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    261例G6PD缺乏癥患兒基因突變型與血型關(guān)系的探討

    2017-11-02 03:01:58譚忠友余超
    關(guān)鍵詞:缺乏癥O型血型

    譚忠友,余超

    (重慶三峽中心醫(yī)院婦兒醫(yī)院兒內(nèi)一科,重慶 萬州 404000)

    261例G6PD缺乏癥患兒基因突變型與血型關(guān)系的探討

    譚忠友,余超

    (重慶三峽中心醫(yī)院婦兒醫(yī)院兒內(nèi)一科,重慶 萬州 404000)

    目的初步探討ABO血型與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenas,G6PD)缺乏癥基因突變型的交互作用及分析。方法從G6PD缺乏癥患者中,運用二代測序技術(shù)篩選出G1388A、G1376T、A95G點突變的患者;血清學(xué)方法檢測血型。應(yīng)用SPSS 21.0軟件對結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果355例缺乏癥患者中檢出261例基因突變,突變檢出率為73.5%;且基因突變型在ABO血型的血型分布上有顯著差異(P<0.05),具有相關(guān)性。結(jié)論ABO血型與G6PD缺乏癥基因突變型之間存在交互關(guān)系。

    ABO血型;G6PD缺乏癥;基因突變

    葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenas,G6PD)缺乏癥是一種紅細(xì)胞酶缺陷疾病,也是最常見的遺傳性血液病之一[1]。本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上[2],從重慶市萬州區(qū)三峽中心醫(yī)院355例G6PD缺乏癥患者中利用二代測序技術(shù),篩選了G6PD缺陷并伴有點突變型的261例患者病例,并首次通過血型分組對G6PD缺乏癥患者血型與基因突變型之間的相互關(guān)系進(jìn)行分析,同時也初步探索了ABO血型與G6PD基因突變型間的潛在關(guān)聯(lián);為進(jìn)一步明確這種疾病的發(fā)病機制及預(yù)防提供新的思路。

    1 材料與方法

    1.1一般資料

    收集重慶三峽中心醫(yī)院從2009年7月至2013年7月收治的G6PD缺乏癥的355例診斷符合《血液病診斷與療效標(biāo)準(zhǔn)》[3]的患兒基本資料。二代測序技術(shù)二次篩選出G6PD缺乏癥并伴有3種已知突變,即G1388A,G1376T,A95G,共計261例患兒,且排除其他疾病者。常規(guī)ABO血型檢測方法測定ABO血型。所有檢測均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。所有患兒均使用外周靜脈血2~3 mL,并采用EDTA-K3抗凝,4 ℃保存?zhèn)溆???鼓尤隚6PD和6PGD反應(yīng)液,混勻置于37 ℃進(jìn)行水浴,20 min后終止反應(yīng)。全自動生化測定儀進(jìn)行吸光度值測量,得到G6PD和6PGD各自的值,并計算比值。G6PD缺乏癥診斷標(biāo)準(zhǔn):G6PD/6PGD<1.0。將261例伴G1388A,G1376T,A95G突變型的患者根據(jù)ABO血型的不同,分為A、B、O、AB4組。所有患兒均通過臨床檢查和實驗室檢查。本次研究與檢測均通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),并獲得患兒法定監(jiān)護(hù)人的知情同意書。

    1.2第二代基因測序技術(shù)

    針對G6PD全外顯子上下游50 bp,采用Primer 5.0設(shè)計進(jìn)行引物設(shè)計樣本首先按照Lahiri法[4]進(jìn)行DNA制備,并用PCR檢測1 388G→A,1 376G→T,95A→G突變。本次實驗采用20 μL 反應(yīng)體系,其中模板DNA1 μL, 兩對引物各200 nmol/L,2×TaqMan Universal PCRMaster Mix10 μL。熱循環(huán)條件為:95 ℃ 4 min,然后95 ℃ 15 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共循環(huán)30次,72 ℃ 7 min。取PCR產(chǎn)物8 μL與溴酚藍(lán)染液1 μL混合,產(chǎn)物用2.5%的瓊脂糖凝膠(瓊脂糖含有濃度為2%的Gelred 的染料)電泳(100 V,20~45 min)進(jìn)行分析,并在紫外成像儀下顯色,在ABI PRISM 377型測序儀分析測序結(jié)果進(jìn)行測序分析。具體技術(shù)操作由上海凡迪生物有限公司進(jìn)行操作。

    1.3 ABO血型鑒定

    使用采集的EDTA-K2抗凝全血2 mL,按檢驗操作步驟即生理鹽水稀釋并取適量的紅細(xì)胞懸液滴于盛有A型或B型標(biāo)準(zhǔn)血清的血型卡和玻璃試管中混勻,在室溫下放置15~30 min后,在低倍鏡下觀察有無凝集現(xiàn)象。

