雙酶分步酶解谷朊粉制備短肽的研究

盛曉靜 王 強(qiáng) 劉 麗 石愛民 胡 暉 楊 穎 劉紅芝

(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗室；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)

雙酶分步酶解谷朊粉制備短肽的研究

盛曉靜 王 強(qiáng) 劉 麗 石愛民 胡 暉 楊 穎 劉紅芝

(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗室；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)

本文通過比較酶種類、加酶量、底物濃度、酶解溫度、酶解時間對短肽得率和水解度的影響，采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化分步酶解制備谷朊粉短肽的最佳工藝。在復(fù)合蛋白酶(Protamex)水解谷朊粉91.50 min后加入中性蛋白酶(Neutrase)繼續(xù)酶解121.50 min，Protamex添加量為 665.00 U/g底物，Neutrase添加量為5 290.00 U/g底物，水解溫度 50℃，質(zhì)量濃度 12%，在此條件下，短肽得率為 69.88%，水解度25.74%。經(jīng)高效液相色譜測定，分子質(zhì)量小于1 000 Da的水解產(chǎn)物占100%。采用Protamex與Neutrase分步酶解谷朊粉制備谷朊粉短肽，與現(xiàn)有制備谷朊粉短肽方法相比，避免了后續(xù)脫鹽步驟，簡化工藝，且具有制備條件溫和，TCA-NSI和DH高，純度高，分子量集中分布于 1 000 Da以下等特點(diǎn)。

谷朊粉短肽 復(fù)合蛋白酶 中性蛋白酶 分步酶解

谷朊粉又名小麥面筋蛋白，谷朊粉中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在80%[1]以上，其氨基酸組成較齊全，是營養(yǎng)豐富、物美價廉的植物蛋白；我國谷朊粉年產(chǎn)量高達(dá)10萬噸[2]，加工產(chǎn)物附加值低，為提高谷朊粉資源利用率與企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益，有必要對其開發(fā)利用進(jìn)行更深入的研究。

研究發(fā)現(xiàn)植物蛋白酶解物及其生物活性肽類物質(zhì)，不僅能作為氨基酸供體，在體內(nèi)具有優(yōu)良的消化吸收性能，是一類生理調(diào)節(jié)劑，在體內(nèi)參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、降血壓、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、抗血栓等[3-5]，谷朊粉短肽也具抗炎、降血壓、治療腹瀉等生理功能[6-8]。

已報道的酶法制備谷朊粉短肽研究中，李清麗等[9]采用胰蛋白酶與復(fù)合蛋白酶復(fù)合酶解，雙酶復(fù)合酶解耗時12 h，水解度為23.26%；劉樹興等[10]采用超聲輔助堿性蛋白酶酶解谷朊粉制備ACE抑制短肽，水解度為14.64%，但采用堿性蛋白酶酶解需通過分離純化技術(shù)提高谷朊粉短肽純度，該方法后續(xù)處理多且對環(huán)境造成一定程度的污染。目前選用蛋白酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶[11-12]等)作為工具酶，耗時長，水解效果較差，短肽含量低，為獲得高純度、低分子量的短肽，保證產(chǎn)品功能特性，使谷朊粉短肽制備成本增加。因此如何簡化工藝的同時獲得高水解度、高得率、低分子質(zhì)量的谷朊粉短肽成為生產(chǎn)工藝中需要解決的技術(shù)難題。

本研究以谷朊粉為原料，通過一系列單一酶和復(fù)合酶的效果對比，選出最佳效果酶；通過考察酶用量、底物濃度、酶解溫度、時間對水解度和短肽得率的影響，采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化分步酶解制備谷朊粉短肽最佳工藝，以期獲得高水解度、高短肽得率、低分子質(zhì)量谷朊粉短肽，同時避免后續(xù)脫鹽步驟，簡化工藝，為谷朊粉短肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

谷朊粉：鄭州食全食美商貿(mào)有限公司；木瓜蛋白酶(Papain)：南寧厐博生物工程有限公司；水解蛋白酶(Alcalase)、風(fēng)味蛋白酶(Flavorzyme)、復(fù)合蛋白酶(Protamex)、中性蛋白酶(Neutrase)：丹麥諾維信公司；福林-酚試劑、標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白(MW)：Sigma公司；三氟乙酸(TFA，色譜純)：Fluka公司；乙腈(色譜純)，德國Merk公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要設(shè)備

