綠豆皮黃酮的提取純化及其抗氧化研究

羅 磊 姬青華 焦昆鵬 朱文學(xué) 關(guān)寧寧 薛依涵(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院；河南省農(nóng)產(chǎn)品干燥裝備工程技術(shù)研究中心，洛陽 471023)

綠豆皮黃酮的提取純化及其抗氧化研究

羅 磊 姬青華 焦昆鵬 朱文學(xué) 關(guān)寧寧 薛依涵
(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院；河南省農(nóng)產(chǎn)品干燥裝備工程技術(shù)研究中心，洛陽 471023)

本研究對綠豆皮黃酮微波輔助提取、大孔吸附樹脂純化及其體外抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，當(dāng)綠豆皮黃酮的微波輔助提取條件為液料比35:1，微波時間80 s，微波功率540 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時，綠豆皮黃酮的提取量達(dá)到8.467 mg/g。15種樹脂的吸附和解吸動力學(xué)研究結(jié)果表明，NKA-9型大孔吸附樹脂對綠豆皮黃酮有較好的純化效果，純化后黃酮的純度由37.14%提高到71.08%，黃酮回收率可達(dá)82.8%?？寡趸钚栽囼灡砻?，綠豆皮黃酮清除超氧陰離子自由基的能力與作用時間成反比，與提取液質(zhì)量濃度成正比；綠豆皮黃酮對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和·OH自由基有較好的清除能力，經(jīng)NKA-9樹脂初步純化后，其抗氧化能力顯著提高。

綠豆皮 黃酮 提取 純化 抗氧化

綠豆(PhaseolusradiatusL.)為豆科草本植物綠豆的種子[1]。綠豆皮是綠豆經(jīng)泡發(fā)后的種皮，中醫(yī)稱為綠豆衣，其本身清熱的效果比綠豆更強(qiáng)，研究表明綠豆皮中含有豐富的黃酮類化合物、鞣質(zhì)、皂甙生物堿、強(qiáng)心甙、蒽醌類化合物等成分[2]，其中黃酮類化合物占50%左右。黃酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、清熱解毒、止瀉利尿、防治心血管疾病等保健功效[3-5]。綠豆皮占綠豆總質(zhì)量的7%～10%，綠豆芽在加工過程中，由于采用“去皮”或“去渣”等工序，將產(chǎn)生大量綠豆皮下腳料，而這些綠豆皮或被丟棄或作為廉價飼料，造成資源的極大浪費(fèi)。

近年來研究者對綠豆皮黃酮的提取進(jìn)行了初步研究，張燕等[6]采用水浴回流提取綠豆皮黃酮，120 min后提取量達(dá)到3.879 mg/g；朱文學(xué)等[7]對綠豆皮黃酮超聲水提工藝進(jìn)行研究，75 min后提取量可達(dá)10.18 mg/g。微波提取技術(shù)利用微波場的生物效應(yīng)，直接作用于提取物中的分子，會加速活性成分的溶出，溶劑用量少，節(jié)省時間，提取率高[8]；在我國，微波提取技術(shù)已經(jīng)用于上百種中草藥，例如，葛根、茶葉等；國外微波提取技術(shù)主要是通過設(shè)置微波條件使目標(biāo)物的純度得以提高，它廣泛應(yīng)用于食用油、香料等方面。大孔吸附樹脂具有選擇性好、吸附速度快、解吸容易、再生方便的特點(diǎn)[9-10]，適于黃酮類物質(zhì)的純化。

因此，本研究采用微波輔助提取綠豆皮黃酮，通過比較15種大孔吸附樹脂對綠豆皮黃酮的吸附和解吸性能，篩選出適合綠豆皮黃酮分離純化的大孔吸附樹脂，并對純化后的黃酮進(jìn)行體外抗氧化分析，對充分利用綠豆資源，實現(xiàn)綠豆皮的“變廢為寶”，開發(fā)具有高附加值和保健功效的綠豆產(chǎn)品具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆皮：采購于洛陽市新農(nóng)村蔬菜食品有限公司。于45 ℃恒溫干燥箱中干燥至質(zhì)量恒定，粉碎過80目篩后備用。

15種大孔吸附樹脂：HPD450型、S-8型、NKA-9型、D301型、AB-8型、X-5型、DM130型、HPD100型、HPD300型、NKA-2型、DM301型、D101型、AB-7型、D141型、ADS-17型，均購于滄州寶恩吸附材料科技有限公司。

