黑果枸杞多糖對(duì)中波紫外線誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞光損傷的保護(hù)作用

任立汆 加楊娥 燕華玲 王永 郭硯 哈筱梅 朱世文 王剛810000西寧，青海大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科

·論著·

黑果枸杞多糖對(duì)中波紫外線誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞光損傷的保護(hù)作用

任立汆 加楊娥 燕華玲 王永 郭硯 哈筱梅 朱世文 王剛810000西寧，青海大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科

目的探討黑果枸杞多糖對(duì)HaCaT細(xì)胞光損傷的預(yù)防作用及機(jī)制。方法采用超聲輔助水提法提取柴達(dá)木黑果枸杞中的多糖成分。體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞分為3組，對(duì)照組：正常培養(yǎng)，不做其他處理；中波紫外線（UVB）組：30 mJ/cm2UVB照射；實(shí)驗(yàn)組：30 mJ/cm2UVB照射前6 h加入2 g/L黑果枸杞多糖溶液。照射1 h后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，MTS法測(cè)定細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率，酶標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞丙二醛和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活力，ELISA法檢測(cè)上清液和細(xì)胞中白細(xì)胞介素1（IL?1）和腫瘤壞死因子α（TNF?α）水平。結(jié)果與對(duì)照組相比，UVB組細(xì)胞形態(tài)模糊不清，出現(xiàn)死亡漂浮現(xiàn)象；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞腫脹，但形態(tài)尚清楚。MTS結(jié)果顯示，3組間細(xì)胞增殖吸光度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=48.88，P＜0.01），其中UVB組（1.72±0.12）顯著低于對(duì)照組（2.34±0.11），實(shí)驗(yàn)組（2.11±0.10）又顯著高于UVB組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。UVB組細(xì)胞凋亡率（82.41%±2.49%）顯著高于對(duì)照組（3.98%±0.19%）和實(shí)驗(yàn)組（22.79%±0.97%），實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。UVB組與對(duì)照組比較，丙二醛含量明顯上升，SOD活性、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶含量、CAT活性明顯下降（均P＜0.05）。同時(shí)，UVB組較對(duì)照組上清液中IL?1和TNF?α含量及細(xì)胞中TNF?α含量均明顯升高（均P＜0.05），但細(xì)胞中IL?1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論黑果枸杞多糖對(duì)HaCaT細(xì)胞的光損傷有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與減少細(xì)胞炎癥物質(zhì)的合成和分泌及減少自由基有關(guān)。

枸杞；多糖類；角蛋白細(xì)胞；紫外線；氧化性應(yīng)激；白細(xì)胞介素1；腫瘤壞死因子α

柴達(dá)木黑果枸杞生長(zhǎng)于青海柴達(dá)木盆地海拔2 600～3 000 m沙漠地帶，系茄科枸杞屬，可食用可入藥，《晶珠本草》中記載黑果枸杞用于治療心臟病、停經(jīng)等病癥［1］。已有研究證實(shí)［2?6］，黑果枸杞中富含花色素，可以消除自由基，抗氧化。黑果枸杞多糖是黑果枸杞果實(shí)中發(fā)揮生物學(xué)作用的重要成分之一，目前研究大多集中在降血糖、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫等方面，抗衰老、抗氧化方面研究較少。中波紫外線（UVB）是引起皮膚光老化的主要因素，我們探討黑果枸杞多糖對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞光損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

