次/日×5周，灌胃；同時帕米磷酸二鈉4.5 mg/kg，2次/周×5周，皮下注射給藥。

1.5免疫組織化學(xué)染色

將裸鼠脫頸處死，分別取每只裸鼠的椎骨、鄂骨、胸骨、肩胛骨(左右)、肱骨(左右)、股骨(左右)共9個部位的組織，乙二胺四乙酸進(jìn)行脫鈣，脫鈣總時長約為45日，濃度為10%每3天換一次，pH值7.0～7.4之間，然后進(jìn)行取材、脫水、包埋、切片及組織染色，石蠟切片厚度為3 μm?？酒瑴囟?2℃，30分鐘；在顯微鏡下分別觀察各實(shí)驗(yàn)組裸鼠骨轉(zhuǎn)移癌及周圍骨組織Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)，運(yùn)用MIA 4.0圖像分析軟件，觀察和測量顯微鏡400倍視野下切片表達(dá)的陽性物質(zhì)的光密度值。

免疫組織化學(xué)染色步驟：按照免疫組化染色方法，脫蠟放入蒸餾水中，用PBS洗2～3次各5分鐘后進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS洗2～3次，每次各5分鐘，3%過氧化氫孵育10分鐘，PBS再沖洗2～3次，每次5分鐘，加入一抗(1:200稀釋)，在一抗作用下37℃ 2小時取出，PBS洗3次，每次各5分鐘，滴加二抗，在二抗作用下37℃ 1小時取出，PBS洗3次，每次各5分鐘，DAB顯色5分鐘，PBS沖洗，運(yùn)用哈瑞蘇木素復(fù)染色，分色，返藍(lán)，脫水，最后封片，鏡檢。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1益腎解毒方對Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

模型組Bcl-2蛋白的表達(dá)最高，與模型組比較，各實(shí)驗(yàn)組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低劑量、中+西藥組、帕米磷酸二鈉組三者間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果表明中藥益腎解毒方和帕米磷酸二鈉能夠顯著降低Bcl-2蛋白的表達(dá)。見圖1、表1。

模型組Bax蛋白表達(dá)最低，與其他實(shí)驗(yàn)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中+西藥組Bax蛋白表達(dá)最高，其次是帕米磷酸二鈉組、低劑量組、高劑量組、中劑量組；益腎解毒方高劑量組與中劑量組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；結(jié)果表明益腎解毒方與帕米磷酸二鈉能促進(jìn)Bax蛋白的表達(dá)。見圖2、表1。

2.2益腎解毒方對JNK、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

帕米磷酸二鈉組JNK蛋白的表達(dá)最高，益腎解毒方低劑量組、中劑量組及中+西藥組次之，與模型組和益腎解毒方高劑量組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 表明益腎解毒方與帕米磷酸二鈉能夠增強(qiáng)JNK蛋白的表達(dá)。見圖3、表2。

益腎解毒方低劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)最高，其次是中劑量組、中+西藥組、帕米磷酸二鈉組，益腎解毒方高劑量組和模型組Caspase-3蛋白表達(dá)最低；與模型組相比，益腎解毒方低劑量組、中劑量組、帕米磷酸二鈉組及中+西藥組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，但是高劑量組與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；結(jié)果表明，益腎解毒方與帕米磷酸二鈉能夠促進(jìn)Caspase-3蛋白的表達(dá)。見圖4、表2。

表1 益腎解毒方對Bcl-2 及Bax蛋白表達(dá)的影響

注： 與模型組比較，aP<0.05。

圖1 益腎解毒方對Bcl-2蛋白表達(dá)的影響(IHC ×400)

圖2 益腎解毒方對Bax蛋白表達(dá)的影響(IHC ×400)

圖3 益腎解毒方對JNK蛋白表達(dá)的影響(IHC ×400)

圖4 益腎解毒方對Caspase-3蛋白表達(dá)的影響(IHC ×400)

