梅花針叩刺增強咪喹莫特治療SKH?1小鼠皮膚鱗狀細胞癌的療效

張付賀 石磊 羅敏 劉沛 周忠霞 張國龍 王秀麗

200443上海，安徽醫(yī)科大學(xué)上海皮膚病臨床學(xué)院（張付賀、王秀麗）；上海市皮膚病醫(yī)院 同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院光醫(yī)學(xué)研究所（石磊、羅敏、劉沛、周忠霞、張國龍）

·論著·

梅花針叩刺增強咪喹莫特治療SKH?1小鼠皮膚鱗狀細胞癌的療效

張付賀 石磊 羅敏 劉沛 周忠霞 張國龍 王秀麗

200443上海，安徽醫(yī)科大學(xué)上海皮膚病臨床學(xué)院（張付賀、王秀麗）；上海市皮膚病醫(yī)院 同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院光醫(yī)學(xué)研究所（石磊、羅敏、劉沛、周忠霞、張國龍）

目的評估咪喹莫特聯(lián)合梅花針治療SKH?1小鼠皮膚鱗狀細胞癌（鱗癌）的療效，探討其免疫學(xué)機制。方法將紫外線誘導(dǎo)成瘤的40只SKH?1皮膚鱗癌小鼠隨機分4組，每組10只：對照組無處理；梅花針組：每天梅花針叩刺所有瘤體1次；咪喹莫特組：每天外涂5%咪喹莫特乳膏1次，劑量為1.2 g/kg；聯(lián)合組：先梅花針叩刺所有瘤體，止血后再外涂5%咪喹莫特乳膏1次，劑量同前。各組小鼠連續(xù)治療30 d。每日觀察并拍照記錄各組小鼠腫瘤形態(tài)學(xué)變化，每3 d測量1次瘤體大小，比較4組瘤體體積變化及小鼠生存率變化。治療結(jié)束后取各組小鼠瘤體，比較4組瘤體組織病理學(xué)變化。實時熒光定量PCR檢測各組小鼠瘤體內(nèi)干擾素（IFN）?α、IFN?β、白細胞介素1β（IL?1β）、腫瘤壞死因子α（TNF?α）及IL?12 mRNA表達。結(jié)果聯(lián)合組小鼠背部瘤體生長緩慢，部分小的瘤體有消退現(xiàn)象；對照組、梅花針組和咪喹莫特組瘤體一直在增長，但梅花針組、咪喹莫特組生長速度較對照組慢。治療前，4組小鼠瘤體體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.90，P＞0.05）。治療24 d后，4組小鼠瘤體體積差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.16，P＜0.05），LSD?t檢驗示，聯(lián)合組瘤體體積顯著低于對照組（P＜0.01），余各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)Log?rank檢驗，4組小鼠生存率曲線分布不同（χ2= 8.32，P＜0.05），聯(lián)合組生存情況優(yōu)于對照組（χ2=4.62，P=0.03），而梅花針組、咪喹莫特組與對照組、聯(lián)合組比較，小鼠生存率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。組織病理學(xué)檢查顯示，對照組、梅花針組細胞異形性明顯，排列密集，可見大量的腫瘤細胞，部分可見角化珠，咪喹莫特組腫瘤細胞少許死亡；聯(lián)合組腫瘤細胞大量死亡，核異形不明顯，角化增多。實時熒光定量PCR顯示，聯(lián)合組IFN?α、IFN?β、IL?12、IL?1β及TNF?α mRNA相對表達量均顯著高于對照組、梅花針組和咪喹莫特組（均P＜0.05），咪喹莫特組IL?1β mRNA相對表達量顯著高于對照組（P＜0.01），余各組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 梅花針叩刺能有效增強咪喹莫特抗SKH?1小鼠皮膚鱗癌活性及免疫學(xué)效應(yīng)。

腫瘤，鱗狀細胞；梅花針療法；疾病模型，動物；小鼠；咪喹莫特

目前咪喹莫特治療皮膚鱗狀細胞癌（簡稱鱗癌）已有不少臨床報道［1?4］，其通過上調(diào)單核細胞和巨噬細胞相關(guān)細胞因子，如干擾素α（IFN?α）、IFN?β、腫瘤壞死因子α（TNF?α）、白細胞介素1β（IL?1β）和IL?12等，激活天然免疫發(fā)揮抗腫瘤作用［5］。梅花針叩刺是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中一種簡單實用的治療方式，王佩茹等［6］首次采用梅花針聯(lián)合氨基酮戊酸光動力療法（ALA?PDT）治療皮膚腫瘤，發(fā)現(xiàn)其可提高ALA透皮能力，增強ALA?PDT治療光線性角化病、基底細胞癌及皮膚鱗癌的療效。我們采用梅花針叩刺輔助治療，以增加咪喹莫特的滲透深度，促進其在鱗癌組織內(nèi)均勻分布，探討其免疫調(diào)節(jié)作用及抗皮膚鱗癌療效。