材料與方法

一、主要試劑及儀器

柴達(dá)木黑果枸杞（青海某茶行），HaCaT細(xì)胞（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。胎牛血清、DMEM［英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司］，雙抗、胰酶、MTS比色法試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），細(xì)胞丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH?Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所），腫瘤壞死因子α（TNF?α）試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司），人白細(xì)胞介素1（IL?1）試劑盒（北京城林生物科技有限公司），X?Mark型BIO?RAD酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO?RAD公司），TL20W/12紫外線UVB燈管（荷蘭Philips公司），UVB輻照度監(jiān)示器（臺(tái)灣路昌電子企業(yè)股份有限公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.黑果枸杞多糖的提?。悍Q取干燥后粉碎的黑果枸杞粉末50 g，加三氯甲烷∶甲醇（2∶1）500 ml，60℃回流脫脂2次，每次40 min；過(guò)濾后濾渣加入80%乙醇500 ml，70℃回流脫小分子糖、苷類物質(zhì)及黃酮類物質(zhì)2 h，重復(fù)2次；濾渣中加入蒸餾水（液固比20∶1），72 ℃、200 W超聲30 min，重復(fù)3次，收集上清液；旋轉(zhuǎn)減壓濃縮上清液后加入95%乙醇至濃度為80%，攪拌，4℃過(guò)夜。6 000×g離心10 min，將沉淀再溶于蒸餾水中，即得粗多糖溶液。加入粗多糖溶液20%體積的Sevag試劑（三氯甲烷∶正丁醇=5∶1），振蕩20 min，6 000 ×g離心10 min，收集上清液，重復(fù)3次。上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，獲得枸杞多糖粉末。

2.黑果枸杞多糖含量測(cè)定：①制備對(duì)照品溶液：精密稱取干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品50 mg，加蒸餾水至50 ml，搖勻，即得1 g/L的對(duì)照品溶液；②待測(cè)溶液的配制：精確稱取黑果枸杞多糖粉末50 mg，加蒸餾水至50 ml，搖勻，即得待測(cè)溶液；③確定最大吸收波長(zhǎng)：精確吸取對(duì)照品溶液和待測(cè)溶液各1.0 ml，加入5%苯酚溶液1 ml，搖勻，迅速加入濃硫酸5 ml，混勻，室溫靜置30 min待其冷卻。以蒸餾水為空白組，在400～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)使用酶標(biāo)儀分別掃描對(duì)照品和待測(cè)溶液，確定最大吸收波長(zhǎng)為485 nm；④繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別精確吸取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5 ml，加雙蒸水至50 ml，在485 nm波長(zhǎng)下測(cè)各濃度葡萄糖的吸光度（A值），做葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=5.96 x+0.1163，R2=0.9978）；⑤測(cè)定多糖的含量：分別精確移取枸杞多糖溶液1 ml，蒸餾水定容于25 ml容量瓶，吸取1 ml枸杞多糖溶液，在485 nm下測(cè)A值，由回歸方程計(jì)算多糖含量為0.3 mg，所得粉末中黑果枸杞多糖含量為30%。以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基為溶劑配制黑果枸杞多糖溶液，并用0.22 μm孔徑過(guò)濾器過(guò)濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3.細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組：以含10%胎牛血清的DMEM為培養(yǎng)基（含10 U/ml青霉素和10 U/ml鏈霉素），將HaCaT細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。當(dāng)HaCaT細(xì)胞達(dá)到85%～90%融合時(shí)，將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞按每孔1×106個(gè)細(xì)胞分別鋪板到96孔板或6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，將HaCaT細(xì)胞隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組（正常培養(yǎng)，不做其他處理）、UVB組（30 mJ/cm2UVB照射）和實(shí)驗(yàn)組（2 g/L黑果枸杞多糖溶液+30 mJ/cm2UVB照射）。實(shí)驗(yàn)組于UVB照射前6 h將2 g/L黑果枸杞多糖溶液加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，對(duì)照組用錫紙包住置暗處。照射前，打開UVB組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞培養(yǎng)板蓋，在預(yù)設(shè)好的UVB輻射儀中照射1 h，然后用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3遍，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

UVB劑量選擇：96孔板內(nèi)HaCaT細(xì)胞達(dá)到80% ～90%融合時(shí)，在室溫下，分別采用0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 mJ/cm2UVB照射細(xì)胞，照射后均培養(yǎng)12 h，MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖率。以未照射組細(xì)胞增殖率為100%，計(jì)算各組細(xì)胞增殖率，增殖率 =［1-（A對(duì)照組-A照射組）/A對(duì)照組］× 100%，選擇增殖率為50%的實(shí)驗(yàn)組的UVB照射劑量為實(shí)驗(yàn)劑量，即30 mJ/cm2。

