二甲雙胍對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1誘導(dǎo)黑素瘤1205Lu細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲的影響

梁美琪 梁官釗 郭健 段昕所 陸潔

067020河北，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科（第二作者現(xiàn)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所）

二甲雙胍對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1誘導(dǎo)黑素瘤1205Lu細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲的影響

梁美琪 梁官釗 郭健 段昕所 陸潔

067020河北，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科（第二作者現(xiàn)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所）

目的探討二甲雙胍在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF?β1）誘導(dǎo)下，對(duì)黑素瘤1205Lu細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程及侵襲的影響。方法體外培養(yǎng)1205Lu細(xì)胞，分3組處理：空白對(duì)照組、TGF?β1（5 ng/ml）組、TGF?β1（5 ng/ml）+ 二甲雙胍（1 mmol/L）組。處理48 h后，顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化并采集照片。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，采用蛋白質(zhì)印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量RT?PCR技術(shù)分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)N?鈣黏蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP?9）在蛋白質(zhì)和mRNA水平上的表達(dá)，通過(guò)單因素方差分析及LSD?t法對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果與空白對(duì)照組相比，TGF?β1誘導(dǎo)1205Lu細(xì)胞向成纖維細(xì)胞樣形態(tài)轉(zhuǎn)變（同上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化樣改變），聯(lián)合二甲雙胍可逆轉(zhuǎn)上述形態(tài)改變。3組穿膜細(xì)胞數(shù)為空白對(duì)照組194.1± 8.295、TGF?β1組412.2± 13.427、TGF?β1+ 二甲雙胍組175.3±8.693。N鈣黏蛋白水平3組分別為0.603±0.029、1.963±0.016、0.207±0.009，mRNA水平3組分別為1.000±0.000、6.678±0.043、1.035±0.015。MMP?9蛋白水平3組分別為0.575±0.009、1.243±0.027、0.629±0.008，mRNA水平3組分別為1.000±0.000、5.351±0.604、0.930±0.130。結(jié)果經(jīng)方差分析顯示，3組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論二甲雙胍可顯著抑制TGF?β1誘導(dǎo)的黑素瘤1205Lu細(xì)胞EMT樣形態(tài)改變、細(xì)胞侵襲及N鈣黏蛋白、MMP?9在蛋白和mRNA水平上的表達(dá)。

黑色素瘤；二甲雙胍；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；侵襲

惡性黑素瘤是高致命性皮膚腫瘤，其侵襲、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，一旦遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中位生存期為4～6個(gè)月，5年生存率 ＜ 10%［1］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）即上皮型細(xì)胞向更具侵襲性的間質(zhì)型細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程，被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞獲得惡性表型的關(guān)鍵機(jī)制，在腫瘤運(yùn)動(dòng)、侵襲等方面發(fā)揮重要作用。基底膜降解和間質(zhì)樣細(xì)胞形成標(biāo)志著EMT的完成［2?3］?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMP）可降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜主要成分，參與腫瘤EMT過(guò)程，與腫瘤侵襲密切相關(guān)。N鈣黏蛋白為間質(zhì)型細(xì)胞標(biāo)志物，其表達(dá)上調(diào)標(biāo)志EMT過(guò)程［4?6］。作為EMT的主要誘導(dǎo)因子，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF?β）通過(guò)誘導(dǎo)EMT、生成血管及抑制免疫等促進(jìn)腫瘤運(yùn)動(dòng)、侵襲及轉(zhuǎn)移［7］。在前列腺癌、乳腺癌及肺癌研究中發(fā)現(xiàn)，降糖藥二甲雙胍能夠抑制TGF?β1誘導(dǎo)產(chǎn)生的EMT，而在黑素瘤領(lǐng)域尚無(wú)報(bào)道。為此，本研究探討二甲雙胍對(duì)TGF?β1誘導(dǎo)下黑素瘤細(xì)胞EMT過(guò)程及侵襲的影響。