材料和方法

一、試劑與儀器

5%咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司），梅花針（華佗牌單頭皮膚針），SS?03B型紫外線光療儀（上海希格瑪高科技有限公司），F(xiàn)unglyn FTC? 3000實時熒光定量PCR儀［加拿大楓嶺生物技術(shù)（上海）有限公司］。

二、鱗癌動物模型建立

皮膚正常的6～8周雌性SKH?1無毛小鼠（從美國Jakson動物實驗中心引進，由上海公共衛(wèi)生中心負責(zé)繁育），體質(zhì)量30 g左右，于20℃～24℃下給予普通飼料和水飼養(yǎng)。照射光源為SS?03B型紫外線光療儀（只含10%UVB和90%UVA），待輸出功率穩(wěn)定后，每次取1籠小鼠（每籠5只），在光源距小鼠背部30 cm處照射，劑量為最小紅斑量（每天UVB 240 mJ/cm2和UVA 2 160 mJ/cm2），每周連續(xù)照射5 d，直至背部出現(xiàn)紅斑、丘疹（約6個月），當(dāng)丘疹直徑≥1 mm且持續(xù)2周不消退，即為成功建立SKH?1無毛小鼠皮膚鱗癌模型［7］。

三、實驗動物分組及處理

選取成功構(gòu)建的多發(fā)性皮膚鱗癌模型小鼠40只，體質(zhì)量27～31 g，瘤體直徑3～5 mm，且瘤體生長均勻。依次對小鼠斷趾標記，隨機數(shù)字表法分4組，每組10只。對照組：不做任何處理；梅花針組：用梅花針垂直均勻叩刺小鼠背部所有瘤體，直至瘤體出現(xiàn)點狀出血，每天1次；咪喹莫特組：所有瘤體外涂咪喹莫特乳膏，輕柔至充分吸收，每天1次，劑量為1.2 g/kg；聯(lián)合組：先采用梅花針叩刺，處理同梅花針組，然后用生理氯化鈉溶液浸濕棉簽擦拭血跡并壓迫止血后，所有瘤體外涂咪喹莫特乳膏，輕柔至藥物充分吸收，每天1次，各組小鼠連續(xù)治療30 d。

四、療效判定

1.瘤體變化及生存情況：每天用相機采集小鼠背部大體照片，觀察各組小鼠腫瘤形態(tài)學(xué)變化。每3 d測量瘤體體積，計數(shù)直徑≥1.0 mm的瘤體數(shù)目，以精密電子游標卡尺測量瘤體的最大長徑（a）和垂直短徑（b），瘤體體積=ab2/2，計算每只小鼠背部所有直徑≥1.0 mm的瘤體體積之和，繪制瘤體體積變化曲線。小鼠死亡的判定標準依據(jù)腫瘤的長徑＞15 mm或小鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)或潰瘍［8］。當(dāng)小鼠死亡時瘤體體積不再計算，末次治療結(jié)束后統(tǒng)計小鼠的生存率。

2.組織病理學(xué)檢查：末次治療后，各組隨機取1只小鼠，用7%水合氯醛麻醉后，頸椎脫臼法處死。用6 mm環(huán)鉆鉆取皮膚荷瘤小鼠局部治療區(qū)域的瘤體，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察腫瘤組織病理學(xué)變化。

3.實時熒光定量PCR檢測IFN?α、IFN?β、TNF?α、IL?1β和IL?12 mRNA的表達：另取12只成瘤小鼠，隨機數(shù)字表法分4組，每組3只，各組處理方法同前。各組小鼠開始治療后72 h，取治療部位腫瘤組織并提取RNA，分別設(shè)計各目的基因IFN?α、IFN?β、TNF?α、IL?1β、IL?12特異性引物，引物序列見表1。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成反轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核苷酸（cDNA），按qPCR試劑盒說明書擴增目的條帶。實驗重復(fù)3次。采用Thermal cycler軟件包計算Ct值，分析熒光強度。各促炎性因子mRNA相對表達量用2-ΔΔCt表示。