黑果枸杞多糖溶液濃度選擇：加入含不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 g/L）黑果枸杞多糖的培養(yǎng)基6 h后，吸出各組培養(yǎng)基，用少量無(wú)菌PBS覆蓋，在預(yù)設(shè)好的UVB輻射儀中照射1 h，然后用PBS洗3遍，加入DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h后進(jìn)行MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖率，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，選擇最佳濃度1.6 g/L，此時(shí)增殖率最高。再用1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4 g/L黑果枸杞多糖重復(fù)上述試驗(yàn)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，選擇增殖率最高的2 g/L作為實(shí)驗(yàn)濃度。

4.MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖：96孔板內(nèi)HaCaT細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行如上分組處理，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，顯微鏡下觀察。每孔加入MTS溶液20 μl，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3 h。終止培養(yǎng)后，酶標(biāo)儀上選擇490 nm波長(zhǎng)測(cè)定并記錄各孔A值。每組單獨(dú)重復(fù)6次。

5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：6孔板內(nèi)HaCaT細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行如上分組處理后，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化，提前預(yù)冷的PBS洗2次，將細(xì)胞重懸于100 μl緩沖液，加入5 μl膜聯(lián)蛋白V?異硫氰酸熒光素和5 μl碘化丙錠（PI），輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加入400 μl緩沖液，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

6.酶標(biāo)法檢測(cè)丙二醛、SOD、GSH?Px和CAT：6孔板內(nèi)HaCaT細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，對(duì)各組細(xì)胞處理同上。培養(yǎng)12 h后，收集上清液及細(xì)胞，按照試劑盒測(cè)定說(shuō)明檢測(cè)SOD和CAT活性、GSH?Px和丙二醛含量。每組單獨(dú)重復(fù)6次。

7.ELISA法檢測(cè)IL?1和TNF?α：6孔板內(nèi)HaCaT細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行如上分組處理。培養(yǎng)12 h后，收集上清液，胰酶消化，PBS洗3次，離心收集細(xì)胞，分別按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)上清液及細(xì)胞中IL?1和TNF?α水平，每組單獨(dú)重復(fù)6次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示。采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，采用Student?Newman?Keuls（SNK）分析進(jìn)行兩兩組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、黑果枸杞多糖預(yù)處理對(duì)UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖抑制的影響

如圖1所示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，UVB組細(xì)胞形態(tài)模糊不清，出現(xiàn)死亡漂浮現(xiàn)象；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞腫脹，但形態(tài)尚清楚。3組間細(xì)胞增殖（A值）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=48.88，P＜0.01）。UVB組細(xì)胞增殖（A值）（1.72±0.12）顯著低于對(duì)照組（2.34±0.11），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組（2.11±0.10）顯著高于UVB組（P＜0.05），但實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率（90.38%±0.61%）顯著高于UVB照射組（73.67%±2.25%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.55，P＜0.05）。

圖1 倒置顯微鏡下觀察黑果枸杞多糖和中波紫外線（UVB）對(duì)HaCaT細(xì)胞形態(tài)的影響（×400） 1A：對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)清楚；1B：UVB組細(xì)胞形態(tài)模糊不清，出現(xiàn)核固縮及死亡漂浮現(xiàn)象；1C：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞腫脹，但形態(tài)尚清楚

二、黑果枸杞多糖預(yù)處理對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示，UVB組細(xì)胞凋亡明顯高于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，3組間細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4 526.48，P＜0.01）。UVB組細(xì)胞凋亡率（82.41%±2.49%）顯著高于對(duì)照組（3.98%±0.19%）和實(shí)驗(yàn)組（22.79%±0.97%），實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

