籽瓜種子蛋白對肌原纖維蛋白功能的影響

王鶴霖

(黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶 163319)

籽瓜種子蛋白對肌原纖維蛋白功能的影響

王鶴霖

(黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶 163319)

本研究以籽瓜種子為原料，利用堿溶酸沉方法提取籽瓜種子蛋白，在40、60、80 ℃條件下獲得不同籽瓜種子蛋白，分別進行分子質(zhì)量、溶解度測定，并與肌原纖維蛋白形成凝膠，對凝膠作用力、彈性、回彈性、粘結(jié)性、水相分度、白度進行試驗。結(jié)果表明，40～80 ℃范圍內(nèi)隨著提取溫度的升高，籽瓜種子蛋白溶解度先升高后降低差異顯著(P<0.05)，并獲得4個吸收峰，峰1為699～103ku的大分子蛋白聚集體，峰2、峰3分別為340、212 ku的球蛋白，及10～54 ku部分清蛋白、球蛋白的亞基，隨著堿溶溫度繼續(xù)升高，峰2、峰3逐漸消失。籽瓜種子蛋白與肌原纖維蛋白形成凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性通過疏水鍵、氫鍵、以及二硫鍵維持，其中疏水鍵、氫鍵為主要作用力。堿溶溫度為60 ℃時，WPS與MP形成凝膠彈性較好、保水性較好，差異顯著(P<0.05)。隨著溫度的增加，凝膠白度逐漸加，WPS結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、變性，差異顯著(P<0.05)。由此可知，溫度對籽瓜種子蛋白結(jié)構(gòu)、功能影響較大，不同堿溶溫度提取的籽瓜種子蛋白對肌原纖維蛋白功能影響差異顯著，堿溶溫度為60 ℃時，獲得籽瓜種子蛋白與肌原纖維蛋白形成的凝膠有利于改善對肉制品品質(zhì)，可作為非肉蛋白穩(wěn)定劑添加到豬肉制品中。

分子質(zhì)量 色澤 質(zhì)構(gòu) 籽瓜種子蛋白

籽瓜種子蛋白質(zhì)(watermelon seed protein ，WSP)質(zhì)量分數(shù)36%～40%，必需氨基酸(除賴氨酸)含量均達到或超過推薦的標準[1]，并且氨基酸配比較適宜，而大豆中氨基酸配比顯著低于FAO/WHO均衡模式，WPS作為一種優(yōu)良的植物蛋白資源，目前國內(nèi)相關(guān)應用報道較少，局限了WPS的使用。WPS中78%為球蛋白，由3個α酸性亞基和3個β堿性亞基通過雙硫鍵相結(jié)合，大豆球蛋白是由α酸性亞基和β堿性亞基所組成，WPS與大豆作物種子儲藏蛋白質(zhì)可能具有同源性[2]。賴氨酸和蛋氨酸分別是小麥和豆類的限制性氨基酸，而籽瓜種子賴氨酸和蛋氨酸含量分別高于小麥和豆類，可補充禾谷類和豆類蛋白質(zhì)的營養(yǎng)不足。

研究表明，WPS能夠有效改善香腸質(zhì)構(gòu)，提高香腸品質(zhì)[3]。肌原纖維蛋白(Myofibrillar proteins, MP)，是動物肌肉中最重要的蛋白質(zhì)，約占肌肉中蛋白質(zhì)總量的50%～55%，MP經(jīng)熱誘導作用形成的三維網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)有助于產(chǎn)品穩(wěn)定性，非肉蛋白與肌肉蛋白連續(xù)介質(zhì)彼此穿插共同形成混合連續(xù)相，能夠改善肉制品的凝膠性、保水保油性，提高產(chǎn)品得率等[4]。

目前國內(nèi)對籽瓜種子蛋白的研究較少，限制了籽瓜種子蛋白的使用及當?shù)亟?jīng)濟的發(fā)展，現(xiàn)有非肉蛋白種類少，籽瓜種子蛋白對肉制品中的應用尚不明確，急待開發(fā)使用。

由于溫度對蛋白機構(gòu)、聚集體大小有很大的影響，蛋白聚集體的大小對凝膠的形成具有重要影響。為更好將WPS應用于其他肉制品中，選取不同溫度提取籽瓜種子蛋白，并對蛋白的溶解度、分子質(zhì)量及對肌原纖維蛋白功能影響進行研究，為今后WPS在肉制品中推廣使用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料試劑

