甲強(qiáng)龍?jiān)诠撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠脊髓損傷中的作用及對(duì)腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素- 1β表達(dá)的影響

楊新明，成垚昱，張振梁，康 聰

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1骨科 2研究生院，河北張家口 075000

·論著·

甲強(qiáng)龍?jiān)诠撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠脊髓損傷中的作用及對(duì)腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素- 1β表達(dá)的影響

楊新明1，成垚昱2，張振梁2，康 聰2

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1骨科2研究生院，河北張家口 075000

目的探討甲強(qiáng)龍(MP)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)治療大鼠脊髓損傷(SCI)中的作用及對(duì)局部腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)- 1β表達(dá)變化的影響。方法采用改良Allen法制備40只T10脊髓損傷雄性大鼠模型，隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、MP組、BMSCs組和MP+BMSCs組4組，每組10只。按上述分組分別在脊髓損傷后立即尾靜脈緩慢推注30 mg/kg MP和/或在脊髓損傷后2 h于脊髓損傷部位注射全貼壁法培養(yǎng)并以BrdU標(biāo)記的BMSCs。術(shù)后1、7、14 d，采用BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分法評(píng)價(jià)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。14 d后處死各組大鼠并取出脊髓樣本，分別進(jìn)行TNF-α、IL- 1β免疫組織化學(xué)染色和Tunel染色，各組統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)TNF-α、IL- 1β表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；采用BrdU單染觀察BMSCs組和MP+BMSCs組中BrdU陽(yáng)性率。結(jié)果術(shù)后1 d，各組BBB評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.0756，P=0.7829)。術(shù)后7 d，各組大鼠雙后肢運(yùn)動(dòng)功能較前明顯恢復(fù)，其中MP組(χ2=8.3265，P=0.0325)和BMSCs組(χ2=14.1166，P=0.0036)的BBB評(píng)分明顯高于對(duì)照組；MP+BMSCs組的BBB評(píng)分明顯高于MP組(χ2=17.7186，P=0.0002)和BMSCs組(χ2=15.8110，P=0.0024)。術(shù)后14 d，各組大鼠雙后肢運(yùn)動(dòng)功能明顯恢復(fù)，MP+BMSCs組BBB評(píng)分明顯高于MP組(χ2=24.7259，P<0.0001)和BMSCs組(χ2=25.6014，P<0.0001)，MP組(χ2=13.5060，P=0.0062)和BMSCs組(χ2=8.9613，P=0.0299)的BBB評(píng)分明顯高于對(duì)照組。術(shù)后14 d，對(duì)照組、MP組、BMSCs組和MP+BMSCs組的細(xì)胞凋亡率分別為(48.47±5.70)%、(31.95±3.58)%、(41.39±2.33)%和(23.48±2.69)%，其中，MP組(q=14.84，P<0.0001)和BMSCs組(q=6.716，P= 0.0002)明顯低于對(duì)照組，MP+BMSCs組明顯低于MP組(q=7.332，P=0.0001)和BMSCs組(q=15.460，P<0.0001)。術(shù)后14 d，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，MP組(q=14.710，P<0.0001；q=6.710，P<0.0001)和BMSCs組(q=6.502，P=0.0001；q=2.849，P=0.0514)的TNF-α及IL- 1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯低于對(duì)照組，MP組(q=5.573，P=0.0004；q=4.596，P=0.0025)和BMSCs組(q=13.780，P<0.0001；q=8.456，P<0.0001)的TNF-α及IL- 1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于MP+BMSCs組。術(shù)后14 d，BrdU染色結(jié)果顯示，BMSCs組的BrdU陽(yáng)性率為(6.600±0.3399)%，明顯低于MP+BMSCs組的(9.300±0.5175)%(t=4.361，P=0.0004)。結(jié)論MP可明顯提高BMSCs移植治療SCI的大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，二者可協(xié)同降低局部TNF-α和IL- 1β表達(dá)水平，并且MP有效提升了移植BMSCs的存活。