    1.4統(tǒng)計學(xué)分析

    測序結(jié)果用生物信息學(xué)軟件Splice View進(jìn)行突變分析,并運用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,G6PD缺乏癥基因突變型與ABO血型的關(guān)系運用χ2檢驗,P<0.05,即表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    在此次篩查的355例G6PD缺乏癥患兒中(年齡為1~166個月,男性336例,女性19例,漢族352例,苗族1例,土家族2例),其中有261例G6PD缺乏癥患兒在利用突變特異性擴增系統(tǒng)(ARMs)篩查被發(fā)現(xiàn)存在G1388A、G1376T、A95G261基因突變型,突變檢出率約73.5%。而在這261例G6PD缺乏癥伴有基因突變型的患兒中,男248例,女13例,男女比例為19.07∶1; 伴有G1388A突變型有127例(48.7%),G1376T突變型有99例(37.9%),A95G35例(13.4%)。此外,從結(jié)果中研究者首次觀察到,在261例G6PD缺乏癥且伴有基因突變的患兒中,A型血患兒存在突變者占88例(33.7%),B型患兒存在血突變者為60例(23.0%),AB型血患兒存在突變者有23例(8.8%); O型血的患兒存在突變者90例(34.5%),以O(shè)型血基因突變型占的比率最多。此外,結(jié)果還顯示261例G6PD缺乏癥并伴有基因突變型患者在ABO血型的血型分布上有顯著差異(P<0.05),具有相關(guān)性(表1)。

    表1 261 例G6PD缺乏癥基因突變型患者ABO血型分布比較

    注:G6PD缺乏癥并伴有基因突變型患者與ABO血型分布的關(guān)系,用相關(guān)性交叉表和卡方檢驗,P=0.045。

    3 討論

    葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺陷是一種潛在、致病的遺傳酶異常;它本身是1種廣泛表達(dá)的酶,在多種細(xì)胞中擔(dān)任“管家”的角色,尤其在紅細(xì)胞(RBCs)中,對其完整性和功能性尤為關(guān)鍵[5]。G6PD缺乏會選擇性影響RBCs,導(dǎo)致的紅細(xì)胞酶性改變;以致不能夠抵御氧化損傷而遭受破壞而引起的溶血性貧血[6]。全世界迄今已報道了370種以上的G6PD變異型,而在中國人群已經(jīng)被鑒定出的31種點突變中,以G1388A、G1376T和A95G為最多的突變類型[2,7]。題組在前期回顧性的調(diào)查了重慶地區(qū)G6PD缺乏癥患兒的臨床資料,并對其誘因、發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)、實驗室檢查、治療及預(yù)后進(jìn)行分析[8]。結(jié)果顯示,重慶地區(qū)G6PD缺乏癥以點突變G1388A占38.6%(125/355),G1376T占31.2%(101/355),A95G占10.8%(35/355)為3種最為主要的突變型。有報道,此三基因突變型的患者G6PD活性僅為正常人的5%~18%[9]。

    目前存在多種診斷G6PD缺乏的方法,盡管G6PD活性檢測是1種較為常用的定量檢測方法,但利用檢測G6PD和6PGD活性之定量比值與G6PD進(jìn)行臨床診斷的高準(zhǔn)確率會大大提高。因此在此次試驗中,研究者首先根據(jù)G6PD缺乏癥診斷標(biāo)準(zhǔn):G6PD/6PGD<1.0,將比值在此范圍內(nèi)的患兒納入后期的檢測對象。