UV-1201紫外分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；KIELETEC ANALYSISER全自動凱氏定氮儀：瑞典 Foss 公司；Mini Spray Dryer B-290 噴霧干燥器：瑞士步琦Buchi公司；Waters 600高效液相色譜儀：Waters 公司；TSKgel2000 SWXL色譜柱：Tosho公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 谷朊粉理化指標(biāo)測定

水分測定：GB/T 5009.3-2010；蛋白質(zhì)測定：GB/T 5009.5-2010；

脂肪測定：GB/T 5009.6-2003；灰分測定：GB/T 5009.4-2010。

1.3.2 可溶性氮的測定

Folin-酚法[13]

1.3.3 短肽得率測定

三氯乙酸(TCA)可溶性氮法[14]，短肽得率按下式計算：

(1)

式中：TCA-NSI 為三氯乙酸可溶性氮得率(%)；N1為在 15%TCA 中的可溶性氮(mg)；N2為原料中的總氮(mg)。

1.3.4 水解度(DH)的測定

pH-Stat[15]法

(2)

式中：DH 為水解度/%；B 為堿液體積/mL；Nb為堿液當(dāng)量濃度/mol/L；α為α-氨基的解離度；MP 為底物中蛋白質(zhì)總量/g；htot為底物中蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)/mmol/g蛋白，對谷朊粉而言，htot=8.38(根據(jù)谷朊粉的氨基組成計算得到)。

1.3.5 短肽分子量分布測定

采用高效液相色譜(HPLC)測定酶解物的分子量分布，檢測條件為：

色譜柱：TSKgel2000 SWXL(300 mm×7.8 mm)；

流動相∶乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1；

流速：0.5 mL/min；

檢測波長：220 nm；

柱溫：30 ℃；

標(biāo)準(zhǔn)分子量分別為細(xì)胞色素C(MW 12 500)、抑肽酶(MW 6 511)、桿菌肽(MW 1 422)、乙氨酰胺-乙氨酰胺-精氨酸(MW 451)、谷胱甘肽(MW 189)。

1.3.6 蛋白酶活力的測定

改進(jìn)的Folin-酚法[16]

蛋白酶活力：酪蛋白底物在特定條件下經(jīng)酶水解，每分鐘產(chǎn)生1μg酪氨酸為1個活力單位，以U表示。

本試驗采用木瓜蛋白酶(Papain，5.00×105U/g)、風(fēng)味蛋白酶(Flavorzyme，2.00×104U/g)、復(fù)合蛋白酶(Protamex，1.20×105U/g)、中性蛋白酶(Neutrase，6.00×104U/g)、水解蛋白酶(Alcalase，3.1752×105U/g)為工具酶。

1.3.7 蛋白酶的篩選

分別對復(fù)合蛋白酶(Protamex)、中性蛋白酶(Neutrase)、風(fēng)味蛋白酶(Flavorzyme)、木瓜蛋白酶(Papain)、堿性蛋白酶(Alcalase)在其推薦最適條件下進(jìn)行單一酶解，除堿性蛋白酶外的4種酶兩兩復(fù)合酶解，分別測定酶解物的 TCA-NSI 和DH。

1.3.8 谷朊粉功能短肽的制備

將谷朊粉過100目篩后，配制一定濃度的谷朊粉溶液(邊攪拌邊加入一定量的水中，形成懸浮液)，在80 ℃預(yù)熱10 min，降至酶推薦最適溫度后，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值，并加入蛋白酶，一定溫度下反應(yīng)。反應(yīng)過程中不斷攪拌并加入1 mol/L NaOH以保證體系pH值恒定。酶解完成后，90 ℃水浴中加熱15 min滅酶，冷卻到室溫4 200 r/min離心10 min，上清液即為谷朊粉功能短肽溶液[17]。

表1 各種酶反應(yīng)溫度和pH

1.3.9 雙酶單因素酶解試驗

固定谷朊粉溶液濃度為 8%，其他因子基本條件為Protamex用量250 U/g底物，反應(yīng)溫度50 ℃，Protamex加入時間為Neutrase反應(yīng) 120 min 后，加入Protamex繼續(xù)反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，90 ℃水浴 15 min 滅酶，離心，取上清液1ml稀釋定容至100 mL，測TCA-NSI 和DH。改變其中 1 個條件，固定其他條件以考察酶用量、反應(yīng)溫度、酶解時間對TCA-NSI和DH的影響。各因子水平見表 2。