資料與方法

一、資料

人黑素瘤1205Lu細(xì)胞株（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院皮膚科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)），TGF?β1（美國(guó)Peprotech公司），二甲雙胍（批號(hào)BCBP0558V，純度≥97%，美國(guó)Sigma公司）、MCDB153培養(yǎng)基（美國(guó)Sigma公司），L15培養(yǎng)基、Transwell小室（美國(guó)Coning公司），胎牛血清（杭州四季青生物公司），胰蛋白酶（美國(guó)Gibcol公司），N鈣黏蛋白、MMP?9、GAPDH正反向引物（大連Takara公司設(shè)計(jì)并合成），兔抗人N鈣黏蛋白單克隆抗體、兔抗人MMP?9單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司），TRIzol（北京索萊寶科技有限公司），F(xiàn)ast Quant反轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根生化科技有限公司），SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司），BCA蛋白定量試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：1205Lu細(xì)胞株用含4%胎牛血清的W489合成培養(yǎng)基（由75%MCDB153培養(yǎng)基和25%L15培養(yǎng)基組成），37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每2～3天更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合至80%～90%豐度時(shí)，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗1次，0.25%胰蛋白酶消化，完全培養(yǎng)基終止消化并將細(xì)胞調(diào)整至適宜密度后傳代培養(yǎng)或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.分組及處理：實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、TGF?β1組、TGF?β1+二甲雙胍組3個(gè)組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期1205Lu細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種于6孔板，細(xì)胞單層鋪滿后棄去培養(yǎng)基并按分組給予如下處理：空白對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基；TGF?β1組加入含5 ng/ml TGF?β1的無(wú)血清培養(yǎng)基；TGF?β1+ 二甲雙胍組加入含5 ng/ml TGF?β1及1 mmol/L二甲雙胍的無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后觀察細(xì)胞形態(tài)并收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)及mRNA檢測(cè)。

3.蛋白質(zhì)印跡：細(xì)胞分組處理48 h后用預(yù)冷PBS漂洗2次，加入RIPA裂解液置于冰上裂解30 min，24 000×g離心15 min，取上清按BCA法測(cè)定各組蛋白濃度，每組取25 μg蛋白上樣，用8%SDS?PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離總蛋白，并轉(zhuǎn)印至PVDF（聚亞乙烯雙氧化物）膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，分別加入一抗即抗N鈣黏蛋白抗體（1∶1 000）、抗MMP?9抗體（1∶1 000）、抗β肌動(dòng)蛋白抗體（1∶10 000）4℃孵育過(guò)夜，TBST清洗3次后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫振蕩1.5 h，TBST清洗3次后加ECL發(fā)光液于暗室壓片曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。采用Gel?pro analyzer4圖像分析軟件測(cè)定條帶IOD值。目的蛋白N鈣黏蛋白及MMP?9與內(nèi)參照β肌動(dòng)蛋白IOD的比值反映其蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

4.實(shí)時(shí)熒光定量RT?PCR：細(xì)胞分組處理48h后采用TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA純度及濃度，每組取等量RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書步驟合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增目的基因N鈣黏蛋白、MMP?9和內(nèi)參基因GAPDH。PCR反應(yīng)體系（25 μl）：熒光染料12.5 μl，正、反向引物各1 μl，cDNA 模板 2 μl，無(wú) RNA 酶水 8.5 μl，反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 2 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。引物序列如下：N鈣黏蛋白正向引物：5′?CATCATCATCCTGCTTACCT TGT?3′，反向引物：5′?GGTCTTCTCCTCCACCTTCT T?3′；MMP?9正向引物：5′?ACGCACGACGTCTTCCA GTA?3′，反向引物：5′?CCACCTGGTTCAACTCACTC C?3′；GAPDH正向：5′?GCACCGTCAAGGCTGAGAA C?3′，反向：5′?TGGTGAAGACGCCAGTGGA?3′。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。用2-△△Ct法分析目的基因N鈣黏蛋白、MMP?9的相對(duì)表達(dá)量。