表1 實時熒光定量PCR擴增引物序列

五、統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5軟件進行分析。計量資料均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩多重比較用LSD?t檢驗，兩組間生存率的比較用Log?rank檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、小鼠瘤體形態(tài)及體積變化

圖1 4組SKH?1無毛鱗狀細胞癌小鼠腫瘤形態(tài)變化 對照組小鼠背部瘤體逐漸增大、增多；梅花針組和咪喹莫特組瘤體增長緩慢；聯(lián)合組瘤體生長緩慢，部分小瘤體有消退現(xiàn)象

4組小鼠腫瘤形態(tài)學(xué)變化見圖1。聯(lián)合組小鼠背部瘤體生長緩慢，部分小的瘤體有消退現(xiàn)象；對照組、梅花針組和咪喹莫特組瘤體一直在增長。4組小鼠瘤體體積隨時間變化曲線見圖2。對照組瘤體生長最快，咪喹莫特組、梅花針組瘤體生長較對照組緩慢，聯(lián)合組瘤體增長最慢。單因素方差分析顯示（表2），4組小鼠治療前瘤體體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.90，P＞0.05），治療24 d后差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.16，P＜0.05）；LSD?t檢驗示，聯(lián)合組瘤體體積顯著低于對照組（P＜0.01），余各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 4組SKH?1無毛鱗狀細胞癌小鼠瘤體體積隨時間變化曲線 對照組瘤體體積生長最快，咪喹莫特組、梅花針組生長較對照組緩慢，聯(lián)合組增長最慢

表2 4組SKH?1無毛鱗狀細胞癌小鼠治療前和治療24 d時瘤體體積變化（±s，mm3）

表2 4組SKH?1無毛鱗狀細胞癌小鼠治療前和治療24 d時瘤體體積變化（±s，mm3）

注：n=3。a：與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05；其余各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義

組別對照組梅花針組咪喹莫特組聯(lián)合組F值P值只數(shù)10 10 10 10治療前79.26±29.90 108.06±48.46 97.06±63.14 76.83±31.92 0.90 0.48治療后1 258.79±430.27 675.25±209.85 557.17±207.41 246.90±118.22a 5.16＜0.05

二、小鼠生存情況

對照組小鼠在實驗開始后的第15、19天各死亡1只，第21天死亡3只，第25天全部死亡；咪喹莫特組第17、28天各死亡2只；梅花針組第11、18、28天各死亡2只，第30天全部死亡；聯(lián)合組觀察30 d無死亡。經(jīng)Log?rank檢驗，4組小鼠生存率曲線分布不同（圖3，χ2=8.32，P＜0.05）。兩兩比較顯示，聯(lián)合組小鼠生存情況優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.62，P=0.03），而梅花針組、咪喹莫特組與對照組、聯(lián)合組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖3 4組SKH?1無毛鱗狀細胞癌小鼠生存率變化曲線 聯(lián)合組小鼠生存情況明顯優(yōu)于對照組

三、組織病理學(xué)

圖4 4組SKH?1無毛鱗狀細胞癌小鼠治療結(jié)束后腫瘤組織HE染色（4A～4D：HE×20；4E～4H：HE×100） 對照組、梅花針組細胞異形性明顯，排列密集，可見大量的腫瘤細胞，部分可見角化珠；咪喹莫特組腫瘤細胞少許死亡，瘤周伴炎細胞浸潤；聯(lián)合組腫瘤細胞大量死亡，核異形不明顯，角化增多

表3 各組SKH?1無毛鱗狀細胞癌小鼠開始治療72 h后細胞因子mRNA相對表達量（±s）

表3 各組SKH?1無毛鱗狀細胞癌小鼠開始治療72 h后細胞因子mRNA相對表達量（±s）

注：IFN：干擾素；IL：白細胞介素；TNF：腫瘤壞死因子

組別對照組梅花針組咪喹莫特組聯(lián)合組F值P值只數(shù)3 3 3 3 IFN?α 0.40±0.47 0.79±0.64 0.70±0.58 9.25±2.14 195.10＜0.0001 IFN?β 0.44±0.27 1.19±0.25 0.61±0.53 11.04±0.36 585.10＜0.0001 IL?1β 1.05±0.33 1.50±0.10 2.19±0.08 13.4±0.57 923.10＜0.0001 IL?12 0.70±0.17 1.51±0.24 2.03±0.27 10.61±1.97 63.74＜0.0001 TNF?α 0.66±0.10 1.44±0.43 2.37±1.02 7.66±3.05 21.27＜0.0004