試驗試劑：蘆丁(CAS號：153-18-4)：上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：上海伊卡生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、醋酸、醋酸鈉、三氯化鋁等均為國產(chǎn)分析純，購于洛陽奧科化玻公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HC-1000Y型高速粉碎機(jī)：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；WD900B型微波爐：順德市格蘭仕微波爐電器有限公司；UV2400紫外-可見分光光度計：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；湘儀TDZ5-WS型離心機(jī)：上海圣科儀器設(shè)備有限公司；THZ-82氣浴恒溫振蕩器：金壇市鴻科儀器廠；Re-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗內(nèi)容與方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用醋酸-醋酸鈉-三氯化鋁顯色法[11]，對樣品進(jìn)行全波長掃描，確定最大吸收峰在270 nm，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，得到線性回歸方程為：y=25.405x+0.128 5，其中x為黃酮質(zhì)量濃度/mg·mL-1，y為吸光度，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 3。

1.3.2 綠豆皮黃酮提取液的制備

一定量的綠豆皮粉末和乙醇溶液按一定液料比(mL/g)混合均勻后進(jìn)行微波提取，提取液4 800 r/min離心10 min，在40 ℃下旋蒸至無醇味，再加入4倍體積無水乙醇除去蛋白質(zhì)和多糖，經(jīng)過濾、離心、濃縮之后定容，于270 nm測吸光度。

1.3.3 綠豆皮黃酮含量的測定

吸取黃酮粗提液0.4 mL，以醋酸-醋酸鈉-三氯化鋁顯色法，在270 nm處測吸光度并利用回歸方程計算得到綠豆皮黃酮提取液中總黃酮的含量，計算公式如下：

(1)

式中：C為提取液黃酮的濃度/mg·mL-1；V為提取液體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；m為原料質(zhì)量/g。

1.3.4 微波提取的單因素試驗設(shè)計

在微波時間為80 s，微波功率為540 W，液料比為10:1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%的條件下，進(jìn)行單因素試驗。分別考察微波時間(60、80、100、120、140、160 s)，微波功率(180、360、540、720、900 W)，液料比(10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1 mL/g)，乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%、90%)對綠豆皮黃酮提取量的影響。

1.3.5 綠豆皮黃酮微波提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對微波時間(A)、微波功率(B)、液料比(C)和乙醇體積分?jǐn)?shù)(D)4個因素進(jìn)行L9(34)正交試驗設(shè)計，因素水平見表1。

表1 正交設(shè)計試驗因素水平表

1.3.6 大孔吸附樹脂的篩選

1.3.6.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]作適當(dāng)修改，即15種大孔樹脂各稱取一定量，用無水乙醇浸泡24 h后蒸餾水洗至無醇味，然后用4% HCl溶液浸泡5 h，蒸餾水洗至中性；再用4% NaOH溶液浸泡5 h，蒸餾水洗至中性，備用。

1.3.6.2評價指標(biāo)的測定[13]及吸附-解吸動力學(xué)[14]

分別稱取15種大孔樹脂各1.00 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，各加入30 mL質(zhì)量濃度為0.46 mg/mL的綠豆皮黃酮溶液，于恒溫振蕩器(25 ℃，120 r/min)振蕩吸附24 h，之后取出抽濾，測定濾液中黃酮含量。將充分吸附后的15種樹脂分別置于100 mL具塞錐形瓶中，各加入30 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，于恒溫振蕩器(25 ℃，120 r/min)振蕩解吸24 h，之后抽濾并測定濾液中黃酮含量。

選取上述15種型號樹脂中吸附和解吸效果最好的6種樹脂，按照上述操作，于恒溫振蕩器(25 ℃，120 r/min)振蕩吸附和解吸12 h，每隔一定時間吸取上清液測吸光度，計算吸附率和解吸率，繪制大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解吸曲線。按下列公式計算15種樹脂的吸附率和解吸率。

(2)

(3)

式中：A為吸附率/%；D為解吸率/%；C0為吸附前黃酮質(zhì)量濃度/mg·mL-1；C1為吸附后黃酮質(zhì)量濃度/mg·mL-1；C2為解吸后黃酮質(zhì)量濃度/mg·mL-1。

