粉防己堿對(duì)酮康唑抗近平滑念珠菌復(fù)合體的體外增效活性研究

趙亞婧 李水秀 蔣玲 宋延君 郭慧 劉維達(dá) 沈永年 朱坤舉 張宏

510632廣州，暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院真菌病研究所（趙亞婧、李水秀、蔣玲、宋延君、郭慧、朱坤舉、張宏）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所真菌科（劉維達(dá)、沈永年）

粉防己堿對(duì)酮康唑抗近平滑念珠菌復(fù)合體的體外增效活性研究

趙亞婧 李水秀 蔣玲 宋延君 郭慧 劉維達(dá) 沈永年 朱坤舉 張宏

510632廣州，暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院真菌病研究所（趙亞婧、李水秀、蔣玲、宋延君、郭慧、朱坤舉、張宏）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所真菌科（劉維達(dá)、沈永年）

目的探討粉防己堿在體外對(duì)酮康唑抗近平滑念珠菌復(fù)合體有無(wú)增效作用。方法參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的M27?A3方案，采用棋盤式微量稀釋法測(cè)定酮康唑單獨(dú)及聯(lián)合粉防己堿抗21株近平滑念珠菌復(fù)合體臨床株抗真菌活性，結(jié)合部分抑制濃度指數(shù)（FICI）對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)；以甲基四氮鹽（XTT）法分別測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)藥物作用的效果，繪制時(shí)間殺菌曲線，動(dòng)態(tài)觀察藥物體外抗近平滑念珠菌復(fù)合體活性。結(jié)果粉防己堿與酮康唑單獨(dú)作用于21株近平滑念珠菌復(fù)合體菌株的最低抑菌濃度分別是32～64 mg/L和0.031 25～2 mg/L，兩藥聯(lián)合時(shí)最低抑菌濃度分別降至2～8 mg/L和0.008～0.25 mg/L，F(xiàn)ICI值為0.09～0.5；時(shí)間殺菌曲線表明，與酮康唑單用組和粉防己堿單用組相比，酮康唑聯(lián)合粉防己堿組真菌生長(zhǎng)延遲明顯。結(jié)論粉防己堿在體外對(duì)酮康唑抗近平滑念珠菌復(fù)合體有明顯的增效作用。

念珠菌屬；酮康唑；粉防己堿；藥物協(xié)同作用；近平滑念珠菌復(fù)合體

念珠菌感染的全球流行病學(xué)狀況正在發(fā)生變 化［1］。近年來(lái)，近平滑念珠菌復(fù)合體（Candidaparapsilosiscomplex，簡(jiǎn)稱近平滑念珠菌）等非白念珠菌的發(fā)病率和病死率逐年升高［2?4］。在拉美、歐洲和亞太等部分地區(qū)，近平滑念珠菌已經(jīng)成為第二常見(jiàn)的侵襲性致病念珠菌［5］。唑類藥物，如酮康唑（ketoconazole，KCZ），對(duì)念珠菌有較強(qiáng)的抗菌活性，是臨床上治療念珠菌感染的常用抗真菌藥物，但伴隨其廣泛、長(zhǎng)期使用，耐藥菌株有明顯增多趨勢(shì)［6］，已經(jīng)成為困擾臨床的重要難題。

粉防己堿（tetrandrine，TET）是天然藥用植物中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿，臨床上具有抗炎、抗腫瘤、降低門脈高壓等作用，近年來(lái)我們課題組已證明其對(duì)氟康唑等唑類抗真菌藥物在體內(nèi)外抗白念珠菌、煙曲霉等均有顯著增效活性，作用機(jī)制與抑制藥物外排泵基因有關(guān)［7?8］。本實(shí)驗(yàn)中我們以21株近平滑念珠菌臨床株作為非白念珠菌代表，體外研究TET對(duì)KCZ的增效活性，為臨床上以TET作為唑類藥物增效劑治療念珠菌病提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

材料和方法

一、菌株和主要試劑

21株近平滑念珠菌臨床分離株（JS425、JS426、JS427、JS428、JS429、JS430、JS431、JS432、JS433、JS434、JS436、JS437、JS439、JS440、JS441、JS442、JS443、JS444、JS445、JS446、ATCC22019）均來(lái)自于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)醫(yī)學(xué)真菌中心。質(zhì)控菌株選用美國(guó)臨床和試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的近平滑念珠菌ATCC 22019。KCZ（純度＞98.5%，由西安楊森制藥有限公司提供，批號(hào)P006766）；TET（批號(hào) T2695，純度＞98%，美國(guó)Sigma公司）。