表2 雙酶單因素試驗各因子水平

1.3.10 雙酶多因素酶解試驗

根據(jù)單因子試驗結(jié)果，設(shè)定復(fù)合蛋白酶和中性蛋白酶分步水解。選取Protamex加酶量(A)、Neutrase加酶量(B)、Protamex酶解時間(C)、Neutrase酶解時間(D)為影響因子，以短肽得率TCA-NSI(Y1)、水解度DH(Y2)為響應(yīng)值，設(shè)計二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(表3)。

表3 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗因素水平表

1.3.11 谷朊粉雙酶酶解工藝路線

谷朊粉加水→80 ℃前處理(10 min)→冷卻至50 ℃→加入Protamex→恒溫(50 ℃)酶解(90 min)→加入Neutrase→恒溫(50 ℃)酶解(120 min)→90 ℃滅酶(10 min)→離心(4 200 r/min，10 min)→上清液噴霧干燥→谷朊粉短肽。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗均重復(fù)3次，平行3次；試驗數(shù)據(jù)采用 t 檢驗方法，P≤0.05 認(rèn)為結(jié)果差異顯著，P≤0.01 認(rèn)為結(jié)果差異極顯著，數(shù)據(jù)處理采用design expert軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶的篩選

通過17種蛋白酶的對比，可以看出，Alcalase是酶解效果最好的酶，但Alcalase是堿性蛋白酶，制成的短肽需要脫鹽，從經(jīng)濟(jì)效益上講，該酶不適宜工業(yè)生產(chǎn)，則它不是最佳效果酶；那么Protamex和Neutrase的復(fù)合酶解，使TCA-NSI和DH兩者皆有一定程度的提高；同時，對比相同單一酶加入順序不同對酶解效果的影響，通過試驗結(jié)果可以看出復(fù)合酶加入順序與水解結(jié)果關(guān)系較大。篩選出最佳復(fù)合酶為：Protamex和Neutrase的組合，TCA-NSI和DH分別為67.89%和24.14%。

注：1 Al(堿性蛋白酶)，2 Ne(中性蛋白酶)，3 Fl(風(fēng)味蛋白酶)，4 Pr(復(fù)合蛋白酶)，5 Pa(木瓜蛋白酶)，6 Ne-Pr,7 Pr-Ne,8 Ne-Fl，9 Fl-Ne,10 Ne-pa,11 Pr-Pa,12 Fl-Pa,13 Pa-Ne,14 Pa-Pr,15 Pa-Fl,16 Pr-Fl,17 Fl-Pr。圖1 不同蛋白酶酶解谷朊粉對其TCA-NSI和DH的影響

2.2 單因素試驗

2.2.1 酶解時間對TCA-NSI和DH的影響

2.2.1.1 分步酶解Protamex所需最佳酶解時間

試驗考察了0～180 min內(nèi)Protamex不同酶解時間對體系TCA-NSI和DH的影響如圖2：

如圖可知：30～60 min時，TCA-NS和DH呈明顯上升趨勢。60～180 min酶解過程中，TCA-NS和DH緩慢上升，這是因為隨著酶解時間的延長，大分子蛋白在蛋白酶的作用下分解為小分子肽，酶切位點(diǎn)逐漸減少，蛋白酶活力也逐漸下降，致使 DH 和 TCA-NSI 的增長趨勢平緩；又考慮經(jīng)濟(jì)效益，單酶酶解時間不宜過長。因此Protamex的最佳酶解時間為90 min。

2.2.1.2 分步酶解Neutrase所需最佳酶解時間

試驗考察了0～150 min內(nèi)Neutrase不同酶解時間對體系TCA-NSI和DH的影響如圖2：

如圖所示：30～120 min內(nèi)TCA-NSI和DH隨時間的延長不斷升高，且在120 min后趨于穩(wěn)定。在酶解120 min時，TCA-NSI和DH分別達(dá)到65.94%和18.86%。這是因為隨著時間的延長，酶與物料的更加充分，酶切效應(yīng)更加明顯，使得TCA-NSI和DH增高；時間繼續(xù)延長，作用位點(diǎn)已充分反應(yīng)，蛋白酶活力下降；則Neutrase的最佳酶解時間為120 min。

