淫羊藿苷對(duì)阿爾茨海默病大鼠模型金屬蛋白酶及緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)的影響

陳仕檢， 石勝良， 劉倩倩， 盧先富， 鄧 珊， 陽(yáng) 洪

淫羊藿苷對(duì)阿爾茨海默病大鼠模型金屬蛋白酶及緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)的影響

陳仕檢1， 石勝良2， 劉倩倩1， 盧先富1， 鄧 珊1， 陽(yáng) 洪1

通迅作者：陽(yáng) 洪，E-mail:yanghong19671130@163.com

目的探討淫羊藿苷對(duì)阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)大鼠學(xué)習(xí)記憶、海馬區(qū)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、MMP-2及血腦屏障緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)的影響。方法采用Aβ1-42海馬注射建立AD大鼠模型，使用淫羊藿苷進(jìn)行干預(yù)。以Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，采用Western-blot法分析緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠海馬區(qū)MMP-9、MMP-2表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，AD模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退，ZO-1表達(dá)明顯減少(P<0.05)，MMP-9、MMP-2蛋白明顯增加；淫羊藿苷干預(yù)后，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力均明顯提高，海馬區(qū)MMP-9/MMP-2表達(dá)減少(P<0.05)，ZO-1表達(dá)明顯增加(P<0.05)，以淫羊藿苷高劑量干予后明顯。結(jié)論淫羊藿苷能通過抑制MMP-9/MMP-2表達(dá)，減輕血腦屏障破壞，從而改善AD癥狀。

阿爾茨海默病； 淫羊藿苷； 緊密連接蛋白ZO-1； 金屬蛋白酶-9; 金屬蛋白酶-2

阿爾茨海默病(AD)以記憶、認(rèn)知、情感、智力下降等為主要臨床表現(xiàn)的慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行變性疾病，尚缺乏有效的防治藥物。研究顯示90%以上的AD患者均存在血腦屏障破壞，研究認(rèn)為Aβ?lián)p傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞而引起血腦屏障破壞可能是AD新的特征性病理改變[1]。研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷在AD或多發(fā)性硬化等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中存在抗炎、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)、改善神經(jīng)功能等作用，能明顯抑制IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)[2]。這些炎癥因子均能不同程度地促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、MMP-2表達(dá)的作用[3]，金屬蛋白酶與血腦屏障關(guān)系密切，這是否涉及淫羊藿苷對(duì)AD的保護(hù)機(jī)制呢? 目前國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道，亟需進(jìn)一步研究。本研究使用淫羊藿苷對(duì)AD大鼠進(jìn)行干預(yù)，通過Western-blot檢測(cè)血腦屏障緊密連接蛋白ZO-1表達(dá);免疫組化法檢測(cè)大鼠海馬區(qū)MMP-9和MMP-2的表達(dá)，研究淫羊藿苷對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶及血腦屏障通透性的影響，探討淫羊藿苷治療阿爾茨海默病的新切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 體重為280～300 g清潔級(jí)健康SD大鼠，從廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲用自來水并進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料。將SD大鼠隨機(jī)分成AD模型組、淫羊藿苷低組、淫羊藿苷高組和正常對(duì)照組，每組12只。

1.1.2 主要試劑 淫羊藿苷，純度>98%，由西安小草植物科技有限責(zé)任公司。Aβ1-42(美國(guó)sigma公司)，兔抗ZO-1單克隆一抗(abcam 公司)，兔抗MMP-9單克隆一抗、兔抗MMP-2單克隆一抗(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)。熒光二抗(KPL，USA)GAPDH 單抗(碧云天)，蛋白Marker (Fermentas，立陶宛)。SP法免疫組化試劑盒、DAB顯色盒(北京中杉金橋有限公司)。Odessay雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描儀。

1.2 方法

1.2.1 制備模型及藥物干預(yù) 術(shù)前8 h禁食物，麻醉大鼠后，將大鼠平顱位固定于腦立體定向儀上。以包新民大鼠腦立體定位圖譜為參考，確定兩側(cè)海馬坐標(biāo):前囟后3 mm，正中矢狀縫左右旁開2 mm，硬腦膜下3.5 mm。按上述定位點(diǎn)鉆孔，每側(cè)海馬注射5 μl β淀粉樣蛋白，0.5μl/min，并留針5 min，保證β淀粉樣蛋白充分彌散，然后撤針，清創(chuàng)縫合，保溫蘇醒。并設(shè)0.01 mol PBS代替Aβ1-42注射作為對(duì)照組。之后開始進(jìn)行藥物干預(yù)。對(duì)照組和模型組按0.5 mg/100 g腹腔注射生理鹽水；大鼠AD 模型制備后，次日起淫羊藿苷低組60 mg /kg，淫羊藿苷高組120 mg /kg，連續(xù)灌胃30 d。