三、黑果枸杞多糖預(yù)處理對(duì)UVB照射HaCaT細(xì)胞丙二醛、SOD、GSH?Px和CAT表達(dá)的影響

如表1所示，UVB組與對(duì)照組比較，丙二醛含量明顯上升，SOD活性、GSH?Px含量、CAT活性明顯下降（均P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組與UVB組比較，丙二醛含量明顯降低，SOD活性、GSH?Px含量、CAT活性明顯升高（均P＜0.05）。

四、黑果枸杞多糖預(yù)處理對(duì)UVB照射HaCaT細(xì)胞IL?1和TNF?α表達(dá)的影響

如表1所示，UVB組與對(duì)照組比較，上清液中IL?1和TNF?α含量及細(xì)胞中TNF?α含量均明顯升高（均P＜0.05），細(xì)胞中IL?1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組與UVB組比較，上清液及細(xì)胞中TNF?α含量明顯下降，細(xì)胞中IL?1升高（均P＜0.05），上清液中IL?1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

討 論

枸杞多糖在黑果枸杞中含量較低，但相對(duì)分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，現(xiàn)研究分離純化的多糖成分有水溶性多糖LRGP1、阿拉伯半乳聚糖蛋白（LRGP3）、LRGP4?A和免疫活性果膠（LRGP5），LRGP4?A1?4為中性多糖，LRGP5為酸性多糖［7］。Lv等［8］在黑果枸杞中分離出LRP4?A，后者主要由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖（1∶7.6∶0.5∶8.6）及微量的木糖構(gòu)成。Gong等［1］研究顯示，黑果枸杞多糖中的LRGP3可以恢復(fù)環(huán)磷酰胺處理的小鼠血清中IL?2、IL?6和TNF?α的水平及T細(xì)胞和B細(xì)胞的免疫應(yīng)答，說(shuō)明黑果枸杞多糖具有潛在的免疫作用。

細(xì)胞凋亡為細(xì)胞對(duì)外界損傷的重要防御機(jī)制。本研究顯示，UVB輻射HaCaT細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)模糊不清，可見死亡漂浮細(xì)胞，細(xì)胞增殖下降，細(xì)胞凋亡率明顯升高。黑果枸杞多糖預(yù)處理后的實(shí)驗(yàn)組與未經(jīng)處理的UVB照射組相比，HaCaT細(xì)胞形態(tài)明顯恢復(fù)，細(xì)胞增殖率升高，凋亡率也明顯降低。提示黑果枸杞多糖能保護(hù)HaCaT細(xì)胞抑制UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HaCaT細(xì)胞凋亡 UVB組（2B）細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組（2A）和實(shí)驗(yàn)組（2C）

表1 各組HaCaT細(xì)胞丙二醛含量、SOD活性、GSH?Px含量、CAT活性及IL?1和TNF?α水平比較（±s）

表1 各組HaCaT細(xì)胞丙二醛含量、SOD活性、GSH?Px含量、CAT活性及IL?1和TNF?α水平比較（±s）

注：n=6。a：UVB組與對(duì)照組比較，P ＜ 0.05；b：實(shí)驗(yàn)組與UVB組比較，P ＜ 0.05。SOD：超氧化物歧化酶；GSH?Px：谷胱甘肽過(guò)氧化物酶；CAT：過(guò)氧化氫酶；IL?1：白細(xì)胞介素1；TNF?α：腫瘤壞死因子α