2.2.2 底物濃度對TCA-NSI和DH的影響

在底物濃度分別為4%、6%、8%、10%、12%、14%的酶解條件下，探究底物濃度對TCA-NSI和DH的影響如圖2：

如圖所示：在4%～12%范圍內(nèi)隨底物濃度的增加而增加；在12% ～14%內(nèi)增加幅度較小基本趨于平緩；這是由于隨著底物濃度的增加，谷朊粉與溶劑接觸面的濃度差增大、酶切位點(diǎn)接觸較多，使得反應(yīng)速度加快，從而短肽得率上升、水解度增大；雖然低濃度時溶質(zhì)流動性好，但蛋白酶和作用底物的碰撞次數(shù)減少，酶解反應(yīng)受到抑制；而體系底物濃度過大會造成體系中有效水分濃度過低，因此底物和蛋白酶的擴(kuò)散和運(yùn)動速度減慢，從而對酶解產(chǎn)生抑制作用，且底物濃度過大，生產(chǎn)成本增加，不利于經(jīng)濟(jì)效益。故選擇12%為最佳底物濃度。

2.2.3 酶解溫度對TCA-NSI和DH的影響

在酶解溫度為30、35、40、45、50 ℃條件下，探究溫度對TCA-NSI和DH的影響如圖2：

如圖所示：在35～50 ℃間，隨著溫度的升高TCA-NSI和DH也隨之增大，且均在50 ℃時達(dá)到最高，并在50 ℃后有所下降。這是由于反應(yīng)溫度過低時，降低了體系內(nèi)分子運(yùn)動的激烈程度，從而降低了蛋白酶與底物的碰撞機(jī)率；而當(dāng)溫度過高時，會引起蛋白酶次級鍵的解離，使蛋白酶喪失或部分喪失催化活性，使得得率和水解度降低。因此，最佳酶解溫度為45 ℃。

2.2.4 加酶量對TCA-NSI和DH的影響

2.2.4.1 Protamex的量對TCA-NSI和DH的影響

Protamex加酶量分別為236、432、648、864、1 080 U/g時，對TCA-NSI和DH的影響如圖2所示。

隨著加酶量的增大，TCA-NSI和DH也隨之增大，在236～432 U/g范圍內(nèi)增加速度相對緩慢，在432～648 U/g之間酶解液的TCA-NSI和DH急劇增加，增高速率變快；在648 U/g后趨于平穩(wěn)無明顯上升趨勢，且在實(shí)際產(chǎn)業(yè)化中，加酶量過大，成本增大，不利于經(jīng)濟(jì)效益；故選擇Protamex為648 U/g的底物。

2.2.4.2 Neutrase的量對TCA-NSI和DH的影響

Neutrase加酶量分別為2 600、3 000、3 900、5 200、6 500 U/g時，對TCA-NSI和DH的影響如圖2所示。

基于Protamex的加酶量上，改變Neutrase的量，以期確定該復(fù)合酶的最適加酶量；可以看出在2 600～5 200 U/g范圍內(nèi)，隨著加酶量增大，酶的水解作用加強(qiáng)，反應(yīng)后TCA-NSI和DH上升，且在5 200 U/g處達(dá)到最高點(diǎn)；但在5 200 U/g后當(dāng)加酶量繼續(xù)增加，酶的抑制作用導(dǎo)致水解度和短肽得率均不同程度下降；故選擇Neutrase為5 200 U/g的底物。

2.3 雙酶多因子酶解試驗結(jié)果

二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗結(jié)果及回歸分析見表4和表 5。

圖2 不同處理對蛋白質(zhì)TCA-NSI和DH的影響

表4 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計試驗及結(jié)果

為考察各因子對水解度和短肽得率的影響，分別以水解度、短肽得率為指標(biāo)，對表4 試驗結(jié)果進(jìn)行分析，可分別得到3 因子與短肽得率(TCA-NSI)、水解度(DH)之間的回歸方程為：

TCA-NSI=68.51+1.51A+2.50B+3.32C+2.36D+1.07AB+2.24AC+0.72AD+1.42BC+1.00BD+1.34CD-3.98A2-2.64B2-3.31C2-2.37D2(3)

DH=25.13+0.55A+1.49B+1.35C+0.80D+0.042AB+0.69AC+0.73AD+0.53BC+0.31BD-0.035CD-1.65A2-1.52B2-1.31C2-0.92D2

(4)