豬里脊：金鑼冷鮮肉；籽瓜：內(nèi)蒙古通遼市；乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA，分析純)、甲狀腺球蛋白、淀粉酶、乙醇脫氫酶、白蛋白標準品、鹽酸胍(GuHCl，分析純)、二硫蘇糖醇(DTT，分析純)：美國sigma公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

德國FA25均質(zhì)機、5417R離心機、SPECORD-210plus分光光度計：德國公司；流變儀：Thermo Scientific公司；英國TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀：PQ001低場核磁共振儀：CR-410色差儀：1200S安捷倫高效液相色譜：TSKG2000SW凝膠柱：DBS-100電腦全自動部分收集器：Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 籽瓜種子蛋白提取

籽瓜種子蛋白提取 WPS 籽瓜種子粉碎，脫脂(乙醚用量1∶4(m∶m)，50 ℃，通風櫥中干燥8 h，再置于鼓風干燥機50 ℃干燥12 h)。按1∶10(m∶m)加入去離子水，調(diào)節(jié)pH 11，水浴加熱1.5 h，機械攪拌，3 500 r/min下離心15 min，15 ℃冷凍離心，取上清液，調(diào)節(jié)pH 5.0，離心，獲得沉淀，清洗沉淀至pH 7.0，冷凍干燥獲得WPS[5]。

1.3.2 肌原纖維蛋白提取

參考陳洪生等[6]的方法，略有修改。選取豬背最長肌，除去脂肪和結(jié)締組織，10 mmol/L Na3P04，0.1 mol/L NaC1，2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EGTA，調(diào)至pH 7.0，制備MP沉淀，利用0.1 mol/L NaCl溶液溶解，0.1 mol/L HCl提純，獲得MP。采用雙縮脲法，以標準牛血清白蛋白為標準蛋白測定MP含量。

1.3.3 堿溶加熱處理WPS

本研究選取堿溶溫度分別為40、60、80 ℃，機械攪拌1.5 h，其他同1.3.1。得到堿溶加熱處理的樣品分別標記為WPS40、WPS60、WPS80。

1.3.4 籽瓜種子蛋白測定

1.3.4.1 籽瓜種子蛋白溶解度測定：用去離子水配制籽瓜種子蛋白溶液(蛋白質(zhì)量濃度20 mg/mL, pH 7.0，并磁力攪拌溶解1 h，然后離心(3 500 r/min下冷凍離心15 min ，15 ℃)。參照GB/T 5009.5—2010的凱氏定氮法分別測定原液和上清液中蛋白質(zhì)的含量。

S蛋白=m1/m2×100%

(1)

式中：S蛋白為蛋白溶解度/%；m1為上清液蛋白含量/g/100 mL；m2為原液中蛋白含量/g/100 mL。

1.3.4.2 不同溫度堿溶蛋白分子質(zhì)量分布：利用超濾排阻103ku蛋白質(zhì)，取2.000 g 于10 mL 容量瓶中，用流動相定容至刻度，超聲振蕩10 min，使樣品充分溶解，混勻，用孔徑為0.2～0.5 μm 聚四氟乙烯膜過濾后，上機進樣。利用C18凝膠柱，將標準品甲狀腺球蛋白(669 ku )，淀粉酶(200 ku)、乙醇脫氫酶(150 ku)、白蛋白(66 ku)分別用流動相配制成質(zhì)量分數(shù)為0.1%的不同分子質(zhì)量蛋白標準品溶液，用孔徑為0.2～0.5 μm 聚四氟乙烯膜過濾后，分別取20 μL上機進樣，利用磷酸鹽緩沖溶液pH 7.0為洗脫液，流速為1.0 mL/min，柱溫26 ℃，吸收波長為220 nm條件下，進行檢測，繪制標準曲線。

1.3.4.3 復合凝膠的制備[7]：WPS與MP按照1∶1(m∶m)制備凝膠，分別用0.6 mol/L的NaCl溶解調(diào)至pH 6.25，配制成50 mg/mL溶液，將其在室溫下保持2 h，取15 mL加入3.0×5.0 cm稱量瓶中，蓋上蓋，置于水浴中，從25 ℃開始加熱，當中心溫度達到目標溫度75 ℃時開始計時，加熱30 min，隨后取出放入冰浴中30 min , 4 ℃保存過夜，備用[7]。