各組小鼠治療結(jié)束后，切取腫瘤HE染色。對照組見大量的鱗癌細胞，伴明顯的核異形，浸潤明顯，較少角化；梅花針組、咪喹莫特組腫瘤細胞間可見大量的炎癥細胞浸潤，伴核異形；聯(lián)合組核異形不明顯，角化明顯。見圖4。

四、各組小鼠細胞因子mRNA變化

單因素方差分析顯示，4組IFN?α、IFN?β、IL?12、IL?1β及TNF?α mRNA相對表達量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。經(jīng)LSD?t檢驗，聯(lián)合組IFN?α、IFN?β、IL?12、IL?1β及TNF?α mRNA相對表達量均高于對照組、梅花針組和咪喹莫特組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；咪喹莫特組IL?1β mRNA相對表達量高于對照組（P=0.005）；其余各組間細胞因子mRNA相對表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

討論

梅花針叩刺是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)一種簡單實用的治療方式，我們的研究證實，咪喹莫特聯(lián)合梅花針治療小鼠多發(fā)性皮膚鱗癌有一定療效。5%咪喹莫特乳膏治療皮膚原位鱗癌已證明有效［9］。雖然侵襲性皮膚鱗癌最好的治療方法是手術(shù)切除，但外用5%咪喹莫特乳膏可能是一個合理的替代方法，尤其對老年及身體狀況較差的患者［1］。

本研究結(jié)果顯示，單純梅花針叩刺或外涂咪喹莫特稍能延緩小鼠瘤體體積增長，提高小鼠生存率，而聯(lián)合組與其余三組相比，能明顯延緩小鼠瘤體體積增長，顯著提高小鼠生存率。組織病理學(xué)顯示，對照組、梅花針組細胞異形性明顯，無腫瘤細胞死亡，咪喹莫特組腫瘤細胞少許死亡、部分角化，而聯(lián)合組腫瘤細胞大量死亡，核異形不明顯，角化增多，提示咪喹莫特聯(lián)合梅花針可更好地清除小鼠皮膚鱗癌。有文獻［10］報道，咪喹莫特治療皮膚腫瘤72 h后，參與天然免疫的細胞因子如IFN?α、IFN?β、TNF?α、IL?1β表達量顯著升高。本研究在各組小鼠開始治療后72 h實時熒光定量PCR顯示，聯(lián)合組IFN?α、IFN?β、TNF?α、IL?1β和IL?12細胞因子mRNA相對表達量顯著高于其他3組。其可能的機制是咪喹莫特誘導(dǎo)腫瘤細胞釋放腫瘤抗原，募集大量的炎癥細胞因子到腫瘤部位，直接殺傷腫瘤細胞；咪喹莫特還可通過誘導(dǎo)IFN?α、IFN?β、TNF?α、IL?12等促炎細胞因子的分泌，活化樹突細胞、巨噬細胞和其他與Toll樣受體7（TLR?7）結(jié)合的細胞，從而激活天然免疫反應(yīng)［5，11］；咪喹莫特在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)天然免疫細胞分泌的趨化因子如IL?1β、IL?12和IFN，引起腫瘤表面的死亡受體和死亡受體配體的暴露或分泌上調(diào)，增強對腫瘤細胞的殺傷作用［12］。本研究中，聯(lián)合組中各種免疫相關(guān)的細胞因子表達最高，更加佐證了梅花針叩刺增加藥物滲透深度，增強了招募炎性細胞因子的能力。

有報道外涂咪喹莫特可治愈表淺皮膚鱗癌［2?4］，本研究中SKH?1小鼠皮膚鱗癌生長迅速，以致于外涂咪喹莫特，即便聯(lián)合梅花針也未能完全治愈。但本研究顯示，梅花針叩刺輔助給藥能有效增強咪喹莫特抗SKH?1小鼠皮膚鱗癌活性及免疫學(xué)效應(yīng)。

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Plum?blossom needle tapping enhances the efficacy of topical imiquimod immunotherapy for cutaneous squamous cell carcinoma in SKH?1 mice