二、方法

1.菌懸液和藥液制備：將受試菌株于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）中35℃轉(zhuǎn)種2次，挑取單個(gè)較大菌落用生理氯化鈉溶液配制菌懸液，以中國(guó)細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)濁度管比濁，調(diào)整至工作濃度為（0.5～2.5）×103cfu/ml，菌液新鮮制備［9］。KCZ 用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成4 g/L的儲(chǔ)備液；TET用滅菌雙蒸水和0.1 mg/L HCl溶解，配制成濃度為3 g/L的儲(chǔ)備液。

2.測(cè)定TET、KCZ單獨(dú)對(duì)近平滑念珠菌的最低抑菌濃度（MIC）：根據(jù)CLSI?M27 A3酵母菌液基微量稀釋法［10］進(jìn)行測(cè)定。用RPMI 1640液體培養(yǎng)基將藥物儲(chǔ)備液稀釋至2倍工作濃度。取100 μl倍比稀釋后依次加入96孔板的第2～11列；第1列為生長(zhǎng)對(duì)照；第12列為空白對(duì)照。除第12列外，其余各孔再分別加入100 μl菌懸液至工作濃度（0.5～2.5）×103cfu/ml。將制備好的96孔板置35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度A490值，確定MIC值。計(jì)算公式如下：真菌生長(zhǎng)百分率=（各孔A值-空白對(duì)照孔A值）/（生長(zhǎng)對(duì)照孔A值-空白對(duì)照孔A值）× 100%［11?12］。真菌生長(zhǎng)抑制百分?jǐn)?shù) =（1- 真菌生長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)）×100%。取真菌生長(zhǎng)抑制百分?jǐn)?shù)在80%以上的最低藥物濃度為MIC值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

3.TET與KCZ聯(lián)合抗近平滑念珠菌活性測(cè)定：參照 CLSI M27?A3［10］方案，以棋盤法測(cè)定 TET 與KCZ聯(lián)合對(duì)21株近平滑念珠菌的體外抗真菌活性。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)確定TET與KCZ的適當(dāng)濃度范圍，以RPMI 1640液體培養(yǎng)基分別將兩種藥物儲(chǔ)備液稀釋至4倍工作濃度（終濃度范圍分別是：TET 4～256 mg/L，KCZ 0.008～8 mg/L）。按照濃度從低到高的順序，取倍比稀釋的KCZ和TET藥液各50 μl分別加入96孔板的第2～12列和第A～G行。除A12孔之外，其余各孔再分別加入菌懸液100 μl。不足200 μl液體的孔用RPMI 1640液體培養(yǎng)基補(bǔ)足。將制備好的96孔板置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，根據(jù)吸光度A490值判讀結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。采用部分抑制濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）評(píng)價(jià)兩藥相互作用。計(jì)算公式如下：FICI=MICAB/MICA+MICBA/MICB，式中的MICA和MICB分別表示藥物A和B單用時(shí)的MIC值，MICAB和MICBA分別表示兩種藥物聯(lián)用時(shí)各自的MIC值。當(dāng)FICI≤0.5時(shí)，兩藥相互作用為協(xié)同作用，F(xiàn)ICI≤4且＞0.5時(shí)為無(wú)關(guān)作用，＞4時(shí)為拮抗作用［13］。以KCZ MIC ≤ 0.125 mg/L為敏感（S），0.25～0.5 mg/L為劑量依賴性敏感（SDD），≥1 mg/L為耐藥（R）［14］。

4.時(shí)間-殺菌曲線測(cè)定：以耐藥株JS431和敏感株JS440為測(cè)試菌株，參照前期研究方法［13］，以RPMI 1640液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至1×105cfu/ml工作濃度。以各試驗(yàn)菌株MIC值的試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，配制含TET和KCZ的RPMI 1640液體培養(yǎng)基。分別在50 ml無(wú)菌離心管中制備生長(zhǎng)對(duì)照組（不加藥）、TET單用組、KCZ單用組和TET與KCZ聯(lián)合用藥組，每個(gè)體系總體積為5 ml。將各作用體系于37 ℃靜置培養(yǎng)，并于藥物作用開始后0、6、12、24、48 h分別從各作用體系中連續(xù)3次吸取菌液100 μl加入到96孔平板內(nèi)，每孔中再加入配好的甲基四氮鹽（XTT）-甲萘醌溶液100 μl，37 ℃避光培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定A490值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。以培養(yǎng)時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，每一時(shí)間測(cè)定點(diǎn)A490的均數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制時(shí)間-殺菌曲線。