5.Transwell侵襲試驗(yàn)：將Transwell小室（孔徑8 μm）置于24孔板中，取50 μl Matrigel基質(zhì)膠（PBS稀釋至0.1 mg/ml）包被小室膜，37℃孵育3 h，室溫風(fēng)干16 h后每室加入50 μl無(wú)血清W489培養(yǎng)基37℃孵育24 h，使基質(zhì)膠充分水化并棄去殘留培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，按分組制成含不同藥物（即5 ng/ml TGF?β1及其與1 mmol/L二甲雙胍聯(lián)合）的無(wú)血清細(xì)胞懸液（5×104個(gè)/ml），各取200 μl加入小室上層，小室下層加入600 μl含0.1%胎牛血清的W489培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后棉簽拭去小室上層基質(zhì)膠及細(xì)胞，無(wú)水甲醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS漂洗2次。顯微鏡下觀察，每組隨機(jī)選取5個(gè)高倍（200×）視野計(jì)數(shù)，其平均值為每組細(xì)胞穿膜數(shù)目，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：結(jié)果采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理且以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD?t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、二甲雙胍逆轉(zhuǎn)TGF?β1誘導(dǎo)下黑素瘤1205Lu細(xì)胞EMT樣形態(tài)改變

顯微鏡（×100）下觀察各組細(xì)胞形態(tài)：空白對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞呈多角形且分布均勻；TGF?β1誘導(dǎo)后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，似成纖維細(xì)胞，按平行、放射或旋渦狀排列分布，同EMT樣改變，說(shuō)明1205Lu細(xì)胞在TGF?β1誘導(dǎo)下經(jīng)歷EMT樣改變；加入二甲雙胍干預(yù)后細(xì)胞失去上述典型的間質(zhì)型細(xì)胞形態(tài)，更接近空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)，說(shuō)明TGF?β1誘導(dǎo)的上述EMT樣形態(tài)改變?cè)诙纂p胍作用下發(fā)生逆轉(zhuǎn)，即經(jīng)歷MET樣改變。見(jiàn)圖1。

二、二甲雙胍抑制TGF?β1誘導(dǎo)下黑素瘤1205Lu細(xì)胞N鈣黏蛋白、MMP?9蛋白表達(dá)

TGF?β1誘導(dǎo)下N鈣黏蛋白、MMP?9蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即TGF?β1促進(jìn)1205Lu細(xì)胞EMT及侵襲相關(guān)分子的蛋白表達(dá)，說(shuō)明TGF?β1誘導(dǎo)下細(xì)胞經(jīng)歷EMT過(guò)程；聯(lián)合二甲雙胍使N鈣黏蛋白、MMP?9蛋白表達(dá)較TGF?β1組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1，圖2。

圖1 二甲雙胍對(duì)TGF?β1誘導(dǎo)黑素瘤1205Lu細(xì)胞形態(tài)變化的影響（×100） 空白對(duì)照組（1A）細(xì)胞呈多角形且分布均勻；TGF?β1組（1B）細(xì)胞呈狹長(zhǎng)梭形，似成纖維細(xì)胞形態(tài)，呈平行、放射狀或旋渦狀排列；TGF?β1+二甲雙胍組（1C）細(xì)胞形態(tài)及分布介于兩者之間，更接近空白對(duì)照組

三、二甲雙胍抑制TGF?β1誘導(dǎo)下黑素瘤1205Lu細(xì)胞N鈣黏蛋白、MMP?9mRNA表達(dá)

LSD?t法兩兩比較顯示：TGF?β1組N鈣黏蛋白、MMP?9 mRNA相對(duì)表達(dá)量較空白對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），即TGF?β1可促進(jìn)上述EMT及侵襲相關(guān)分子mRNA表達(dá)；加入二甲雙胍干預(yù)后N鈣黏蛋白、MMP?9 mRNA表達(dá)下降，與TGF?β1組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明二甲雙胍抑制TGF?β1介導(dǎo)的1205Lu細(xì)胞EMT及侵襲相關(guān)分子在mRNA水平的表達(dá)，并與其蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平吻合。見(jiàn)表1。