脊髓損傷；甲強(qiáng)龍；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-1β；BrdU染色

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是脊柱椎體骨折中一種常見(jiàn)而嚴(yán)重的合并傷，其有效治療一直是醫(yī)學(xué)界中的一個(gè)難題。完全性SCI可導(dǎo)致患者損傷脊髓節(jié)段下的軀體及相應(yīng)支配肢體的感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)喪失，內(nèi)部臟器功能失調(diào)，致殘率極高，臨床療效差，并發(fā)癥多，不僅給個(gè)人身體及心理帶來(lái)痛苦，而且增加了家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前針對(duì)其治療尚無(wú)有效措施，如何有效修復(fù)受損脊髓已成為全世界共同關(guān)注的課題。自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs)研究以來(lái)，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)其在組織修復(fù)再生、器官功能恢復(fù)等方面作用顯著[1- 3]，而且能分泌多種生長(zhǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)修復(fù)受損脊髓組織，促進(jìn)神經(jīng)元存活和神經(jīng)纖維延長(zhǎng)，重建神經(jīng)環(huán)路，阻止神經(jīng)元胞體萎縮，加快SCI修復(fù)[4]。BDNF獨(dú)特的修復(fù)損傷組織能力顯示了強(qiáng)大的科學(xué)研究及臨床應(yīng)用價(jià)值，但實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其治療SCI時(shí)應(yīng)用效能很低。甲強(qiáng)龍(methylprednisolone，MP)是目前公認(rèn)神經(jīng)功能保護(hù)藥物，也是迄今為止應(yīng)用最為廣泛的治療急性SCI藥物，被美國(guó)食品藥品管理局最早認(rèn)可并批準(zhǔn)應(yīng)于治療急性SCI[5]。研究顯示，MP能有效保護(hù)急性SCI后神經(jīng)結(jié)構(gòu)且療效確切[5- 7]。本研究評(píng)估了MP在BMSCs治療大鼠SCI中的作用及對(duì)局部腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α和白細(xì)胞介素(interleukin，IL)- 1β表達(dá)變化的影響，以期在治療SCI方法上探索新的思路。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4周齡雄性SD大鼠2只，體質(zhì)量分別為80和100 g；8周齡健康成年SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量220～250 g，由河北北方學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號(hào)：SCXK(軍) 2012- 0004]。分籠顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲水。

主要試劑和儀器低糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、0.02%EDTA(美國(guó)Gibco公司)，大鼠單克隆抗體(CD34-ECD、CD45-PE、CD29-FITC、CD90-FITC)(美國(guó)BD公司)；BrdU試劑、BrdU小鼠抗人單克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)，DAB顯色系統(tǒng)、TNF-α一抗兔抗鼠抗體、TNF-α二抗羊抗兔抗體、兔抗大鼠白細(xì)胞介素1β(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)，MP(美國(guó)輝瑞公司)。倒置相差顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡、石蠟切片機(jī)、組織包埋機(jī)、組織脫水機(jī)(德國(guó)萊卡)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Bioscience公司)。

大鼠SCI模型的制備大鼠術(shù)前禁食水12 h，將配置好的10%水合氯醛按30 mg/100 g標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射麻醉，脊髓定位以T10中心，運(yùn)用改良Allen法造成T10節(jié)段損傷。造模成功標(biāo)志：大鼠立即出現(xiàn)一過(guò)性鼠尾痙攣性擺動(dòng)及雙下肢連續(xù)性抽動(dòng)，T10節(jié)段出現(xiàn)硬脊膜血腫。術(shù)后立即予以腹腔注射生理鹽水4 ml/只，常規(guī)人工排尿，每日2～3次，輔助恢復(fù)自主膀胱，青霉素2×105U，肌肉注射預(yù)防感染，連用3 d。

BMSCs的培養(yǎng)、鑒定、標(biāo)記和移植取4周齡雄性SD大鼠2只，脫頸處死，在無(wú)菌條件下分離并完整剪下雙側(cè)股骨和脛骨采集骨髓液，經(jīng)過(guò)濾過(guò)后接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，并標(biāo)記為原代，在環(huán)境為5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將原代細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，分別于24、48、72 h更換培養(yǎng)液1次，以后2～3 d換液1次。采用全骨髓貼壁法來(lái)培養(yǎng)BMSCs，取傳代3～4代的 BMSCs，通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)分析鑒定BMSCs純度>95%(以CD29、CD90>90%，CD34、CD45<2%為標(biāo)準(zhǔn))。鑒定成功后換液放入倒置相差顯微鏡下仔細(xì)觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況(圖1)，再將BrdU溶液稀釋為3 μg/ml的細(xì)胞標(biāo)記液備用，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、融合至50%左右的P3- 4代，倒掉培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液，PBS溶液清洗2次后在每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)加入上述細(xì)胞標(biāo)記液10 ml，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，標(biāo)記完畢后，調(diào)節(jié)BMSCs濃度達(dá)到1×106/ml，備用移植。