對方程(3)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表 5。從表 5可以看出，回歸模型 Model(P<0.0001)達(dá)到極顯著水平，失擬性檢驗即P=0.051 5>0.05，誤差不顯著，說明試驗所選回歸模型可行。由方程(3)可知，酶解時間與加酶量對TCA-NSI有正影響。從表5中可得各因子對TCA-NSI影響大小依次為Protamex加酶量(C)、Neutrase酶解時間(B)、Neutrase加酶量(D)、Protamex酶解時間(A)，且Protamex酶解時間(A)與Protamex加酶量(C)、Neutrase酶解時間(B)與Neutrase加酶量(D)、Protamex加酶量(C)與Neutrase加酶量(D)間存在交互作用。剔除不顯著項后，建立得率對試驗各因子的回歸方程為：

TCA-NSI=68.51+1.51A+2.50B+3.32C+2.36D+2.24AC+1.42BC+1.34CD-3.98A2-2.64B2-3.31C2-2.37D2

(5)

表5 TCA-NSI方差分析表

注：*表示在α=0.05 水平上顯著；**表示在α=0.01 水平上顯著。

對方程(4)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表 6。從表 6可以看出，回歸模型 Model(P<0.0001)達(dá)到極顯著水平，失擬性檢驗P=0.081 3>0.05，誤差不顯著，說明試驗所選回歸模型可行。由方程(3)可知，酶解時間和加酶量對DH有正影響。從表6中可得各因子對DH影響大小依次為Neutrase酶解時間(B)、Protamex加酶量(C)、Neutrase加酶量(D)、Protamex酶解時間(A)，而且Protamex酶解時間(A)與Protamex加酶量(C)、Neutrase加酶量(D)間有顯著的交互作用。剔除不顯著項后，建立水解度對試驗各因子的回歸方程為

DH=25.13+0.55A+1.49B+1.35C+0.80D+0.69AC+0.73AD-1.65A2-1.52B2-1.31C2-0.92D2

(6)

表6 DH方差分析表

注：*表示在α=0.05 水平上顯著；**表示在α=0.01 水平上顯著。

由上可知，在適當(dāng)范圍內(nèi)調(diào)整酶解時間和加酶量之間的關(guān)系，可使酶解反應(yīng)的短肽得率和水解度達(dá)到較理想的水平。最佳條件為加入復(fù)合蛋白酶(Protamex)，加酶量為665.00 U/g，酶解時間91.50 min后加入中性蛋白酶(Neutrase)，加酶量為5 290.00 U/g，酶解時間為121.50 min。通過在TCA-NSI的最佳條件下進(jìn)行檢驗，其TCA-NSI為69.88%，其理論值為69.86%，兩者相對誤差為0.02%，在此條件下反應(yīng)體系的DH為25.74%。上述結(jié)果證明試驗優(yōu)化得到的水解條件是可行的。對比上述最優(yōu)工藝條件下實(shí)際水解度和短肽得率，經(jīng)綜合考慮確定最優(yōu)工藝為：在Protamex水解谷朊粉91.50 min后加入Neutrase繼續(xù)酶解121.50 min，Protamex添加量為665.00 U/g底物，Neutrase添加量為5 290.00 U/g底物，水解溫度 50 ℃，質(zhì)量濃度 12%，在此條件下，短肽得率為69.88%，水解度25.74%。

2.4 谷朊粉短肽的分子質(zhì)量分布

采用HPLC對谷朊粉短肽分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析，標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量出峰時間分別：細(xì)胞色素C(MW 12 500)：13.73 min、抑肽酶(MW 6 511)：15.73 min、桿菌肽(MW 1 422):17.88 min、乙氨酰胺-乙氨酰胺-精氨酸(MW 451)：21.12 min、谷胱甘肽(MW 189)：23.81 min。各標(biāo)樣相對分子質(zhì)量對數(shù)與各自的洗脫時間呈很好的相關(guān)性，由此可以準(zhǔn)確地推斷出谷朊粉短肽的分子質(zhì)量分布。圖3是谷朊粉短肽分子質(zhì)量分布HPLC圖譜。谷朊粉在2種酶的作用下水解程度較好，大分子蛋白被水解為分子質(zhì)量較小的片段，分子質(zhì)量小于1ku占100%。目前研究報道中蛋白質(zhì)經(jīng)水解后所得的短肽以完整的形式被人體吸收而進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)[18]，對機(jī)體的功能具有積極作用，具有更好的營養(yǎng)特性，近年來引起了食品學(xué)界的廣泛重視[19]。因此在本試驗中酶解制備得到的谷朊粉短肽可能具有特殊的生理功能，為谷朊粉短肽的產(chǎn)業(yè)化打下了良好的基礎(chǔ)。