四、二甲雙胍抑制TGF?β1誘導(dǎo)下黑素瘤1205Lu細(xì)胞侵襲

各組每高倍鏡（×200）視野下平均穿膜細(xì)胞數(shù)：空白對(duì)照組 194.1± 8.295，TGF?β1組 412.2±13.427，TGF?β1+ 二甲雙胍組175.3± 8.693。方差分析顯示各處理組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組間兩兩比較得出：TGF?β1組穿膜細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照組明顯增多（P＜ 0.05），提示TGF?β1誘導(dǎo)后細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)；與二甲雙胍聯(lián)合作用后穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，與TGF?β1組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），故二甲雙胍可抑制TGF?β1誘導(dǎo)下1205Lu細(xì)胞侵襲。見(jiàn)圖3。

表1 二甲雙胍對(duì)TGF?β1誘導(dǎo)黑素瘤1205Lu細(xì)胞N鈣黏蛋白、MMP?9蛋白及mRNA表達(dá)的影響（±s）

表1 二甲雙胍對(duì)TGF?β1誘導(dǎo)黑素瘤1205Lu細(xì)胞N鈣黏蛋白、MMP?9蛋白及mRNA表達(dá)的影響（±s）

注：n=3。MMP?9：基質(zhì)金屬蛋白酶9；TGF?β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子?β1；Met：二甲雙胍。a：與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與TGF?β1組比較，P＜ 0.05；c：與TGF?β1+Met組比較，P ＜ 0.05

組別空白對(duì)照組TGF?β1組TGF?β1+Met組F值P值MMP?9蛋白（IOD比值）0.575±0.009bc 1.243±0.027ac 0.629±0.008ab 2 893.601＜0.05 MMP?9mRNA（2-??Ct）1.000±0.000b 5.351±0.604ac 0.930±0.130b 151.034＜0.05 N鈣黏蛋白（IOD比值）0.603±0.029bc 1.963±0.164ac 0.207±0.009ab 6 450.497＜0.05 N鈣黏蛋白mRNA（2-??Ct）1.000±0.000b 6.678±0.043ac 1.035±0.015b 46 929.635＜0.05

圖2 二甲雙胍對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的黑素瘤1205Lu細(xì)胞N鈣黏蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)的影響（蛋白印跡結(jié)果） 1：空白對(duì)照組；2：TGF-β1組；3：TGF-β1+ 二甲雙胍組

圖3 二甲雙胍對(duì)TGF?β1誘導(dǎo)黑素瘤1205Lu細(xì)胞侵襲的影響（×200） 與空白對(duì)照組（3A）相比，TGF?β1組（3B）細(xì)胞穿過(guò)小室膜細(xì)胞數(shù)明顯增多；TGF?β1+二甲雙胍組（3C）穿膜細(xì)胞數(shù)較TGF?β1組明顯減少，與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

討 論

黑素瘤由黑素細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化形成，其侵襲、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，一旦轉(zhuǎn)移治療方法有限，預(yù)后差，近30年發(fā)病速度在實(shí)體腫瘤中居首位，黑素瘤治療除早期發(fā)現(xiàn)和積極預(yù)防外亟待找到新的方法和作用靶點(diǎn)［1?2］。近年來(lái)，腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。EMT被認(rèn)為是啟動(dòng)腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制。其通過(guò)下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)記物（如E鈣黏蛋白），上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（如N鈣黏蛋白）以及MMP的表達(dá)使細(xì)胞間連接消失，細(xì)胞外基質(zhì)降解，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及侵襲性增強(qiáng)［4］。MMP（尤其是MMP?2、MMP?9）能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及侵襲，與腫瘤進(jìn)展及EMT過(guò)程密切相關(guān)［6］。作為EMT主要誘導(dǎo)因子，TGF?β經(jīng)Smad信號(hào)通路激活下游轉(zhuǎn)錄因子Snail，其通過(guò)下調(diào)E?鈣黏蛋白、上調(diào)MMPs（如MMP?9）表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo) EMT 過(guò)程［4?5］。Javelaud等發(fā)現(xiàn)，阻斷1205Lu細(xì)胞TGF?β/Smad通路后MMP?9表達(dá)減少，細(xì)胞侵襲力下降，腫瘤生長(zhǎng)及骨轉(zhuǎn)移速度減慢［8?9］。推測(cè)：TGF?β經(jīng)Smad信號(hào)通路上調(diào)1205Lu細(xì)胞MMP?9表達(dá)，誘導(dǎo)EMT過(guò)程，促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。故抑制TGF?β誘導(dǎo)的EMT及細(xì)胞侵襲為本次實(shí)驗(yàn)的研究目標(biāo)。