分組及處理采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，具體為：(1)對(duì)照組：不予以特殊處理；(2)MP組：SCI后立即經(jīng)尾靜脈緩慢推注30 mg/kg MP，15 min內(nèi)推完；(3)BMSCs組：SCI 2 h后，用微量注射管將1 μl標(biāo)記的BMSCs懸液緩慢注入損傷節(jié)段脊髓，部位選擇血腫中心及偏近遠(yuǎn)端各1.0 mm，深度為1.0 mm，留置微量注射管3 min[4]；(4)MP+BMSCs組：為MP組與BMSCs組方案的疊加。本研究經(jīng)河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有實(shí)驗(yàn)操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的評(píng)價(jià)采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)運(yùn)動(dòng)評(píng)分，在造模后第1、7、14天評(píng)價(jià)各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能情況，具體為：BBB 評(píng)分范圍從0～21分，0分表示無(wú)自發(fā)的后肢運(yùn)動(dòng)，21分表示正常后肢運(yùn)動(dòng)[8]。由兩名非專業(yè)人士雙盲檢測(cè)和評(píng)分，評(píng)分取兩人均值。

取材造模14 d完成BBB評(píng)分后，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)處死各組大鼠，固定、取材，取出脊髓組織以損傷節(jié)段及上下各0.5 cm 為準(zhǔn)，繼續(xù)在濃度4%多聚甲醛4℃條件下固定24 h。標(biāo)本經(jīng)梯度脫水、浸蠟、石蠟包埋，連續(xù)切片制成切片厚度為5 μm切片，每只大鼠25張，Tunel染色，TNF-α、IL- 1β免疫組織化學(xué)染色和BrdU染色各組5張，剩余備用。

Tunel細(xì)胞凋亡率的測(cè)定按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行Tunel染色，在顯微鏡下觀察視野凋亡細(xì)胞。判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核中含有棕黃色顆粒即為陽(yáng)性凋亡細(xì)胞，正常細(xì)胞為淡藍(lán)色。計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)脊髓TNF-α、IL-1β表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在100×高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)固定、無(wú)重復(fù)視野，統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)TNF-α、IL- 1β表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(以胞漿著色為主，胞漿呈棕黃色或棕褐色顆粒)，結(jié)果以5個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)表示。

BrdU染色按BrdU試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色后顯微鏡觀察染色結(jié)果并拍照。陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞胞核被染成棕褐色而胞漿被染成藍(lán)色。高倍顯微鏡下觀察隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算BrdU陽(yáng)性率并求均值：BrdU陽(yáng)性率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；單個(gè)時(shí)間點(diǎn)組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)，秩和檢驗(yàn)兩兩比較用Nemenyi檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

BMSCs細(xì)胞的培養(yǎng)情況原代細(xì)胞胞體呈圓形或多邊形，散布排列；第3代BMSCs(7 d)可見(jiàn)呈族狀分布的梭形細(xì)胞聚集，形成大小不一的集落；第3代BMSCs(14 d)可見(jiàn)在形態(tài)學(xué)上更加趨于一致，為排列更加有序的梭形細(xì)胞呈旋禍狀排列(圖1)。

造模情況術(shù)后1 d內(nèi)各組大鼠都出現(xiàn)不同程度的血尿。由于血尿、泌尿系感染及腸梗阻等原因，術(shù)后對(duì)照組、MP組、BMSCs組和MP+BMSCs組分別死亡大鼠3、2、2、2只，死亡大鼠均補(bǔ)齊數(shù)量。

大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況術(shù)后1 d，各組BBB評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.0756，P=0.7829)。術(shù)后7 d，各組大鼠雙后肢運(yùn)動(dòng)功能較前明顯恢復(fù)，其中MP組(χ2=8.3265，P=0.0325)和BMSCs組(χ2=14.1166，P=0.0036)的BBB評(píng)分明顯高于對(duì)照組；