組別對(duì)照組UVB組實(shí)驗(yàn)組F值P值丙二醛含量（nmol/g）2.13±0.32 4.01±0.28a 1.07±0.34b 131.93＜0.01 SOD活性（U/mg）27.53±5.98 16.77±3.27a 25.53±5.17b 7.92＜0.01 GSH?Px含量（μmol/g）30.03±4.23 14.25±2.48a 23.06±2.72b 35.83＜0.01 CAT活性（U/ml）25.17±3.32 8.50±2.34a 16.93±2.57b 54.21＜0.01 IL?1（ng/L）上清液11.67±1.76 21.62±2.69a 20.48±5.77 12.23＜0.01細(xì)胞24.45±7.10 24.48±8.46 37.10±2.03b 7.61＜0.01 TNF?α（ng/L）上清液13.36±1.84 21.21±2.78a 14.45±2.15b 20.62＜0.01細(xì)胞4.30±1.07 11.47±0.96a 5.04±0.78b 104.03＜0.01

UVB對(duì)皮膚的損傷主要與其產(chǎn)生的活性氧簇（ROS）造成的氧化應(yīng)激有關(guān)。人體內(nèi)酶類抗氧化系統(tǒng)主要由SOD、GSH?Px和CAT等體內(nèi)自生的抗氧化酶組成。當(dāng)紫外線過(guò)量照射時(shí)，SOD和CAT活力、GSH?Px含量均下降，細(xì)胞對(duì)ROS清除能力下降，皮膚內(nèi)產(chǎn)生較多的ROS，體內(nèi)的氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡遭到破壞，多余ROS可引起皮膚組織內(nèi)脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)等成分的損傷，破壞皮膚細(xì)胞結(jié)構(gòu)及各種生物代謝功能，從而引起光老化、誘發(fā)皮膚癌等［9］。丙二醛是膜過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物，它的產(chǎn)生還能加劇膜損傷，因此可作為膜受損程度的檢測(cè)指標(biāo)。ROS可觸發(fā)線粒體內(nèi)膜上的小孔道開放，水分子進(jìn)入線粒體基質(zhì)使之腫脹，導(dǎo)致外膜破裂，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10］。本研究顯示，UVB照射HaCaT細(xì)胞后，丙二醛含量明顯上升，SOD活力、GSH?Px含量、CAT活力明顯下降，說(shuō)明UVB輻射后細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷。黑果枸杞多糖預(yù)處理后的實(shí)驗(yàn)組較未經(jīng)處理的UVB照射組SOD活力、GSH?Px含量、CAT活力明顯升高，丙二醛含量明顯下降，提示黑果枸杞多糖可提高細(xì)胞清除氧自由基的能力，減輕ROS所致的細(xì)胞損傷，說(shuō)明黑果枸杞多糖通過(guò)抗氧化作用保護(hù)HaCaT細(xì)胞，減輕UVB引起的光損傷。

本研究顯示，UVB輻射細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)IL?1含量無(wú)明顯變化，但上清液中IL?1、上清液及細(xì)胞中TNF?α含量明顯升高。Marionnet研究顯示［11］，UVB照射對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)IL?1無(wú)影響，但可增加IL?1及TNF?α的釋放，本研究結(jié)果與之相符。紫外線照射可使角質(zhì)形成細(xì)胞釋放IL?1和TNF?α，這些細(xì)胞因子具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等生物學(xué)作用［12］。IL?1誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡并通過(guò)激活JNK和p38MAPK途徑抑制細(xì)胞分化［13］。TNF與細(xì)胞表面的死亡受體TNFR1結(jié)合，TNFR1與銜接蛋白腫瘤壞死因子受體1結(jié)合蛋白（TRADD）通過(guò)各自的死亡結(jié)構(gòu)域（DD）結(jié)合，形成由TNF、TNFR1、TRADD組合的蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物可結(jié)合其他銜接蛋白如Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）、RIP締合的ICH?1/ced?3同源死亡結(jié)構(gòu)蛋白（RAIDD），最后RAIDD 激活 caspases?8和 caspases?2促進(jìn)細(xì)胞凋亡［14］。本研究中，黑果枸杞多糖預(yù)處理的UVB照射組較未經(jīng)處理的實(shí)驗(yàn)組HaCaT細(xì)胞及上清液中TNF?α含量均降低，細(xì)胞中IL?1含量升高，上清液中IL?1無(wú)明顯變化。提示黑果枸杞多糖可通過(guò)降低HaCaT細(xì)胞TNF?α合成和釋放及促進(jìn)IL?1合成來(lái)減輕細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)HaCaT細(xì)胞免受UVB引起的損傷。