1.3.7 綠豆皮黃酮的純化

根據(jù)靜態(tài)吸附和解吸曲線篩選出最佳樹脂[15]。稱取該樹脂1.00 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入質(zhì)量濃度為C1的綠豆皮黃酮提取液V1，于恒溫振蕩器(25 ℃，120 r/min)振蕩吸附12 h，然后取出吸附后的樹脂，加入30 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液，于恒溫振蕩器(25 ℃，120 r/min)振蕩解吸12 h。所得解吸液于50 ℃減壓濃縮至無醇味，定容至一定體積V2，測定黃酮濃度C2。按下式計算其純度和回收率。

(4)

(5)

式中：P為黃酮的純度/%；Q為黃酮的回收率/%；C1為純化前黃酮質(zhì)量濃度/mg·mL-1；V1為純化前黃酮總體積/mL；C2為純化后黃酮質(zhì)量濃度/mg·mL-1；V2為純化后黃酮定容體積/mL；m為凍干后樣品質(zhì)量/mg。

1.3.8 綠豆皮黃酮抗氧化活性的研究

參照連苯三酚法[16]，配制純化前后不同濃度的綠豆皮黃酮提取液，按表2加樣，迅速搖勻后每隔30 s以10 mmol/L HCl溶液為參比液，于320 nm處測定相應(yīng)吸光度值，至3 min止，按下面公式計算清除率。

(6)表2 連苯三酚試驗加樣表

1.3.8.2 清除DPPH自由基

根據(jù)參考文獻(xiàn)[17-18]作部分修改，將不同質(zhì)量濃度的綠豆皮黃酮和VC陽性對照溶液各2 mL與2 mL DPPH(10-4mol/L，95%乙醇)溶液混勻后，避光反應(yīng)20 min，于波長517 nm處測定吸光度Ai；2 mL空白樣品(蒸餾水)與2 mL DPPH溶液混勻，避光反應(yīng)20 min后測定吸光值為Ac，將2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液和VC陽性對照溶液與2 mL 95%乙醇混勻后測定吸光度值為Aj，按下式計算DPPH自由基清除率。

(7)

1.3.8.3 清除·OH自由基

根據(jù)參考文獻(xiàn)[19]，采用水楊酸法對綠豆皮黃酮進(jìn)行·OH自由基清除試驗。

1.3.8.4 還原能力

根據(jù)參考文獻(xiàn)[20]，采用鐵氰化鉀還原法對綠豆皮黃酮進(jìn)行還原能力的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輔助提取綠豆皮黃酮研究

2.1.1 單因素試驗結(jié)果

由圖1可知，黃酮提取量隨微波時間的增加先上升后下降。當(dāng)微波時間為80 s時，黃酮提取量達(dá)到6.71 mg/g，80 s之后黃酮提取量緩慢下降。當(dāng)微波功率從180 W上升到540 W時，黃酮提取量從3.98 mg/g上升到6.96 mg/g，微波功率繼續(xù)上升時，黃酮提取量顯著下降。黃酮提取量隨液料比的增加先增加后減少，當(dāng)液料比在10:1～30:1時，黃酮提取量逐漸增加，當(dāng)液料比在30:1時，黃酮提取量達(dá)到最大7.49 mg/g，當(dāng)液料比高于30:1時，黃酮提取量逐漸下降。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～70%時，黃酮提取量逐漸增加，當(dāng)?shù)竭_(dá)70%時，提取量最高，為5.21 mg/mL，當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)大于70%時，黃酮提取量呈下降趨勢。綜上所述，選擇微波時間80 s，微波功率為540 W，液料比為30:1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖1 四因素對綠豆皮黃酮提取量的影響

2.1.2 正交試驗結(jié)果分析

以綠豆皮黃酮提取量為評價指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗。結(jié)果與分析見表3，其方差分析見表4。

試驗數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，并采用Duncan新復(fù)極差法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗[21]。由表3可知，影響黃酮提取量的因素大小依次為液料比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>微波時間>微波功率。較優(yōu)組合：微波時間80 s，微波功率540 W，液料比35:1，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，此時黃酮提取量最高，但是最優(yōu)搭配A2B2C3D2在正交試驗中未出現(xiàn)，因此進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果見表5，由表可知，在最優(yōu)搭配條件下，綠豆皮黃酮的提取量達(dá)到8.467 mg/g，高于正交表中其他組合的提取量，由此證明正交試驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