MP+BMSCs組的BBB評(píng)分明顯高于MP組(χ2=17.7186，P=0.0002)和BMSCs組(χ2=15.8110，P=0.0024)。術(shù)后14 d，各組大鼠雙后肢運(yùn)動(dòng)功能明顯恢復(fù)，MP+BMSCs組BBB評(píng)分明顯高于MP組(χ2=24.7259，P<0.0001)和BMSCs組(χ2=25.6014，P<0.0001)，MP組(χ2=13.5060，P=0.0062)和BMSCs組(χ2=8.9613，P=0.0299)的BBB評(píng)分明顯高于對(duì)照組(表1)。

Tunel細(xì)胞凋亡率術(shù)后14 d，Tunel染色視野中可見(jiàn)大量褐色的凋亡細(xì)胞，對(duì)照組、MP組、BMSCs組和MP+BMSCs組的細(xì)胞凋亡率分別為(48.47±5.70)%、(31.95±3.58)%、(41.39±2.33)%和(23.48±2.69)%，其中，MP組(q=14.84，P<0.0001)和BMSCs組(q=6.716，P= 0.0002)明顯低于對(duì)照組，MP+BMSCs組明顯低于MP組(q=7.332，P=0.0001)和BMSCs組(q=15.46，P<0.0001)(圖2、表2)。

表 1 各組大鼠術(shù)后BBB運(yùn)動(dòng)功能秩和評(píng)分的比較(n=10)Table 1 Comparison of Basso-Beattie-Bresnahan rank scores among all groups(n=10)

MP：甲強(qiáng)龍；BMSCs：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與MP組比較，bP<0.05；與BMSCs組比較，cP<0.05

MP：methylprednisolone；BMSCs：bone marrow mesenchymal stem cell；aP<0.05 compared with control group；bP<0.05 compared with MP group；cP<0.05 compared with BMSCs group

BMSCs：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

BMSCs：bone marrow mesenchymal stem cells

A.原代BMSCs；B.第3代BMSCs(7 d)；C.第3代BMSCs(14 d)

A.BMSCs at primary passage；B.BMSCs at the 3 rd passage (day 7)；C.BMSCs at the 3 rd passage (day 14)

圖1 培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞的形態(tài)

Fig1 Morphology of BMSCs in culture

A.對(duì)照組；B.MP組；C.BMSCs組；D.MP+BMSCs組

A.control group；B.MP group；C.BMSCs group；D.MP+BMSCs group

圖2 Tunel染色結(jié)果

Fig2 Results of Tunel staining

脊髓TNF-α、IL-1β表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)術(shù)后14 d，脊髓切片TNF-α、IL- 1β免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，各組均可見(jiàn)不同程度陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈棕黃色或棕褐色，MP組、BMSCs組和MP+BMSCs組TNF-α和IL- 1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均有不同程度減少(圖3、4)。MP組(q=14.71，P<0.0001；q=6.710，P<0.0001)和BMSCs組(q=6.502，P=0.0001；q=2.849，P=0.0514)的TNF-α及IL- 1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯低于對(duì)照組，MP組(q=5.573，P=0.0004；q=4.596，P=0.0025)和BMSCs組(q=13.780，P<0.0001；q=8.456，P<0.0001)的TNF-α及IL- 1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于MP+BMSCs組(表2)。

BrdU單染結(jié)果術(shù)后14 d，BMSCs組和MP+BMSCs組脊髓切片行BrdU單染，結(jié)果顯示在脊髓損傷區(qū)內(nèi)均可見(jiàn)胞核呈棕色染色的陽(yáng)性細(xì)胞；BMSCs組的BrdU陽(yáng)性率為(6.6000±0.3399)%，明顯低于MP+BMSCs組的(9.3000±0.5175)%(t=4.361，P=0.0004)。

A.對(duì)照組；B.MP組；C.BMSCs組；D.MP+BMSCs組

A.control group；B.MP group；C.BMSCs group；D.MP+BMSCs group

圖3 脊髓組織腫瘤壞死因子-α免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

Fig3 Results of immunohistochemical staining of tumor necrosis fator-α

A.對(duì)照組；B.MP組；C.BMSCs組；D.MP+BMSCs組

A.control group；B.MP group；C.BMSCs group；D.MP+BMSCs group

圖4 脊髓組織白細(xì)胞介素- 1β免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

Fig4 Results of immunohistochemical staining of interleukin- 1β

表 2 術(shù)后14 d各組大鼠TNF-α和IL- 1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞凋亡率的比較(-±s，n=10)Table 2 Comparison of positive cells and apoptotic rates of TNF-α and IL- 1β among all groups 14 days after operation(-±s，n=10)

TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL- 1β：白細(xì)胞介素- 1β；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與MP組比較，bP<0.05；與BMSCs組比較，cP<0.05

TNF-α：tumor necrosis factor-α；IL- 1β：interleukin- 1β；aP<0.05 compared with control group；bP<0.05 compared with MP group；cP<0.05 compared with BMSCs group

討 論

SCI按病理過(guò)程分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，前者是外界暴力作用的瞬間對(duì)脊髓組織直接破壞，即刻引起神經(jīng)細(xì)胞損傷；后者則主要源于脊髓損傷后局部組織結(jié)構(gòu)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、炎性反應(yīng)及自由基等一系列病理生理變化[9- 10]，繼而導(dǎo)致神經(jīng)功能持續(xù)減退、惡化，通常原發(fā)性損傷無(wú)法干預(yù)，而繼發(fā)性損傷是可控的。研究表明，SCI后的繼發(fā)性損傷是多種因素作用下發(fā)生的神經(jīng)細(xì)胞程序化死亡，在諸如氧化應(yīng)激、炎性因子、鈣超載、興奮性毒性等影響因素中，炎癥反應(yīng)被認(rèn)為不僅作用于神經(jīng)細(xì)胞，而且可以加重或誘導(dǎo)其他有害因素的發(fā)生發(fā)展[10]。這些因素的綜合效應(yīng)引發(fā)的瀑布反應(yīng)可加重相應(yīng)部位的繼發(fā)性損傷。

已有研究表明，BMSCs具有多向分化潛能，通過(guò)局部移植治療SCI，自身遷移至受損部位，可以填補(bǔ)脊髓損傷后導(dǎo)致的囊性空洞及裂隙，防治或減輕脊髓損傷區(qū)域因瘢痕填充而導(dǎo)致的神經(jīng)功能的永久性喪失，通過(guò)直接分化成神經(jīng)元細(xì)胞而促進(jìn)損傷脊髓的修復(fù)[11- 12]。此外，BMSCs本身是一種支持細(xì)胞，可調(diào)控并減弱Toll樣受體- 4(toll-like receptors- 4，TLR- 4)介導(dǎo)的信號(hào)通路傳導(dǎo)，降低炎癥因子的釋放而發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用[2]。然而，隨著B(niǎo)MSCs研究深入，研究發(fā)現(xiàn)BMSCs的遷移有細(xì)胞數(shù)目飽和性，對(duì)脊髓功能恢復(fù)不能達(dá)到理想效果[13]。從BMSCs治療SCI的角度來(lái)看，如何有效使BMSCs在脊髓損傷區(qū)域中發(fā)揮作用是需要解決的問(wèn)題。

盡管BMSCs具有一定抗炎、抗凋亡作用，但其本身也極易受到各種有害因素的影響，尤其是SCI后炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生大量具有神經(jīng)毒性作用的細(xì)胞因子，不僅引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、壞死，髓鞘的變性等組織結(jié)構(gòu)改變，阻礙了神經(jīng)功能恢復(fù)，而且干擾移植BMSCs種植、遷移[10]，如何使BMSCs在脊髓損傷區(qū)域中發(fā)揮更大的作用是脊髓更好恢復(fù)的關(guān)鍵之一[9]。為了避免BMSCs濃度及計(jì)量過(guò)大造次脊髓的二次損傷，本研究中依據(jù)常規(guī)BMSCs局部注射方法[4]，BMSCs局部注射濃度為1×106/ml，劑量1 μl。

MP強(qiáng)大的抗炎作用能控制脊髓的傷后炎癥反應(yīng)，是目前臨床上治療急性SCI的首選藥物[14]。大量研究證實(shí)，MP可明顯降低TNF-α水平，減弱 TNF-α 誘導(dǎo)的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)細(xì)胞核信號(hào)傳導(dǎo)途徑下調(diào)caspase- 3等凋亡基因表達(dá)，并且強(qiáng)大的抗氧化作用可抑制急性SCI后機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生具有凋亡效應(yīng)的含氧化合物，進(jìn)一步減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡[15]。SCI早期運(yùn)用大劑量MP能極大減輕脊髓組織水腫，保護(hù)受損脊髓形態(tài)結(jié)構(gòu)及輪廓。盡管尚未有研究表明BMSCs上存在MP受體，但通過(guò)減輕局部炎癥，調(diào)節(jié)多種趨化因子受體，不僅阻礙神經(jīng)細(xì)胞的凋亡程序啟動(dòng)，挽救尚存神經(jīng)元，保護(hù)受損脊髓[16- 17]，同時(shí)也通過(guò)改善SCI后局部微環(huán)境，而減少BMSCs凋亡，進(jìn)而使其發(fā)揮替代、轉(zhuǎn)化的作用。