綜上所述，黑果枸杞多糖預(yù)處理可減輕UVB輻射對(duì)HaCaT細(xì)胞的氧化損傷及炎癥反應(yīng)，從而減少細(xì)胞凋亡。但我們未進(jìn)行凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)，未證實(shí)黑果枸杞多糖具體通過(guò)何種途徑發(fā)揮這種作用，這些尚需進(jìn)一步研究。

［1］暴鳳偉,郭武艷,邳馨,等.黑果枸杞的生物活性研究進(jìn)展［J］.中國(guó)執(zhí)業(yè)藥師,2014,11（7）:31?34.DOI:10.3969/j.issn.1672?5433.2014.07.008

［2］汪建紅,陳曉琴,張蔚佼.黑果枸杞果實(shí)多糖降血糖生物功效及其機(jī)制研究［J］.食品科學(xué),2009,30（5）:244?248.DOI:10.3321/j.issn:1002?6630.2009.05.056.

［3］Ni W,Gao T,Wang H,et al.Anti?fatigue activity of polysac?charides from the fruits of four Tibetan plateau indigenous medicinal plants［J］.J Ethnopharmacol,2013,150（2）:529?535.DOI:10.1016/j.jep.2013.08.055.

［4］Gong Y,Wu J,Li ST.Immuno?enhancement effects ofLycium ruthenicumMurr.polysaccharide on cyclophosphamide?induced immunosuppression in mice［J］.Int J Clin Exp Med,2015,8（11）:20631?20637.

［5］Duan Y,Chen F,Yao X,et al.Protective effect ofLycium ruthenicum Murr.against radiation injury in mice［J］.Int J Environ Res Public Health,2015,12（7）:8332?8347.DOI:10.3390/ijerph120708332.

［6］艾則孜江·艾爾肯,田志浩,馮孟鑫,等.黑果枸杞質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.西北藥學(xué)雜志,2015,（3）:236?241.DOI:10.3969/j.issn.1004?2407.2015.03.006.

［7］夏園園,莫仁楠,曲瑋,等.黑果枸杞化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)進(jìn)展,2015,39（5）:351?356.

［8］Lv X,Wang C,Cheng Y,et al.Isolation and structural characteri?zation of a polysaccharide LRP4?A fromLycium ruthenicum Murr［J］.Carbohydr Res,2013,365:20 ?25.DOI:10.1016/j.carres.2012.10.013.

［9］G?gotek A,Ryba?towska?Kawa?ko P,Skrzydlewska E.Rutin as a mediator of lipid metabolism and cellular signaling pathways interactions in fibroblasts altered by UVA and UVB radiation［J/OL］.Oxid Med Cell Longev,2017,2017:4721352（2017?01?12）［2017?02?20］.http://www.pubmedcentral.org.DOI:10.1155/2017/4721352.［Published online ahead of print Jan 12,2017］

［10］Nasu K,Nishida M,Kawano Y,et al.Aberrant expression of apoptosis?related molecules in endometriosis:a possible mecha?nism underlying the pathogenesis of endometriosis［J］.Reprod Sci,2011,18（3）:206?218.DOI:10.1177/1933719110392059.

［11］Marionnet AV,Chardonnet Y,Viac J,et al.Differences in responses of interleukin?1 and tumor necrosis factor alpha production and secretion to cyclosporin?A and ultraviolet B?irradiation by normal and transformed keratinocyte cultures［J］.Exp Dermatol,1997,6（1）:22?28.DOI:10.1111/j.1600?0625.1997.tb00141.x.

［12］Fan X,Duan Q,Ke C,et al.Cefradine blocks solar?ultraviolet induced skin inflammation through direct inhibition of T?LAK cell?originated protein kinase［J］.Oncotarget,2016,7（17）:24633 ?24645.DOI:10.18632/oncotarget.8260.