結(jié) 果

一、KCZ單獨(dú)及聯(lián)合TET抗近平滑念珠菌活性

TET與KCZ單獨(dú)或聯(lián)合作用于21株近平滑念珠菌的MIC值見(jiàn)表1。

實(shí)驗(yàn)所用的21株近平滑念珠菌中，JS431、JS439為KCZ耐藥株，JS432、JS442、JS443為劑量依賴性敏感株，其余均為KCZ敏感株。單獨(dú)用藥時(shí)，KCZ和TET的MIC值范圍為0.031 25～2 mg/L和32～64 mg/L，聯(lián)合用藥后分別降至0.008～0.25 mg/L和2～8 mg/L，F(xiàn)ICI值為0.09～0.5，均表現(xiàn)為協(xié)同作用（表1）。兩藥聯(lián)合時(shí)，其MIC終點(diǎn)清晰，“拖尾現(xiàn)象”消失。

二、時(shí)間殺菌曲線

見(jiàn)圖1，2。結(jié)果顯示TET單獨(dú)使用時(shí)對(duì)生長(zhǎng)曲線幾乎無(wú)影響，抗真菌作用極弱。在藥物作用6 h前，各組之間的生長(zhǎng)曲線幾乎重合。而6 h后，含有KCZ的各組生長(zhǎng)曲線出現(xiàn)生長(zhǎng)延遲，KCZ與TET聯(lián) 用組更明顯。在24 h和48 h時(shí)，耐藥株（JS431）與敏感株（JS440）中KCZ和TET聯(lián)用組比KCZ單獨(dú)作用組的A值均下降至少2倍。

表1 粉防己堿（TET）與酮康唑（KCZ）單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)21株近平滑念珠菌的體外抗菌活性

圖1 酮康唑與粉防己堿聯(lián)用抗耐藥近平滑念珠菌株JS431的時(shí)間-殺菌曲線圖

圖2 酮康唑與粉防己堿聯(lián)用抗敏感近平滑念珠菌株JS440的時(shí)間-殺菌曲線圖

討 論

唑類藥物作為目前治療和預(yù)防念珠菌感染最廣泛使用的抗真菌藥物，其耐藥菌株的大量檢出對(duì)抗真菌藥物的研究提出了新的挑戰(zhàn)。據(jù)全球性研究ARTEMIS念珠菌監(jiān)測(cè)項(xiàng)目顯示，近平滑念珠菌的分離率和對(duì)唑類藥物的耐藥率分別由2000年前的4.8%、2.5%升至2000年后的6.9%和3.5%。中國(guó)首個(gè)真菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)CHIF?NET 2010項(xiàng)目中，分離出的近平滑念珠菌株數(shù)占總分離念珠菌總數(shù)的17.7%，對(duì)唑類藥物的耐藥率為1.4%［6，15］。因此，減緩菌株耐藥性的產(chǎn)生已成為抗真菌藥物研究的新主題。我國(guó)植物資源物種豐富，大量學(xué)者從傳統(tǒng)中藥中發(fā)現(xiàn)能夠增強(qiáng)唑類藥物抗念珠菌活性的成分，且體外協(xié)同抗真菌作用的機(jī)制研究多數(shù)是針對(duì)白念珠菌的。然而目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)市面上存在一種安全、有效且作用機(jī)制明確的抗真菌藥物增效劑，尤其針對(duì)非白念珠菌的相關(guān)研究更為缺乏。

我們使用棋盤式微量液基稀釋法檢測(cè)TET與KCZ聯(lián)用抗近平滑念珠菌的MIC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TET在體外單獨(dú)用藥時(shí)抗真菌活性極弱，但當(dāng)與KCZ聯(lián)用時(shí)，KCZ的MIC值降低3～7個(gè)梯度，TET自身的MIC也降低3～5個(gè)梯度，F(xiàn)ICI值介于0.09～0.5之間，表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用。時(shí)間-殺菌曲線法以耐藥株JS431和敏感株JS440為研究對(duì)象，我們發(fā)現(xiàn)TET單獨(dú)使用時(shí)對(duì)生長(zhǎng)曲線幾乎無(wú)影響，當(dāng)其與KCZ聯(lián)合時(shí)能顯著增強(qiáng)KCZ的抗真菌活性，與棋盤法所得結(jié)果具有良好的一致性。結(jié)合本研究及本課題組前期研究，TET是一種具有應(yīng)用前景的抗真菌藥物增效劑，這不僅為臨床以TET作為KCZ增效劑治療近平滑念珠菌病提供了科學(xué)依據(jù)，也為我們進(jìn)一步研究TET對(duì)唑類藥物的增效活性及機(jī)制打下基礎(chǔ)。