由方差分析表可知，微波功率、微波時間、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)在α=0.01下對綠豆皮黃酮提取量影響極其顯著。

表3 正交試驗極差分析表

表4 正交試驗方差分析表

注：F0.01(2，9)=8.0，F(xiàn)0.05(2，9)=4.26。

表5 驗證試驗結(jié)果

2.2 綠豆皮黃酮大孔吸附樹脂純化研究

2.2.1 大孔吸附樹脂的篩選

按照1.3.6.2方法對15種樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附和解吸試驗，并結(jié)合樹脂的極性、比表面積分析15種大孔吸附樹脂的吸附和解吸性能，結(jié)果見表6。

大孔吸附樹脂的極性和比表面積對綠豆皮黃酮吸附和解吸有很大的影響，比表面積越大，其吸附量就越大[22]，黃酮類物質(zhì)的極性比較大，因此極性越大的樹脂對黃酮的吸附效果會越好。

由表6可知，大孔吸附樹脂對綠豆皮黃酮的吸附和解吸有較強(qiáng)的選擇性。其中，NKA-9、D301、AB-8、DM130、HPD300、D101樹脂的吸附率要明顯高于其他樹脂，而NKA-9、AB-8、DM130、NKA-2、D101、DM301樹脂的解吸率要高于其他樹脂。原因可能是NKA-9、D301、DM130是極性樹脂，與綠豆皮黃酮通過靜電作用吸附；綠豆皮黃酮中可能含有酚羥基和糖苷鍵，具有一定的極性和親水性，有利于AB-8弱極性樹脂的吸附；而HPD300、D101樹脂比表面積較大，對綠豆皮黃酮的吸附率高，但解吸率較低。綜合考慮吸附率和解吸率這2個指標(biāo)，選擇NKA-9、AB-8、NKA-2、DM130、DM301、D101這6種樹脂通過靜態(tài)吸附和解吸動力曲線進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

表6 不同大孔樹脂對黃酮的靜態(tài)吸附和解吸結(jié)果

2.2.2 靜態(tài)吸附和解吸動力學(xué)曲線

由圖2可知，6種樹脂對綠豆皮黃酮的吸附為快速平衡型。在0～2 h之間，樹脂吸附速度較快，2～5 h之間，吸附趨于平緩，6 h之后吸附基本平衡，D101、DM301和NKA-9樹脂的吸附率明顯高于NKA-2、DM130和AB-8。在2～5 h之間隨著時間的增加，解吸率逐漸上升，6 h后，解吸率基本達(dá)到平衡，AB-8、NKA-9和NKA-2樹脂的解吸率顯著高于DM130、DM301和D101。綜合考慮6種樹脂的吸附和解吸效果，選取NKA-9型大孔樹脂作為純化綠豆皮黃酮的最佳樹脂。

圖2 不同型號樹脂靜態(tài)吸附和解吸動力學(xué)曲線

2.2.3 NKA-9樹脂對綠豆皮黃酮的純化

按照1.3.7對綠豆皮黃酮進(jìn)行純化，結(jié)果表明，每使用1.00 g樹脂純化綠豆皮黃酮，可得總黃酮回收率為82.8%，說明NKA-9樹脂吸附量大，黃酮回收率高，結(jié)果見表7。

表7 NKA-9樹脂純化綠豆皮黃酮的純度和回收率

2.3 綠豆皮黃酮抗氧化活性研究

由圖3可知，當(dāng)質(zhì)量濃度不變時，純化前后綠豆皮黃酮提取液清除超氧陰離子自由基的能力與作用時間成反比；在相同反應(yīng)時間時，其清除超氧陰離子自由基的能力大致與提取液的質(zhì)量濃度成正比，純化后綠豆皮黃酮清除超氧陰離子自由基的能力顯著高于純化前的。在反應(yīng)時間為30 s，質(zhì)量濃度為0.5和1 mg/mL時，純化前的清除率達(dá)到70.8%和86%，純化后的清除率達(dá)到85.8%和97%。當(dāng)反應(yīng)時間在120 s后，其清除率變化較小。