圖3 短肽分子質(zhì)量分布的HPLC圖譜

3 結(jié)論

通過單因素試驗確定雙酶酶解谷朊粉的工藝條件為：在Protamex水解谷朊粉 1.50 h 后加入Neutrase繼續(xù)酶解 2.0 h，Protamex添加量為 648 U/g底物，Neutrase添加量為5 200 U/g底物，水解溫度50 ℃，底物濃度 12%；通過考察雙酶不同加酶量與酶解時間的影響，采用二次旋轉(zhuǎn)回歸Box-Benkeman的方法進(jìn)行優(yōu)化，確定雙酶分步酶解谷朊粉制備谷朊粉短肽的最佳工藝參數(shù)為：在Protamex水解谷朊粉91.50 min后加入Neutrase繼續(xù)酶解121.50 min，Protamex添加量為 665.00 U/g底物，Neutrase添加量為5 290.00 U/g底物，水解溫度 50 ℃，質(zhì)量濃度 12%，在此條件下，短肽得率為69.88%，水解度25.74%。

[1]王章存，原媛，王許東.谷朊粉酶解條件優(yōu)化及其抗氧化活性[J].中國糧油學(xué)報,2014,29(11):7-13

Wang zhangcun, Yuan yuan, Wang Xudong. Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Wheat Gluten and Antioxidant Activities of Its Hydrolysates[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2014, 29(11):7-13

[2]張強(qiáng)，丁偉，劉有根.從谷朊粉中制備抗氧化肽的研究[J]. 糧油加工, 2010 (5): 80-84

Zhang Qiang, Ding Wei, Liu Yougen. From the study of the preparation of antioxidant peptides of the gluten[J]. Cereals and Oils Processing, 2010 (5): 80-84

[3]Tsou M J, Lin W T, Lu H C, et al. The effect of limited hydrolysis with Neutrase and ultrafiltration on the anti-adipogenic activity of soy protein[J]. Process Biochemistry, 2010, 45(2): 217-222

[4]Moure A, Domínguez H, Parajó J C. Antioxidant properties of ultrafiltration-recovered soy protein fractions from industrial effluents and their hydrolysates[J]. Process Biochemistry, 2006, 41(2): 447-456

[5]黃薇, 宋永康, 余華. 酶法制備玉米抗氧化肽[J]. 中國食品學(xué)報, 2014 (8): 69-76

Wang Wei, Song Yongkang, Yu hua. Enzymatic Preparation of Corn Anti-oxidation Peptide[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2014 (8): 69-76

[6]吳爽, 朱科學(xué), 周惠明. 酶解谷朊粉的研究進(jìn)展[J]. 糧食與食品工業(yè), 2012, 19(2): 39-41

Wu Shuang, Zhu Kexue, Zhou Huiming. Research progress on the hydrolysis of wheat gluten[J]. Cereal & Food Industry, 2012, 19(2): 39-41

[7]Morón B, Cebolla, Manyani H, et al. Sensitive detection of cereal fractions that are toxic to celiac disease patients by using monoclonal antibodies to a main immunogenic wheat peptide[J]. The American journal of clinical nutrition, 2008, 87(2): 405-414

[8]D?rum S, Arntzen M ?, Qiao S W, et al. The preferred substrates for transglutaminase 2 in a complex wheat gluten digest are peptide fragments harboring celiac disease T-cell epitopes[J]. PLoS One, 2010, 5(11): e14056

[9]李清麗, 王衛(wèi)國. 雙酶復(fù)合水解谷朊粉制備小肽的工藝條件研究[J]. 飼料工業(yè), 2007, 28(11): 17-18

Li Qingli, Wang Weiguo. Double enzyme compound preparation of small peptides hydrolyzed wheat gluten process conditions[J]. China Feed Industry, 2007, 28(11): 17-18