近年來(lái)，二甲雙胍抗腫瘤作用被人們廣泛認(rèn)知及探討。流行病學(xué)研究顯示，服用二甲雙胍的糖尿病患者癌癥罹患風(fēng)險(xiǎn)明顯降低［10］。Cerezo等［11］證實(shí)，二甲雙胍能夠降低黑素瘤細(xì)胞中Snail、Slug及N鈣黏蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，在前列腺癌、乳腺癌及肺癌研究中發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠抑制TGF?β1誘導(dǎo)的EMT過(guò)程［12?14］。本實(shí)驗(yàn)旨在驗(yàn)證二甲雙胍能否抑制黑素瘤細(xì)胞中TGF?β1誘導(dǎo)的EMT及細(xì)胞侵襲。我們選取黑素瘤1205Lu細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其對(duì)外源性TGF?β存在強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答能力；具有配體介導(dǎo)下高度自主的TGF?β/Smad信號(hào)通路；并在Matrigel實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出高侵襲性［8］。通過(guò)檢測(cè)EMT及侵襲相關(guān)分子表達(dá)（N鈣黏蛋白、MMP?9），從分子水平論證藥物對(duì)EMT及侵襲的影響；同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)和體外侵襲能力，從現(xiàn)象層面論證EMT過(guò)程及細(xì)胞侵襲。結(jié)果顯示：TGF?β1誘導(dǎo)后1205Lu細(xì)胞經(jīng)歷EMT樣形態(tài)改變，N鈣黏蛋白、MMP?9表達(dá)上調(diào)，且細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)，即TGF?β1誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞EMT且伴隨細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)；與二甲雙胍聯(lián)合作用可逆轉(zhuǎn)上述EMT樣形態(tài)變化，抑制N鈣黏蛋白、MMP?9表達(dá)及細(xì)胞侵襲。說(shuō)明TGF?β1、EMT及MMP?9與黑素瘤細(xì)胞侵襲密切相關(guān)，故二甲雙胍可能通過(guò)抑制TGF?β1誘導(dǎo)的EMT過(guò)程及MMP?9表達(dá)從而降低1205Lu細(xì)胞侵襲性。

綜上所述，我們證實(shí)TGF?β1能夠誘導(dǎo)黑素瘤1205Lu細(xì)胞EMT并增強(qiáng)細(xì)胞侵襲性。繼前列腺癌、乳腺癌、肺癌之后，證實(shí)二甲雙胍能夠抑制TGF?β1誘導(dǎo)的黑素瘤細(xì)胞EMT及侵襲。為二甲雙胍抗黑素瘤提供新的依據(jù)，然而通過(guò)何種途徑抑制上述過(guò)程尚待進(jìn)一步研究。

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奇正青鵬軟膏有獎(jiǎng)?wù)魑耐ㄖ?/p>

為了更好地發(fā)揮藏藥在皮膚病治療中的作用，西藏奇正藏藥股份有限公司與《中華皮膚科雜志》編輯部、中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專業(yè)委員會(huì)環(huán)境與職業(yè)性皮膚病學(xué)組共同開(kāi)展2017年奇正青鵬軟膏有獎(jiǎng)?wù)魑幕顒?dòng)，歡迎皮膚科醫(yī)師踴躍參加。

一、征文范圍

①單用奇正青鵬軟膏治療各種濕疹皮炎臨床療效的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)（有對(duì)照組）；②觀察單用奇正青鵬軟膏治療皮炎濕疹等皮膚科常見(jiàn)瘙癢癥狀的起效時(shí)間和療效的研究（有對(duì)照組）；③觀察青鵬軟膏保護(hù)皮膚屏障的作用及其在濕疹治療中的意義（有對(duì)照組）。