    血型是人類重要的遺傳表型,常見的有ABO血型系統(tǒng),Rh血型系統(tǒng),MN血型系統(tǒng)等[10]。其中,對于ABO血型的研究源于上世紀(jì),它是人類最常見和比較容易獲得的一種穩(wěn)定性遺傳特征之一,通過對它的研究對于某些疾病遺傳傾向及易感性的了解都具有重要意義[9-10]。關(guān)于ABO血型系統(tǒng)的分子研究源于上世紀(jì)90年代,它是第一個被描述的紅細(xì)胞血型系統(tǒng),也是最具有臨床意義的一個系統(tǒng)[10]。1974年,Lesho等[11]在研究G6PD缺陷是否與ABO血型存在相關(guān)性時,就發(fā)現(xiàn)在非洲和亞洲人群中,O型血的發(fā)病率較高,但沒有足夠的數(shù)據(jù)顯示G6PD缺陷與ABO血型分布之間存在相關(guān)性。近來,通過血型和疾病的關(guān)聯(lián)來詮釋一種疾病的機制,逐漸再次成為遺傳醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的熱點和手段。許多疾病的潛在機制,都是在遺傳學(xué)的研究中得以突破。對于血型的研究有助于對先天性、家族性、自身免疫性以及不明原因疾病的遺傳傾向或者易感性有深入的了解。G6PD缺乏癥本身是一種遺傳性紅細(xì)胞酶缺陷??;隨著分子生物及測序技術(shù)的發(fā)展,使研究者對于G6PD缺陷基因突變的多態(tài)性及遺傳分布有了更進(jìn)一步的了解,這些都有助于對G6PD缺乏癥的潛在機制尋找新的證據(jù);所以在前期大量的篩查工作之后,研究者首次探索了G6PD缺乏癥基因突變與血型分布的關(guān)聯(lián)趨勢以及分布特點。在本次試驗中,研究者從355例臨床診斷為G6PD缺乏癥的患兒中,篩選出伴有G1388A,G1376T,A95G突變的261例 ,通過臨床檢查和實驗室檢查,將這些患者根據(jù)ABO血型,分為A、B、O、AB四組進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示,261例G6PD缺乏癥并存在G1388A、G1376T、A95G基因突變的患兒中,男性患兒顯著多于女性,這與劉麗紅等[12]研究結(jié)果一致。此外,在男、女性G6PD缺乏癥伴有基因突變的患者中均為O型血最多,A型血其次,表明O型血G6PD缺乏癥的患兒可能存在基因突變可能性和潛在風(fēng)險更大,這對臨床診斷G6PD缺乏癥患兒有一定指導(dǎo)作用。至于O性患者G6PD突變頻率較高的機理目前尚不清楚,目前國內(nèi)外文獻(xiàn)未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)報道。李錫福等[13]在一項關(guān)于G6PD缺乏與新生兒性別和血型關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn),O型血的新生兒G6PD缺乏顯著多于其它血型的新生兒,這與此次結(jié)果是一致的。與李等的研究所不同的是,此次研究中首次將我國主要的基因突變型納入分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)血型因素與G6PD缺陷基因突變型之間存在關(guān)聯(lián)。

    G6PD缺乏癥臨床上主要的急性表現(xiàn)為溶血性貧血及高膽紅素血癥,不僅會影響智力發(fā)育,嚴(yán)重者還可發(fā)生黃疸甚至導(dǎo)致死亡。對于G6PD缺乏癥的研究目標(biāo)主要在于早期干預(yù),防止急性癥狀的發(fā)生。本研究在確診G6PD缺乏癥的患兒中,篩選了伴有基因突變型的病例,進(jìn)行與血型的交互關(guān)系分析,結(jié)果對G6PD缺乏癥的預(yù)防及易感因素都提供了新的信息。

    [1] 林芬,楊輝楊,楊立業(yè),等.我國葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的分布特征和基因突變[J].分子診斷與治療雜志,2016,8,(2):73-75.

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    Investigationofrelationshipbetweenmutationgenotypeandbloodgroupin261patientswithglucose-6-phosphatedehydrogenasedeficiency

    TAN Zhong-you,YU Chao

    (DepartmentofInternalMedicine,WomenandChildren’sHospitalofChongqingThreeGorgesCentralHospital,Wanzhou404000,Chongqing,China)

    Objective:To study the interaction between mutation genotype and ABO blood group in 261 patients with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.MethodsThe second generation sequencing technology was used to identify 261 patients with G6PD deficiency and G1388A、G1376T、A95G mutations.Blood groups were detected with serological method.The interaction effect between blood group and gene mutation was analyzed by SPSS 21.0.ResultsMutations occurred in 261 of 355 patients with G6PD deficiency,the mutation rate was 73.5%.There was a significant difference the blood type distribution of ABO blood group and gene mutation (P<0.05).ConclusionThere is synergistic action between ABO blood group and mutation genotype in G6PD deficiency.

    ABO blood group;G-6-PD deficiency;Gene mutation.

    10.3969/j.issn.1005-3697.2017.05.018

    重慶市萬州區(qū)科研基金資助項目(201403019)

    2017-06-03

    譚忠友(1975-),男,副主任醫(yī)師。

    余超,E-mail:442809156@qq.com

    時間: 2017-10-10 02∶28

    http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20171010.0228.038.html

    1005-3697(2017)05-0712-03

    R722.1

    A

    (學(xué)術(shù)編輯劉云)

    本刊網(wǎng)址:http://www.nsmc.edu.cn作者投稿系統(tǒng)http://noth.cbpt.cnki.net郵箱xuebao@nsmc.edu.cn

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