[10]劉樹興, 石凱. 超聲輔助酶解谷朊粉制備 ACE 抑制肽工藝優(yōu)化[J]. 陜西科技大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2014, 32(6): 110-114

Liu Shuxing, Shi Kai. Wheat gluten of ACE inhibitory peptides preparation technology research[J]. Journal of Shaanxi University of Science & Technology, 2014, 32(6): 110-114

[11]Wang J, Zhao M, Zhao Q, et al. Antioxidant properties of papain hydrolysates of wheat gluten in different oxidation systems[J]. Food Chemistry, 2007, 101(4): 1658-1663

[12]Ney K H. Hydrolysis of deliberated proteins[J]. Journal of Food Science, 2002,24(3):87-89

[13]Owueu-ApentenRK. Food Protein Analysis. New York: Marcel Dekker, Inc, 2002

[14]Jang A, Lee M. Purification and identification of angiotens in converting enzyme inhibitory peptides from beef hydroly sates[J]. Meat Science, 2005, 69: 653-661

[15]袁斌, 呂桂善, 劉小玲. 蛋白質(zhì)水解度的簡易測定方法[J]. 廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué), 2002, 21(2): 113-115

Yuan Bin, Lu Guishan, Liu Xiaoling. The simple method of determining for the degree of hydrolysis of proteins[J]. Journal of Guangxi Agric. and Biol. Science, 2002, 21(2): 113-115

[16]Kamarudlin M S, Jones D A, Vay L L. Ontogenetic change in digestive enzyme activity during larval development of Macrobrachiumrosenberii. Aquaculture. 1994, 123: 320-324

[17]李寧, 劉紅芝, 王強(qiáng). 中性蛋白酶分步酶解花生分離蛋白制備花生短肽的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(24): 5237-5247

Li Ning, Liu Hongzhi, Wang Qiang. Preparation of Peanut Oligopeptides from Peanut Protein Isolated by Neutral Proteinase Stepping Hydrolysis[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(24): 5237-5247

[18]李昊劍, 楊良嶸, 魏雪團(tuán). 功能性短肽的分類及其酶解制備方法[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(17): 373-377

Li Haojian, Yang Liangrong, Weixuetuan. Classification of functional oligopeptides and preparation of enzymatic hydrolysis[J]. Science and Technology of Food Industry, 2012, 33(17): 373-377

[19]張宇昊, 王強(qiáng). 功能性短肽的研究進(jìn)展.中國油脂, 2007, 32(2): 69-73

ZhangYuhao, Wang Qiang. Research progress of functional oligopeptides[J]. China Oils and Fats, 2007, 32(2):69-73.

Analysis on Preparation of Wheat gluten Oligopeptides by Double Proteinase Stepping Hydrolysis

Sheng Xiaojing Wang Qiang Liu Li Shi Aimin Hu Hui Yang Ying Liu Hongzhi
(Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193)

The influence of enzyme kind, substrate concentration, enzymolysis temperature, enzymatic hydrolysis time on DH and TCA-NSI were compared and the best preparation technology was determined by quadratic regression orthogonal rotational combing design. The optimum process parameters for the preparation of wheat gluten oligopeptides from wheat gluten by neutral proteinase stepping hydrolysis was that neutrase hydrolyzed continually for 121.50 min after Protamex hydrolyzed wheat gluten 91.50 min, the volume of addition of Protamex was 665.00 U/g substrate and the volume of addition of neutrase was 5 290.00 U/g substrate, the enzymolysis temperature was 50 ℃, the substrate concentration was 12%. Under these conditions, the TCA-NSI was 69.88%, the DH was 25.74%. Hydrolysis products with the relative molecular mass less than 1 000 Da accounted for 100% by HPLC. Compared with other processes, the preparation of gluten oligopeptides by Protamex and Neutrase stepping hydrolysis had the characteristics of simplifying process, avoiding subsequent desalting, preparation moderate conditions, high TCA-NSI, DH and the molecular weight of peptides being mainly concentrated below 1 000 Da.

wheat gluten, oligopeptides, protamex, neutrase, stepping hydrolysis

TS201.2

A

1003-0174(2017)09-0139-08

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303071-04)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(CAAS-ASTIP-201X-IAPPST)

2016-06-12

盛曉靜，女，1991年出生，碩士，糧油副產(chǎn)物綜合利用

劉紅芝，女，1980年出生，研究員，糧油副產(chǎn)物綜合利用