研究表明上述治療方法均能有效減少SCI后的炎癥反應(yīng)并減少神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)亡，但單一手段并不能真正提高療效，上述兩種手段的聯(lián)合應(yīng)用可以針對(duì)不同靶點(diǎn)進(jìn)行有效干預(yù)，從而發(fā)揮疊加或協(xié)同作用，已經(jīng)成為當(dāng)前SCI治療的新思路。

急性SCI后，繼發(fā)性炎癥反應(yīng)最開(kāi)始通過(guò)TLR- 4信號(hào)通路促進(jìn)TNF-α、IL- 1β的表達(dá)[18]。TNF-α被認(rèn)為是炎癥過(guò)程中重要啟動(dòng)因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的之間樞紐，能夠調(diào)控其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在機(jī)體遭受損傷和炎癥過(guò)程中具有重要的作用，同時(shí)在局部炎癥放大中具有重要意義[19- 20]。IL- 1β被認(rèn)為可能參與了誘導(dǎo)神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞的凋亡并造成繼發(fā)性損傷[21- 22]。本研究以TNF-α、IL- 1β作為炎癥反應(yīng)的觀測(cè)指標(biāo)，能夠較為客觀地反映出炎癥反應(yīng)的變化。結(jié)果顯示，術(shù)后14 d，MP組、BMSCs組和MP+BMSCs組的TNF-α和IL- 1β表達(dá)均較對(duì)照組明顯減少，MP+BMSCs組的TNF-α和IL- 1β表達(dá)同樣較MP組和BMSCs組明顯減少，MP組則明顯少于BMSCs組，說(shuō)明BMSCs及MP對(duì)損傷脊髓組織炎癥反應(yīng)都有一定抑制作用，且MP強(qiáng)于BMSCs。本研究還發(fā)現(xiàn)，BBB評(píng)分在術(shù)后7、14 d觀察時(shí)間段MP組和BMSCs組均明顯高于對(duì)照組，而MP+BMSCs組明顯高于其他3組，肯定了MP與BMSCs分別單獨(dú)運(yùn)用均能有效地提高神經(jīng)功能恢復(fù)，也進(jìn)一步說(shuō)明MP在協(xié)同BMSCs治療SCI中，能有效共同促進(jìn)脊髓運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。這與其他研究發(fā)現(xiàn)MP在羊胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞[23]、大鼠胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞[7]中有效提高SCI后的神經(jīng)功能恢復(fù)結(jié)果相吻合。

急性SCI后，早期炎性反應(yīng)較重，機(jī)體啟動(dòng)凋亡程序后，引起體內(nèi)相關(guān)病理生理的改變，當(dāng)BMSCs移植于受損脊髓后，有效存活的移植細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)低于預(yù)期效果。而早期MP大劑量使用在阻擋損傷區(qū)域擴(kuò)大、防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡上發(fā)揮積極作用[24]。不僅防止殘存運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元大量壞死丟失，而且恢復(fù)了脊髓組織的微環(huán)境，阻斷了炎性因子誘導(dǎo)移植BMSCs凋亡，使BMSCs釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，協(xié)助脊髓組織再生。本研究結(jié)果顯示，MP提高了BMSCs存活數(shù)，MP+BMSCs組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞在移植區(qū)域存活的數(shù)量明顯多于BMSCs組。Tan等[13]研究亦證實(shí)，阻斷IL- 6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可明顯提高BMSCs的存活率，再次證實(shí)MP在干細(xì)胞移植治療SCI中發(fā)揮著不可小覷作用。

綜上，本研究結(jié)果顯示，MP可明顯提高BMSCs移植治療SCI的大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，二者可協(xié)同降低局部TNF-α和IL- 1β表達(dá)水平，并且MP可有效提升移植BMSCs的存活，但MP在BMSCs治療SCI相關(guān)作用中的分子生物學(xué)機(jī)制及MP是否有助于BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化仍有待進(jìn)一步探索。