組別/蛋白nJNK蛋白OD值Caspase-3蛋白OD值模型組612.7040±2.922312.8767±2.5632帕米磷酸二鈉組656.1708±13.5775a29.5660±6.6281a益腎解毒方高劑量組610.4420±5.817614.4222±3.4353益腎解毒方中劑量組640.0200±6.6574a39.1989±7.8919a益腎解毒方低劑量組640.5244±5.8562a40.8956±5.4865a中+西藥組639.8956±4.8245a38.1256±6.5246a

注： 與模型組比較，aP<0.05。

3 討論

腫瘤是機(jī)體在各類致瘤因素的作用下，局部組織細(xì)胞基因調(diào)控處于異常狀態(tài)，細(xì)胞異常增生或凋亡不足導(dǎo)致的。在腫瘤發(fā)生演變過程中，JNK/Bcl-2信號傳導(dǎo)通路扮演著非常重要的角色，JNK參與調(diào)控細(xì)胞的增殖分化、凋亡等多種反應(yīng)，JNK磷酸化后可以調(diào)節(jié)線粒體外膜促凋亡基因和抑凋亡基因的磷酸化水平，使抑凋亡基因Bcl- 2(B cell lymphoma/leukmia- 2)的表達(dá)下調(diào)或促凋亡基因Bax蛋白(B cell lymphoma/leukmia- 2 associated X protein)表達(dá)上調(diào)[9-10]。Bcl- 2是從淋巴瘤中最早被發(fā)現(xiàn)且被證明具有抑制凋亡作用的基因，Bcl-2的過表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與增殖失去平衡，阻止細(xì)胞色素C從線粒體向胞質(zhì)內(nèi)釋放，抑制caspase蛋白的活化途徑和降解。Bax是一種與Bcl-2共沉淀的蛋白質(zhì)，它自身并不能阻止凋亡發(fā)生，而是具有拮抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的功能。提高Bcl-2表達(dá)水平或降低Bax的表達(dá)水平能抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，因此，Bcl-2/Bax表達(dá)的比率決定著細(xì)胞的“命運(yùn)”[11-15]。研究表明，Bcl-2與下游Caspase-3蛋白在凋亡過程中關(guān)聯(lián)密切，Caspase-3被活化后通過降解細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的底物形成凋亡小體而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，是細(xì)胞凋亡過程中蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵步驟和最終執(zhí)行分子[8,16-17]。因此，深入研究JNK /Bcl-2信號通路中的關(guān)鍵蛋白JNK、Bcl -2、Bax、Caspase-3蛋白之間的相互作用及中藥復(fù)方對其調(diào)控作用，對于進(jìn)一步提高腫瘤治療效果具有非常重要的價值。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生發(fā)展由“虛、毒、痰、瘀”所致，正氣虧損，邪氣乘虛而入，痰、毒、瘀凝結(jié)在臟腑、經(jīng)脈而使人體陰陽氣血失調(diào)，經(jīng)絡(luò)痹阻，日久而形成腫瘤。著名中西醫(yī)結(jié)合腫瘤專家樸炳奎教授總結(jié)臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為“正氣內(nèi)虛”是癌癥發(fā)病的基礎(chǔ)，腫瘤之“虛”與人體自身細(xì)胞免疫等調(diào)節(jié)的失衡有著密切的聯(lián)系[18]。本實(shí)驗(yàn)在前期裸鼠肺腺癌骨轉(zhuǎn)移模型研究的基礎(chǔ)上，從微觀進(jìn)一步證實(shí)了中藥“益腎解毒方”能夠有效調(diào)控JNK/Bcl-2信號通路，增強(qiáng)上游調(diào)控分子JNK的表達(dá)，下調(diào)抑凋亡基因 Bcl-2的表達(dá)，提高促凋亡基因Bax和下游Caspase-3蛋白的表達(dá)，產(chǎn)生一系列的級聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而在細(xì)胞凋亡層面促進(jìn)癌細(xì)胞的死亡。沈宏偉等[19]研究表明在膀胱癌的發(fā)生和細(xì)胞凋亡的調(diào)控方面降低Bcl-2蛋白的表達(dá)與增強(qiáng)Caspase-3蛋白的表達(dá)可能發(fā)揮著重要作用。李敬瑜等[20]通過實(shí)驗(yàn)證明健脾解毒中藥方能夠下調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá)和上調(diào)Bax mRNA的表達(dá)，通過Bax和Bcl-2途徑促進(jìn)腸癌細(xì)胞的凋亡，這與課題組的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果具有一致性。