圖3 綠豆皮黃酮純化前后的清除效果

2.3.2 清除DPPH自由基

從圖4可知，隨著綠豆皮黃酮和VC質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除率逐漸上升。在質(zhì)量濃度較低時，綠豆皮黃酮和VC對DPPH自由基清除差異不顯著，隨著質(zhì)量濃度增加，其DPPH自由基清除率低于同一質(zhì)量濃度的VC，當(dāng)質(zhì)量濃度為62.5 μg/mL時，VC和純化前后綠豆皮黃酮DPPH自由基清除率分別達(dá)到87.1%、75.54%和80.6%。

圖4 綠豆皮黃酮DPPH自由基清除效果

2.3.3 清除·OH自由基

從圖5可知，綠豆皮黃酮和VC對·OH自由基清除能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。在同一質(zhì)量濃度下，綠豆皮黃酮的清除能力低于VC，當(dāng)質(zhì)量濃度從31.25 μg/mL上升到125 μg/mL時，VC的清除率從51.3%上升到75.1%，綠豆皮黃酮清除率從20.49%上升到58.56%。當(dāng)質(zhì)量濃度在500 μg/mL和1 000 μg/mL時，純化前黃酮的清除率分別達(dá)到89.04%和92.78%，純化后黃酮的清除率分別達(dá)到94.55%和96.27%。

圖5 綠豆皮黃酮羥自由基清除效果

2.3.4 還原能力

在還原能力的分析中，所測樣品中的黃酮會使反應(yīng)體系中的Fe3+還原成Fe2+，在700 nm的吸光度變化反應(yīng)出還原能力的高低，吸光度越高說明還原能力越強(qiáng)[23]。由圖6可知，隨質(zhì)量濃度的增加，VC和綠豆皮黃酮物質(zhì)的還原能力逐漸加強(qiáng)，質(zhì)量濃度在1 000 μg/mL以下時，還原能力上升趨勢顯著，當(dāng)質(zhì)量濃度為4 000 μg/mL時，VC和黃酮的還原力分別為1.87和1.38，純化后黃酮的還原力達(dá)到1.957。

圖6 綠豆皮黃酮還原能力

3 結(jié)論

3.1 通過正交試驗得到微波輔助提取綠豆皮黃酮的最佳工藝參數(shù)，在液料比為35:1，微波時間80 s，微波功率540 W，乙醇濃度為70%時，綠豆皮黃酮的提取量達(dá)到8.452 mg/g。

3.2 通過比較15種大孔吸附樹脂對綠豆皮黃酮的靜態(tài)吸附和解吸性能，選擇NKA-9大孔樹脂作為理想樹脂，對綠豆皮黃酮進(jìn)行純化，經(jīng)純化后黃酮純度由原來的37.14%上升到71.08%，純度提高2倍，黃酮回收率可達(dá)82.8%。

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Extraction Purification and Antioxidation of Flavonoids from Mung Bean Hull

Luo Lei Ji Qinghua Jiao Kunpeng Zhu Wenxue Guan Ningning Xue Yihan
(College of Food & Bioengineering,Henan University of Science and Technology;Henan Agricultural Products Drying Equipment Engineering Technology Research Center,Luoyang 471023)

Study on microwave-assisted extraction,macroporous resin purification and in vitro antioxidant activity of flavonoids from mung bean hull.The results showed that the optinal extraction parameters were as follow：liquid-to-solid ratio,35:1,microwave time,80 s,microwave power,540 W,ethanol volume fraction,70%,leading to the maximum extraction yield of 8.467 mg/g.The results of the 15 kinds of resin adsorption and desorption kinetics studies showed that NKA-9 resin revealed a good ability to purification flavonoids from mung bean hull.After the purification,the purity of flavonoids from mung bean hull was increased from 37.14% to 71.08%,the recovery of flavonoids reached up to 82.8%.Antioxidant activity tests of the flavonoids from mung bean hull showed that its ability of scavenging effects on superoxide action free radical was inversely proportional to the time,while it become direct ratio get along with consistence.It had a better scavenging activity of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radical and the hydroxyl radical.After purification,antioxidant activities were improved significantly than before.

mung bean hull,flavonoids,extraction,purification,antioxidant activities

TS214.9

A

1003-0174(2017)09-0109-07

國家自然科學(xué)基金(U1304330)，河南省高校創(chuàng)新團(tuán)隊計劃(17IRSTHN016)

2016-08-18

羅磊，男，1976年出生，博士，食品干燥品質(zhì)控制、食品營養(yǎng)成分與活性

朱文學(xué)，男，1967年出生，教授，農(nóng)產(chǎn)品加工研究