1.2.2 大鼠行為學(xué)觀察 藥物干預(yù)30 d后，用Morris水迷宮系統(tǒng)對(duì)大鼠進(jìn)行定向航行試驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)，歷時(shí)6 d。前5 d每天訓(xùn)練4次：每只大鼠分別從4個(gè)不同象限入水訓(xùn)練一次，記錄第1天、第3天、第5天大鼠尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間(逃避潛伏期)，取平均值作為每天的逃避潛伏期。第6天撤去平臺(tái)進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn),將大鼠放入平臺(tái)所在的對(duì)角線的象限內(nèi),記錄2 min內(nèi)大鼠穿過平臺(tái)所在位置的次數(shù)，并以此作為各組大鼠記憶能力的改變。

1.2.3 血腦屏障緊密連接蛋白ZO-1檢測(cè) 大鼠麻醉后取大鼠海馬組織用液氮研磨法將組織研成粉，加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑，在4 ℃下12000 r/min 離心20 min，提取上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，然后用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，以GAPDH為內(nèi)參。因10%分離膠和5%濃縮膠，進(jìn)行SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜30 min，用TBST配置的5%脫脂奶粉封閉1 h，1∶500一抗4 ℃敷育過夜，脫色搖床上用TBST洗膜5 min×3次，1∶10000紅外熒光二抗室溫敷育1 h后在Odessay雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描成像。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 大鼠麻醉后經(jīng)心臟依次灌注生理鹽水沖洗和多聚甲醛固定后取海馬，石蠟包埋切片，采用SP法行免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色。顯微鏡下觀察海馬區(qū)MMP-9/MMP-2的表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)為胞漿或胞膜染成棕褐色或棕黃色，陰性對(duì)照用PBS代替一抗。每個(gè)標(biāo)本取3張切片，隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的海馬視野區(qū)高倍鏡下(×400)觀察，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件測(cè)定每個(gè)視野的平均積分光密度值(IOD/area)。

2 結(jié) 果

2.1 各組定向航行試驗(yàn)及空間搜索實(shí)驗(yàn) 前5 d各組大鼠搜索平臺(tái)的平均潛伏期逐漸縮短,AD模型組大鼠逃避潛伏期較正常對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，淫羊藿苷干預(yù)組大鼠潛伏期較AD模型組縮短，高劑量組更明顯(P<0.05)。第6天，AD模型組大鼠穿越隱匿平臺(tái)的次數(shù)比對(duì)照組明顯減少(P<0.05)，而淫羊藿苷干預(yù)組學(xué)習(xí)記憶有所改善，淫羊藿高劑量穿越隱匿平臺(tái)的次數(shù)比AD模型組明顯增加(P<0.05)，與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

2.2 各組血腦屏障緊密連接蛋白ZO-1檢測(cè) AD模型組海馬的ZO-1 表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)。淫羊藿苷低組海馬ZO-1表達(dá)高于AD模型組(P<0.05)，淫羊藿苷高組ZO-1表達(dá)明顯高于低劑量組(P<0.05)，而較正常對(duì)照組降低(P<0.05) (見圖1)。

2.3 免疫組織化學(xué)染色MMP-9/MMP-2在海馬中的表達(dá) AD模型組海馬區(qū)MMP-9/MMP-2蛋白的表達(dá)較其它組均明顯增高(P<0.05),淫羊藿高苷MMP-9表達(dá)較淫羊藿苷低組明顯降低(P<0.05),而比正常對(duì)照組明顯升高(P<0.05)；淫羊藿高苷MMP-2表達(dá)較淫羊藿苷低組明顯降低(P<0.05),而與正常對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)(見表2、圖2)。

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期及跨越平臺(tái)次數(shù)的比較

與AD模型組比較*P<0.05；與淫羊藿苷低組比較△P<0.05；與正常對(duì)照組比較#P<0.05

表2 各組大鼠海馬區(qū)MMP-9和MMP-2的表達(dá)

與AD模型組比較*P<0.05；與淫羊藿苷低組比較△P<0.05；與正常對(duì)照組比較#P<0.05

與AD模型組比較▲P<0.05；與淫羊藿苷低組比較△P<0.05；與正常對(duì)照組比較#P<0.05

圖1 Western-blot檢測(cè)各組血腦屏障緊密鏈接蛋白ZO-1在海馬的表達(dá)

3 討 論

阿爾茨海默病(AD)是老年癡呆的最常見類型， Aβ是各種原因誘發(fā)AD的共同通路，是AD形成及發(fā)展的關(guān)鍵因素，故常用于AD模型的制造[4]。本研究首先Aβ成功制備AD模型，發(fā)現(xiàn)給予淫羊藿苷治療后，AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有所改善，這與王梅玲的研究相符[5]。淫羊藿苷是中藥淫羊藿中的有效成分，屬于黃酮類化合物，具有抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、促進(jìn)造血功能、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及抗血栓等功能[2]。Urano等[6]證實(shí)，淫羊藿苷能通過抑制炎性因子的表達(dá)、降低NO的含量及抑制caspase-3的表達(dá)、降低腦組織中AChE活性，并降解Aβ，從而改善AD大鼠學(xué)習(xí)和記憶障礙。在目前AD的治療中，對(duì)BBB保護(hù)是治療的新靶點(diǎn)[1]。是否淫羊藿苷通過保護(hù)BBB通路促進(jìn)AD神經(jīng)功能康復(fù)呢？國(guó)內(nèi)外尚缺乏相關(guān)報(bào)道。