綜上所述，本研究通過觀察中藥益腎解毒方對JNK /Bcl-2信號通路上關(guān)鍵分子JNK、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的調(diào)控作用，證實(shí)了這可能是其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，提示我們干預(yù)其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑或許可以成為減輕肺腺癌骨轉(zhuǎn)移骨質(zhì)破壞發(fā)生的有效手段之一，但尚缺乏大樣本、多中心的臨床研究及深層次的實(shí)驗(yàn)理論研究，且中藥復(fù)方有效成分整體作用于生物體系的機(jī)制更為復(fù)雜，仍需要不斷努力探索和深入研究。

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EffectsofYishenJiedudecoctiononJNK/Bcl-2signalingpathwayinnudemicewithbonemetastasisoflungadenocarcinoma

SUNKai，ZHANGPing，LIYongxiu，etal.Departmentofpathology，WangjingHospitalofChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100102，China

Correspondingauthor:ZHANGPing，E-mail：pinglele@sina.com

ObjectiveTo investigate the effects ofYishenJiedudecoction on JNK / Bcl-2 signal transduction pathway in nude mice with bone metastasis of lung adenocarcinoma.MethodsThe expression of JNK, Bcl-2, Bax and Caspase-3 protein in each group was detected by immunohistochemical staining on the basis of the established model of lung adenocarcinoma in nude mice. The image analysis was performed by MIA 4.0 Software to observe and measure the optical density of the positive substance expressed in the 400-fold field of view of the microscope.ResultsThe expression of JNK protein in model group andYishenJieduhigh group was the lowest, and there was no significant difference between them (P>0.05). The expression of JNK protein was the highest in Pamidium phosphate disodium group，the expression of JNK protein in low dose group, middle dose group and Chinese medicine + western medicine group was next, and compared with model group and high dose group, there was significant difference(P<0.05). The expression of Bcl-2 protein in the model group was the highest, the high dose group，the middle dose group and Pamidium phosphate disodium group was followed, the low dose group and the Chinese medicine + western medicine group was the lowest. The expression of Bcl-2 protein in each experimental group was significantly lower than that in the model group (P<0.05). The expression of Bax protein was the lowest in the model group, and the difference was statistically significant compared with other experimental groups (P<0.05). The expression of Bax protein was the highest in the Chinese medicine + western medicine group, the disodium group of pamidronate, low dose group, high dose group, middle dose group was followed. There was no significant difference between the high dose group and the middle dose group(P>0.05). The expression of Caspase-3 protein was the highest in the low dose group, the middle dose group, the Chinese medicine + western medicine group, the pamidium phosphate disodium group was followed. The expression of Caspase-3 protein was the lowest in the high dose group and the model group. Compared with the model group, there were significant differences between the other experimental groups except the high dose group (P<0.05).ConclusionBone metastasis of lung adenocarcinoma is closely related to JNK / Bcl-2 signaling pathway. The results of this study show thatYishenJiedudecoction can regulate JNK, Bcl-2, Bax and Caspase-3 proteins in this signal pathway, which may be a key step in promoting tumor cell apoptosis and provides a theoretical basis for the effective prevention and treatment of malignant tumors.

YishenJiedudecoction; JNK； Bcl-2； Bax； Caspase-3； Lung adenocarcinoma bone metastasis

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.11.010

2017-02-07)

(本文編輯：董歷華)

中國中醫(yī)科學(xué)院中央級公益性科研院所科研基本業(yè)務(wù)費(fèi)自主選題(ZZ070805)

100102 北京，中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院病理科[孫凱(碩士研究生)、張平、李永秀(碩士研究生)、陳冠敏(碩士研究生)]，關(guān)節(jié)科(胡佩巖)

孫凱(1991- )，2015級在讀碩士研究生。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合腫瘤的診斷與治療研究。E-mail：1163262599@qq.com

張平(1973- )，女，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治腫瘤疾病的臨床和基礎(chǔ)研究。E-mail：pinglele@sina.com