Zhang Fuhe,Shi Lei,Luo Min,Liu Pei,Zhou Zhongxia,Zhang Guolong,Wang Xiuli
Shanghai Skin Disease Clinical College of Anhui Medical University,Shanghai 200443,China（Zhang FH,
Wang XL）;Shanghai Skin Disease Hospital,Institute of Photomedicine,Tongji University School of Medicine,

Wang Xiuli,Email:wangxiuli20150315@163.com

ObjectiveTo assess the therapeutic effect of plum?blossom needle tapping combined with topical imiquimod immunotherapy on cutaneous squamous cell carcinoma（SCC）in SKH?1 mice,and to explore the immunological mechanism.MethodsA total of 40 SKH?1 mice with ultraviolet light?induced cutaneous SCC were randomly and equally divided into 4 groups:control group receiving no treatment,plum?blossom needle group receiving plum?blossom needle tapping on all the tumors once a day, imiquimod group topically treated with imiquimod 5%cream at a dose of 1.2 g/kg once a day,combination group firstly treated with plum?blossom needle tapping on all the tumors,and after the stop of bleeding topically treated with imiquimod 5%cream at the same dose as the imiquimod group once a day.All the mice were treated for 30 days.Morphological changes of tumors in all groups were photographed and recorded every day.The tumor size was measured once every three days,and changes of total tumor volume and survival rate of the mice were compared among the 4 groups.At the end of treatment,tumor tissues were resected,and histopathological changes were compared among the 4 groups.Real?time fluorescence?based quantitative PCR（qRT?PCR）was performed to measure the mRNA expression of interferon?α（IFN?α）, IFN?β,interleukin?1β（IL?1β）,tumor necrosis factor?α（TNF?α）and IL?12 in tumor tissues.ResultsIn the combination group,tumors on the back of mice grew slowly,and some even regressed.However,tumors grew fast in the control group,plum?blossom needle group and imiquimod group,and grew more slowly in the plum?blossom needle group and imiquimod group than in the control group.Before the treatment,there was no significant difference in the total tumor volume among the 4 groups（F=0.90,P＞0.05）.After 24?day treatment,the total tumor volume significantly differed among the 4 groups（F=5.16,P＜0.05）.The LSD?ttest showed that the total tumor volume significantly decreased in the combination group compared with the control group（P＜0.01）,but no significant difference was observed among the other groups（P＞0.05）.Log?rank test revealed that survival curves significantly differed among the 4 groups（χ2=8.32,P＜0.05）.The survival rate was significantly higher in the combination group than in the control group（χ2= 4.62,P=0.03）,but did not differ between the plum?blossom needle group or imiquimod group and the control group or combination group（allP＞0.05）.Histopathological examination showed atypical cells arranged closely,a large number of tumor cells and some keratin pearls in the control group and plum?blossom needle group,few dead tumor cells in the imiquimod group,and plenty of dead tumor cells,mild nuclear atypia and increased keratinization in the combination group.qRT?PCR revealed that the relative mRNA expression levels of IFN?α,IFN?β,IL?12,IL?1β and TNF?α were significantly higher in the combination group than those in the control group,plum?blossom needle group and imiquimod group（P＜0.05）.The imiquimod group showed significantly higher mRNA expression of IL?1β than the control group（P＜0.01）,but no significant differences were observed among the other groups（P＞0.05）.ConclusionPlum?blossom needle tapping can effectively enhance the anti?SCC activity and immunological effects of imiquimod in SKH?1 mice.

Neoplasms,squamous cell;Imiquimod;Plum?blossom needle therapy;Disease models, animal;Mice;Imiquimod

王秀麗，Email：wangxiuli20150315@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.04.009

國家自然科學(xué)基金（81601601）；上海市衛(wèi)計委科研課題（201640016）；上海市青年科技英才揚帆計劃項目（15YF1410700）；上海申康醫(yī)院發(fā)展中心臨床科技創(chuàng)新項目（SHDC12015123）

Shanghai 200443,China（Shi L,Luo M,Liu P,Zhou ZX,Zhang GL）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81601601）;Key Project of Shanghai Municipal Health and Family Planning Commission（201640016）;Yang Fan Program of Science and Technology Commission of Shanghai Municipality（15YF1410700）;The Joint Project of New Frontier Technology of Shanghai Shen-kang Hospital Development Center（SHDC12015123）

2016?06?16）

（本文編輯：周良佳 顏艷）