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《中國(guó)皮膚性病學(xué)書目提要及著者傳略》征文及研修班招生

為了系統(tǒng)總結(jié)我國(guó)皮膚性病學(xué)文獻(xiàn)及介紹做出重要貢獻(xiàn)的著者，廖萬(wàn)清院士、禤國(guó)維國(guó)醫(yī)大師領(lǐng)銜編輯《中國(guó)皮膚性病學(xué)書目提要及著者傳略》。凡為該書提供書目及著者傳略者、向籌建的中國(guó)皮膚科博物館贈(zèng)送文物者，可獲贈(zèng)《中國(guó)皮膚科學(xué)史》（600元）1冊(cè)。

為推廣我國(guó)政策規(guī)定的外用中藥臨方調(diào)劑、中醫(yī)中藥療法，2017年繼續(xù)舉辦全國(guó)皮膚美容化妝品制劑研修班，馬振友、李斌傳授實(shí)用處方，示教實(shí)習(xí)，學(xué)會(huì)為止。劉巧、劉紅霞等名中醫(yī)傳授示教火療、火針、臍療、薰蒸、煙薰、熨烙、鮮藥、刺絡(luò)拔罐、太乙神針等實(shí)用療法，學(xué)員互教互學(xué)。報(bào)名注冊(cè)者獲贈(zèng)《皮膚美容化妝品制劑手冊(cè)》和《皮膚病中醫(yī)方劑制劑手冊(cè)》各1冊(cè)。贈(zèng)送臨方調(diào)配乳膏基質(zhì)及蒼龍嶺牌等皮膚外用產(chǎn)品試用。對(duì)索取征文及招生信息和獲取試用藥品者，來(lái)函必復(fù)、必贈(zèng)。

陜西馬振友藥業(yè)有限公司，手機(jī)/微信：13227015533，13379033002；QQ：386966727。

In vitro synergistic effect of tetrandrine on ketoconazole against Candida parapsilosis complex

Zhao Yajing,Li Shuixiu,Jiang Ling,Song Yanjun,Guo Hui,Liu Weida,Shen Yongnian,Zhu Kunju,Zhang Hong
Institute of Mycology,The First Affiliated Hospital of Jinan University,Guangzhou 510632,China（Zhao YJ,Li SX,Jiang L,Song YJ,Guo H,Zhu KJ,Zhang H）;Department of Mycology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Liu WD,Shen YN）

s:Zhu Kunju,Email:zhukunju1111@163.com;Zhang Hong,Email:tzhangh@jnu.edu.cn

ObjectiveTo evaluate thein vitrosynergistic effect of tetrandrine on ketoconazole againstCandida parapsilosiscomplex.MethodsAccording to the Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）M27?A3 guidelines,the microdilution checkerboard method was used to evaluatein vitroantifungal activities of ketoconazole alone and in combination with tetrandrine against 21 clinical isolates ofCandida parapsilosiscomplex based on the fractional inhibitory concentration index（FICI）.Antifungal effects of the above drugs at different time points were evaluated by the XTT assay,and then time?killing curves were drawn and assessed to investigate thein vitrodynamic antifungal activity.ResultsThe minimum inhibitory concentrations（MICs）of tetrandrine and ketoconazole alone against 21 clinical isolates ofCandida parapsilosiscomplex were 32-64 mg/L and 0.031 25-2 mg/L,respectively.When ketoconazole was combined with tetrandrine,MICs of tetrandrine and ketoconazole were reduced to 2-8 mg/L and 0.008-0.25 mg/L respectively,and the FICI ranged from 0.09 to 0.5.The time?killing curves revealed that the fungal growth was delayed obviously in the combination group compared with the ketoconazole alone group and tetrandrine alone group.ConclusionTetrandrine has obvious synergistic effects on ketoconazole againstCandida parapsilosiscomplexin vitro.

Candida;Ketoconazole;Tetrandrine;Drug synergism;Candida parapsilosiscomplex

朱坤舉，Email：zhukunju1111@163.com；張宏，Email：tzhangh@jnu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.06.007

國(guó)家自然科學(xué)基金（81171542、81471995）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81171542,81471995）

2016?10?11）

（本文編輯：尚淑賢）