1.3.5 復合凝膠的檢測

1.3.5.1 復合膠溶解度測定：根據(jù)檢測非共價鍵和二硫鍵作用的需要，配制以下4種凝膠溶解液:含0.6 mol/L NaCl的50 mmol/L PBS，pH 6.25用WP表示沒有參與形成凝膠蛋白；6 mol/L鹽酸胍(GuHCl)用WG表示非共價鍵對凝膠穩(wěn)定性的作用，10 mol/L 二硫蘇糖醇(DTT)分別溶解在含0.6 mol/L NaCl的50 mmol/L PBS中(pH 6.25) 用WD表示二硫鍵對凝膠穩(wěn)定的作用，6 mol/L GuHCl+10 mol/L DTT用WT表示為WP、WG、WD 3個的總和。分別取2 g蛋白凝膠用玻璃棒搗碎溶解在8 mL凝膠溶解液中，在80 ℃水浴加熱3 h后冷卻、離心(3 500r/min，15 min，4 ℃)。復合凝膠溶解度即上清液蛋白占凝膠中總蛋白量百分比。

1.3.5.2 凝膠的質(zhì)構(gòu)測定：參照董慶利等[8]的測定方法，并稍作修改進行測定，采用TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀對凝膠進行分析，包括黏結(jié)性、彈性、回彈性。先將凝膠22 ℃，放置30 min，連同稱量瓶一起放入置物盤上，用物性測試儀進行測定。測定參數(shù)：探頭型號為P/50，測前速度2 mm/s，測中速度1 mm/s，測后速度2 mm/s，觸發(fā)力5 g，樣品高度為20 mm，壓縮距離為凝膠50%。

1.3.5.3 凝膠水分相態(tài)的測定：測量前先將凝膠22 ℃，放置30 min后，用生料帶包好進行核磁共振試驗，每個試驗平行3次，使用紐邁NM120-Analyst通過CPMG序列測定橫向弛豫時間T2。磁體溫度為恒溫32 ℃，質(zhì)子共振頻率SF=19.00 MHz，采樣點數(shù)TD=170 400，重復采樣等待時間TW=2 000.00 ms，累加次數(shù)NS=32，回波個數(shù)NECH=4 000，時延DL1=0.200。CPMG序列使用紐邁電子公司的核磁共振分析應用軟件進行反演，得到T2值。

1.3.5.4 凝膠白度測定：色差計測定凝膠的白度值，參考Zhu等[9]的方法計算，其中L*、a*、b*值分別為亮度指數(shù)、色調(diào)和彩度指數(shù)。L*=0為黑色，L*=100為白色。a*值越大，顏色越接近紅色；a*值越小越接近綠色。b*值越大，顏色越接近黃色；b*值越小越接近藍色。凝膠白度按公式(2)計算。

(2)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標準差(SD)。采用SPSS 16.0軟件中One-Way ANOVA進行差異性分析，P<0.05認為具有統(tǒng)計學顯著性差異，P>0.05認為具有統(tǒng)計學差異不顯著，利用Simga公司的sigma Plot 10.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同堿溶溫度對WPS溶解度的影響

圖1表示籽瓜種子蛋白提取工藝的堿溶階段，選取不同的溫度提取對WPS溶解度的影響。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，溶解度呈現(xiàn)下降趨勢，當溫度為50 ℃，溶解度下降6%，差異顯著(P<0.05)。相關(guān)報道表明，當加熱溫度小于100 ℃，加熱可以使蛋白展開、聚集形成可溶蛋白和不溶的蛋白大分子聚集體，溫度較高時會引起不溶蛋白聚集體增多從而導致溶解度的降低[10]。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 堿溶溫度對WPS溶解度的影響

2.2 不同堿溶溫度對WPS分子質(zhì)量分布的影響

圖2不同堿溶溫度提取WPS分子質(zhì)量分布圖。如圖所示，堿溶溫度40 ℃時獲得4個吸收峰，峰1為分子質(zhì)量大于669 ku小于103ku的大分子蛋白聚集體，相關(guān)資料顯示，籽瓜種子蛋白主要分為清蛋白和球蛋白，球蛋白質(zhì)量分數(shù)占78%，由此推測峰2和峰3分別為不同沉降系數(shù)球蛋白，分子質(zhì)量分別約為340、212 ku。峰4為其他蛋白、部分清蛋白，以及球蛋白的亞基，分子質(zhì)量范圍為54～10 ku。隨著處理溫度的升高，峰1面積增大，峰2、峰3降低，峰4含量逐漸降低。當溫度升到80 ℃，峰1面積繼續(xù)增大，峰2、峰3幾乎消失不見。當溫度較高時，蛋白質(zhì)分子之間形成大分子聚集體，隨著加熱時間延長，聚集體逐漸增大，不溶性聚集體含量增多，可溶性聚集體含量降低，導致蛋白溶解度降低，與圖1試驗結(jié)果吻合，堿溶溫度80 ℃時，WPS溶解度差異顯著。