［13］Guo C,Yang XG,Wang F,et al.IL?1α induces apoptosis and inhibits the osteoblast differentiation of MC3T3?E1 cells through the JNK and p38 MAPK pathways［J］.Int J Mol Med,2016,38（1）:319?327.DOI:10.3892/ijmm.2016.2606.

［14］李敏,林俊.細(xì)胞凋亡途徑及其機(jī)制［J］.國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志,2014,41（2）:103?107.

Protective effect of polysaccharides from Lycium ruthenicum Murray against ultraviolet B radiation?induced photodamage in HaCaT cells

Ren Licuan,Jia Yang′e,Yan Hualing,Wang Yong,Guo Yan,Ha Xiaomei,Zhu Shiwen,Wang Gang
Department of Dermatology,Qinghai University Affiliated Hospital,Xining 810000,China

Yan Hualing,Email:yhlckw@163.com

ObjectiveTo evaluate preventive effect of polysaccharides fromLycium ruthenicumMurray against photodamage in HaCaT cells,and to explore its possible mechanism.MethodsUltrasound?assisted extraction was used to extract polysaccharides fromLycium ruthenicumMurray in Qaidam Basin.In vitrocultured HaCaT cells were randomly divided into 3 groups:control group receiving no treatment,ultraviolet B（UVB）group irradiated with 30 mJ/cm2UVB alone for 1 hour,experimental group pretreated with 2 g/LLycium ruthenicumpolysaccharide solution followed 6 hours later by 30 mJ/cm2UVB radiation for 1 hour.At twelve hours after UVB radiation,an inverted microscope was used to observe cell morphology.Then,MTS assay was performed to estimate cell proliferation,flow cytometry to detect cell apoptosis,an enzyme?labeled antigen method to detect levels of malondialdehyde（MDA）and glutathione peroxidase（GSH?Px）,as well as to evaluate the activity of superoxide dismutase（SOD）and catalase（CAT）,and enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）to measure levels of interleukin?1（IL?1）and tumor necrosis factor?alpha（TNF?α）in HaCaT cells and their culture supernatant.ResultsCompared with the control group,the UVB group showed obscure cell morphology,cell death and floating phenomenon,while cells became swollen but remained morphologically distinct in the experimental group.MTS assay revealed that the cell proliferative activity significantly differed among the above 3 groups（F=48.88,P＜ 0.01）,and the cell proliferative activity was significantly lower in the UVB group（1.72 ± 0.12）than in the control group（2.34±0.11,P＜0.05）and experimental group（2.11±0.10,P＜0.05）.Moreover,the apoptosis rate was significantly higher in the UVB group（82.41% ±2.49%）than in the control group（3.98% ±0.19%,P＜0.05）and experimental group（22.79% ± 0.97%,P＜ 0.05）,as well as higher in the experimental group than in the control group（P＜ 0.05）.Compared with the control group,the UVB group showed significantly higher levels of MDA,supernatant levels of IL?1 and TNF?α,and intracellular levels of TNF?α,but significantly lower GSH?Px levels and activity of SOD and CAT（allP＜ 0.05）.However,there was no signifi?cant difference in the intracellular level of TNF?α between the UVB group and control group（P＞ 0.05）.ConclusionLycium ruthenicumpolysaccharide has protective effects against photodamage in HaCaT cells,likely by reducing the synthesis and secretion of inflammatory substances as well as free radicals.

Lycium barbarum;Polysaccharides;Keratinocytes;Ultraviolet rays;Oxidative stress;Interleukin?1;Tumor necrosis factor?alpha

燕華玲，Email：yhlckw@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.07.010

青海省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014?ZJ?756）

Fund program:Science and Technology Planning Project of Qinghai Province of China（2014?ZJ?756）

2016?09?12）

（本文編輯：周良佳 顏艷）