二、活動(dòng)形式

論文提交截稿日期2018年3月1日。在此期間完成的研究論文均可參加活動(dòng)，并在2018年中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專業(yè)委員會(huì)年會(huì)期間進(jìn)行評(píng)比和頒獎(jiǎng)。本次征文共設(shè)如下獎(jiǎng)項(xiàng)：第1～3名將分別獲得8 000元、5 000元、3 000元的研究基金；優(yōu)秀征文獎(jiǎng)20名，分別獲得1 000元研究基金，以上獲獎(jiǎng)?wù)呔C發(fā)中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專業(yè)委員會(huì)環(huán)境與職業(yè)性皮膚病學(xué)組研究基金獲獎(jiǎng)證書。

請(qǐng)將論文Word電子版發(fā)至Email：wwz1602@qzh.cn或jiangli0828@163.com，主題注明奇正青鵬軟膏征文。

西藏奇正藏藥股份有限公司有權(quán)使用征文稿件，并擁有此次活動(dòng)的解釋權(quán)。

Effects of metformin on transforming growth factor?beta1?induced epithelial?mesenchymal transition and invasion in the human melanoma cell line 1205Lu

Liang Meiqi,Liang Guanzhao,Guo Jian,Duan Xinsuo,Lu Jie
Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Chengde Medical University,Chengde 067020,Hebei,China（Liang MQ,Liang GZ［current affiliation:Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China］,Guo J,Duan XS,Lu J）

Lu Jie,Email:chengdejiel@163.com

ObjectiveTo evaluate the effects of metformin on transforming growth factor?beta1（TGF?β1）?induced epithelial?mesenchymal transition（EMT）in and invasion of the human melanoma cell line 1205Lu.MethodsIn vitrocultured 1205Lu cells were divided into 3 groups to be treated with serum?free culture medium（blank control group）,serum?free culture medium containing 5 ng/ml TGF?β1（TGF?β 1 group）and serum?free culture medium containing 5 ng/ml TGF?β1 and 1 mmol/L metformin（TGF?β1+metformin group）,respectively.After 48?hour treatment,morphological changes of 1205Lu cells in the above groups were observed by using a microscope,and photos were taken at the same time.Transwell invasion assay was performed to estimate cellular invasive activity,Western blot analysis and real?time fluorescence?based quantitative RT?PCR were conducted to determine the mRNA and protein expression of N?cadherin and matrix metalloproteinase?9（MMP?9）,respectively.Statistical analysis was carried out by one?way analysis of variance（ANOVA）and least significant difference（LSD）test.ResultsCompared with the blank control group,the stimulation of TGF?β1 could induce the epithelial?mesenchymal transition（EMT）?like morphological changes in 1205Lu cells,while TGF?β1 combined with metformin could reverse the EMT?like morpho?logical changes.The number of 1205Lu cells crossing the transwell Matrigel per high?power field（× 200）was significantly higher in the TGF?β1 group（412.2 ± 13.427）than in the blank control group（194.1 ± 8.295）and TGF?β1+metformin group（175.3 ± 8.693）.Compared with the blank control group and TGF?β1+metformin group,the TGF?β1 group also showed significantly increased mRNA and protein expression of N?cadherin（mRNA:6.678±0.043vs.1.000±0.000,1.035±0.015;protein:1.963±0.016vs.0.603±0.029,0.207±0.009）andMMP?9（mRNA:5.351±0.604vs.1.000±0.000,0.930±0.130;protein:1.243±0.027vs.0.575±0.009,0.629±0.008）.ConclusionMetformin can obviously inhibit TGF?β1?induced EMT?like morphological changes in,the capacity to penetrate Matrigel?coated transwell chambers of and the mRNA and protein expression of N?cadherin and MMP?9 in 1205Lu cells.

Melanoma;Metformin;Transforming growth factor?beta1;Epithelial?mesenchymal transition;Invasion

陸潔，Email：chengdejiel@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.06.009

2016?09?18）

（本文編輯：吳曉初）