圖2 堿溶溫度對WPS分子質(zhì)量分布的影響

2.3 堿溶溫度對WPS與MP復合膠溶解度的影響

圖3為不同堿溶溫度提取WPS，分別在3種變性劑(WP、WD、WG)中的溶解度測定結(jié)果圖。維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的作用力主要有氫鍵、靜電作用、共價鍵、疏水作用力、范德華力。沒形成凝膠的蛋白，將溶解在WP試劑中。由圖3可知，WPS40、WPS60、WPS80都有溶解，溶解度均小于20%，其中WPS60溶解性最差，差異顯著(P<0.05)，說明堿溶溫度60 ℃時，80%以上WPS參與三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成。WD溶液中的還原劑DTT，具有-SH基，能使蛋白質(zhì)分子中存在的二硫鍵還原，從而改變蛋白質(zhì)的原有構(gòu)象，造成蛋白質(zhì)的不可逆變性。3種復合凝膠均發(fā)生溶解，但溶解度較低，說明二硫鍵對凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定性的作用，但不是維持網(wǎng)結(jié)構(gòu)的主要作用力。GuHCl能夠破壞穩(wěn)定蛋白構(gòu)象的疏水作用力，或者直接與蛋白會分子作用而破壞氫鍵，3種復合凝膠在WG中的溶解度較大，說明氫鍵、疏水作用力為保證三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的主要作用力，在當加熱時，包埋在蛋白分子內(nèi)部的疏水基團暴露，增進了臨近分子非極性片段間的疏水作用力，增強了凝膠的穩(wěn)定性。WPS60溶解度與WPS40差異不顯著，與WPS80差異顯著(P<0.05)。由此推測，當溫度較高時，蛋白變性，維持蛋白構(gòu)象的作用力發(fā)生改變。在WT中，3種復合凝膠均全溶解，溶解度為100%。

注：字母A～B表示不同堿溶溫度復合凝膠在WP中溶解度的差異顯著性；字母X-Z表示不同堿溶溫度復合凝膠在WD中溶解度的差異顯著性；字母a-b表示不同堿溶溫度復合凝膠在WG中溶解度的差異顯著性(P<0.05)。圖3 WPS-MP復合凝膠在WP、WD、WG中的溶解度測定

2.4 堿溶溫度對WPS與MP凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

圖6為不同堿溶溫度提取WPS對MP凝膠質(zhì)構(gòu)的影響，由圖6可知WPS60的黏結(jié)性最大，加熱導致WPS構(gòu)象發(fā)生改變或部分伸展，大量的親水基團、疏水基團暴露出來，親水基團和水分子發(fā)生結(jié)合，使互不溶的相態(tài)體系緊密相連，能更好地形成統(tǒng)一整體。當堿溶溫度為60 ℃時，提取WPS60與MP形成凝膠的彈性較好，當堿溶溫度繼續(xù)升高，導致維持蛋白結(jié)構(gòu)功能鍵斷裂，結(jié)構(gòu)破壞，凝膠彈性下降。

圖6 不同堿溶溫度提取蛋白對MP凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

2.5 堿溶溫度對WPS與MP凝膠水相分布的影響

肌肉中的水分大約占總水分的75%，主要存在于肌原纖維內(nèi)的粗細絲、肌原纖維、肌原纖維與細胞膜及肌細胞與肌束之間，根據(jù)其存在的狀態(tài)不同可分為結(jié)合水、不易流動水和自由水。根據(jù)T指數(shù)衰減曲線進行擬合繪制圖7，3種不同堿溶蛋白獲得3個峰，T21、T22、T23，分別代表了水中的3種形態(tài)，結(jié)合水、不易流動水、以及自由水部分[11]。弛豫時間的長短，決定水與底物的緊密程度[12]。凝膠形成過程中，T23峰面積最大，凝膠形成過程中，水添加量大于凝膠內(nèi)部形成需求量，大部分水分以自由水形式存在，導致T23峰面積最大。比較發(fā)現(xiàn)WPS80與MP形成的凝膠T21弛豫時間最長，WPS60與MP形成的凝膠T21弛豫時間最短，T21弛豫越短說明蛋白質(zhì)與結(jié)合水緊密度較高，穩(wěn)定性較好。WPS60的T22弛豫時間最短，不易流動水較穩(wěn)定，保水性越好。同時由表1可以看出，WPS60的結(jié)合水和不易流動水的峰面積最大，含量最高。因此，當堿溶溫度為60 ℃時，提取WPS60與MP形成的凝膠更適合應用于香腸制品中。