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RoleofMethylprednisoloneinTreatmentofSpinalCordInjuredwithBoneMarrowMesenchymalStemCellsTransplantationinRatsandItsEffectontheExpressionsofTumorNecrosisFactor-αandInterleukin- 1β

YANG Xinming1，CHENG Yaoyu2，ZHANG Zhenliang2，KANG Cong2

1Department of Orthopedics，2Graduate School，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei 075000，China

YANG Xinming Tel：0313- 8046926，E-mail：yxm1120@sohu.com

ObjectiveTo investigate the role of methylprednisolone (MP) in treatment of spinal cord injured (SCI) with bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) transplantation in rats and its effect on the expressions of tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interleukin- 1β(IL- 1β) at the local tissues.MethodsForty male Sprague-Dawley(SD) rats were used to establish the models of SCI according to the modified Allen’s contusion method and then divided into four groups (n=10 in each group) by using random numbers table：MP group，BMSCs group，BMSCs+MP group，and control group.MP was intravenously administrated immediately after SCI.BMSCs labeled by 5-bromo- 2-deoxyuridine(BrdU)were transplanted into the injured sites of spinal cord after two hours of SCI.On the 1 st，7 th，and 14th days after SCI，when functional outcome measurements were evaluated by the Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) score.On the 14th day after treatment，the spine cord tissues were harvested for the TNF-α/IL- 1β immunohistochemistry，and Tunel staining method was used to detect cell apoptosis rate.BrdU-positive BMSCs were examined in BMSCs group and BMSCs+MP group.ResultsFunctional recovery of hind limb in MP+BMSCs group was the best among the four group.On the 1 st day after injury，the BBB scores showed no significant difference among four group(χ2=1.0756，P=0.7829).On the 7th and 14th day，the BBB score of MP+BMSCs group was significantly higher than MP group (χ2=17.7186，P=0.0002；χ2= 24.7259，P<0.0001) and BMSCs group (χ2=15.8110，P=0.0024；χ2=25.6014，P<0.0001)，respectively.The BBB score of the control group was significantly lower than MP group (χ2=8.3265，P=0.0325；χ2=13.5060，P=0.0062) and BMSCs group (χ2=14.1166，P=0.0036；χ2=8.9613，P=0.0299)，respectively.On the 14th day，immunohistochemical staining presented that the TNF-α and IL- 1β-positive cells in MP+BMSCs group were significantly lower than MP group (q=5.573，P=0.0004；q=4.596，P=0.0025) and BMSCs group (q=13.780，P<0.0001；q=8.456，P<0.0001)，and control group was significantly higher than MP group (q=14.710，P<0.0001；q=6.710，P<0.0001) and BMSCs group (q=6.502，P=0.0001；q=2.849，P=0.0514).Tunel staining showed the apoptotic rate of spinal cord cells in four group were (48.47±5.70)%，(31.95±3.58)%，(41.39±2.33)%，and (23.48±2.69)%.The number of apoptotic cells in MP+BMSCs group was least in four groups；compared with the control group，the apoptotic rate significantly decreased in MP group (q=14.840，P<0.0001) and BMSCs group (q=6.716，P=0.0002)；compared with the MP+BMSCs group，the apoptotic rate was significantly increased in the MP group (q=7.332，P=0.0001) and BMSCs group (q=15.460，P<0.0001). BrdU staining revealed BrdU-positive rate in MP+BMSCs group [(9.3000±0.5175)%] was significantly higher than that in BMSCs group [(6.6000±0.3399)%](t=4.361，P=0.0004).ConclusionMP can improve the function of the hind limbs of SCI rats treated with BMSCs transplantation and lower the expressions of TNF-α and IL- 1β in injured tissue.

spinal cord injury；methylprednisolone；bone marrow mesenchymal stem cell；tumor necrosis factor-α；interleukin- 1β；BrdU stain

河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目計(jì)劃(20110176)和河北北方學(xué)院創(chuàng)新人才培育基金項(xiàng)目(CXRC1322)Support by the Key Project for Medical Science Research of Hebei Province Health Department(20110176)and the Innovative Talents Cultivation Foundation of Hebei North University(CXRC1322)

楊新明 電話：0313- 8046926，電子郵件：yxm1120@sohu.com

R318.5

A

1000- 503X(2017)05- 0615- 08

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.05.004

ActaAcadMedSin，2017,39(5)：615-622

2016- 09- 26)