圖7 不同堿溶WPS對MP凝膠水相分布的影響

表1 復合凝膠在中低場核磁弛豫峰面積百分數(shù)(T2)變化

注：字母a-c相同表示不同堿溶溫度復合凝膠T21差異不顯著(P>0.05)，不同表示差異顯著(P<0.05)；字母A-B相同表示不同堿溶溫度復合凝膠T22差異不顯著(P>0.05)，不同表示差異顯著(P<0.05)；字母x-y相同表示不同堿溶溫度復合凝膠T23差異不顯著(P>0.05)，不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.6 堿溶溫度對WPS與MP凝膠白度的影響

圖8為不同堿溶WPS與MP形成凝膠白度的測定，凝膠的白度和蛋白質(zhì)的變性程度具有相關(guān)性[13]凝膠的白度值變化越大，蛋白的結(jié)構(gòu)變化越大。由圖8可知，3種WPS與MP形成凝膠，白度均較低，由于在WPS提取過程中，籽瓜種子皮中的色素部分溶解導致提取的蛋白顏色發(fā)暗，導致凝膠白度較低。隨著溫度的增加，凝膠白度逐漸加，差異顯著(P<0.05)。說明凝膠對溫度較為敏感，隨著提取溫度的改變，WPS結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，變性，溫度越高，變性程度越大。由此可看出，堿溶溫度對凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成有著重要的影響。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖8 不同堿溶WPS對MP凝膠白度的影響

3 結(jié)論

籽瓜種子蛋白作為一種新型蛋白，由于種植地方局限性，限制了籽瓜種子蛋白的使用。本研究利用不同堿溶溫度提取籽瓜種子蛋白，溫度對籽瓜種子蛋白結(jié)構(gòu)、功能影響較大，不同堿溶溫度提取的籽瓜種子蛋白對肌原纖維蛋白功能影響差異顯著，WPS提取溫度為60 ℃時提取的WPS與MP形成WPS-MP復合凝膠具有很好的彈性、保水性較好。因此，利用60 ℃提取的籽瓜種子蛋白適合應用于肉制品加工中。由于提取籽瓜種子蛋白顏色較暗，適合用于對顏色要求較低豬肉制品中。

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The Effect of Watermelon Seed Protein on the Function of Myofibrillar

Wang Helin
(College of Food Science of Heilongjiang Bayi Agricltural University, Daqing 163319)

The watermelon seed was selected as the raw material to extract the watermelon seed protein by alkali-solution and acid-isolation method. Under the temperature of 40，60 and 80 ℃，different watermelon seed protein could be gained. The molecular weight, solubility test was conducted and fibrillin formed gelate. Experiments were conducted on gel acting force, elasticity, rebound resilience, caking property, aqueous phase degree and whiteness. The studies showed that solubility of the WPS increases with the following decrease as the increasing temperature. There were four absorption peaks as follows. The Mw of peak 1 was 699～103ku as the macromolecule protein aggregation. The Mw of peak 2 and peak 3 were 340 and 212 ku, respectively, as the different sedimentation coefficient of globulin. The Mw of peak 4 was 10～54 ku as the subunit of some albumin and globulin. The peak 2 and 3 disappeared gradually as the increasing temperature. The stability of the three-dimensional network structure was held by the disulfide bond, and especially the hydrophobic bond, hydrogen bond. The WPS and MP form a gel as the alkali liquor temperature 60 ℃, of which elasticity and water distribution was suitable for the application of pork products. The temperature of alkali liquor was important for the protein denaturation. Taken together, the WPS could be added to the pork products as the non meat proteins stabilizer.

molecular weight, colour, texture profile, watermelon seed protein

TS210

A

1003-0174(2017)09-0075-06

2016-04-18

王鶴霖，女，1983年出生，碩士，食品科學與工程