血腦屏障是由不同類型的緊密連接蛋白(TJ)組成，其結(jié)構(gòu)顯著性的變化為將會(huì)引起血腦屏障通透性增加。而ZO-1是與 TJ功能相關(guān)的最主要的胞質(zhì)蛋白，連接跨膜蛋白claudins、occludin的 C-末端至肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。ZO-1直接參與調(diào)節(jié)血腦屏障完整性和功能穩(wěn)定的基礎(chǔ),ZO-1含量的變化標(biāo)志著BBB通透性的變化[7]。本實(shí)驗(yàn)中給予淫羊藿苷干預(yù)后，ZO-1較AD模型組明顯增加，特別是高劑量組明顯，說明淫羊藿苷能夠維護(hù)AD大鼠血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能上的完整性而發(fā)揮腦保護(hù)作用。其機(jī)制是什么呢？基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組鋅離子依賴性內(nèi)肽酶家族，

是公認(rèn)的介導(dǎo) BBB破壞有關(guān)的最主要效應(yīng)分子[8]。 MMP-9/MMP-2是其家族中的重要成員，被發(fā)現(xiàn)在AD及其動(dòng)物模型中均有不同程度的升高[9]，其分解底物包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)中血腦屏障ZO-1、IV 型膠原、claudins和occludin 等基質(zhì)，從而起到破壞血腦屏障的作用。本研究發(fā)現(xiàn)在AD模型組ZO-1明顯較少，而MMP-9/MMP-2表達(dá)明顯升高，淫羊藿苷干予后MMP-9/MMP-2的表達(dá)明顯減少，說明淫羊藿苷能通過抑制MMP-9/MMP-2表達(dá)對(duì)血-腦屏障保護(hù),從而對(duì)AD發(fā)揮保護(hù)作用。越來越多的證據(jù)顯示，Aβ?lián)p傷腦血管內(nèi)皮細(xì)胞隨后啟動(dòng)一系列炎癥反應(yīng)連鎖效應(yīng)從而導(dǎo)致血腦屏障破壞可能是AD新的特征性病理改變[1]。現(xiàn)已證實(shí)TNF-α、IL -6、炎癥介質(zhì)(NO)和粘附分子等均能促進(jìn)金屬蛋白酶活化的作用[2]，而國(guó)內(nèi)外的研究表面淫羊藿苷對(duì)TNF-α 、IL -6、NO和粘附分子等親炎癥細(xì)胞因子有不同程度的干預(yù)作用[6]，提示淫羊藿苷可能通過調(diào)控這些炎性因子參與MMP-9/MMP-2調(diào)控從而保護(hù)AD血腦屏障通透性。

多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)是中藥的主要特點(diǎn)，本研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷通過抑制MMP-9/MMP-2的表達(dá)減輕血腦屏障破壞從而保護(hù)AD，其機(jī)制尚有炎癥反應(yīng)連鎖效應(yīng)參與，還需綜合這類因素來研究以進(jìn)一步完善淫羊藿苷對(duì)AD血-腦屏障的保護(hù)作用，以期發(fā)現(xiàn)其最優(yōu)療效，并為臨床治療AD提供更有效的理論依據(jù)。

[1]Liu L,Wan W,Xia S,et al.Dysfunctional Wnt/β-catenin signaling contributes to blood-brain barrier breakdown in Alzheimer’s disease[J].Neurochem Int，2014,75:19-25.

[2]李 娌,王學(xué)美.淫羊藿苷藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2008,33(23)：2727-2731.

[3]Mroczko B,Groblewska M,Barcikowska M.The role of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in the pathophysiology of neurodegeneration:a literature study[J].J Alzheimers Dis,2013,37(2):273-283.

[4]武 一,吉尚戎,蔣伍玲,等.β淀粉樣蛋1-40和1-42的聚集性質(zhì)比較[J].電子顯微學(xué)報(bào),2003,22(1):21-25.

[5]王梅玲.淫羊藿苷對(duì)阿爾茨海默病炎癥模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中藥藥理與臨床,2014,30(1):42-45

[6]Urano T,Tohda C.Icariin improves memory impairment in Alzheimer’s disease model mice (5xFAD) and attenuates amyloid β-induced neurite atrophy[J].Phytother Res,2010,24(11):1658-63.

[7]Wolburg H,Lippoldt A.Tight junctions of the blood-brain barrier:development,composition and regulation[J].Vascul Pharmacol，2002,38(6):323-337.

[8]Romi F,Helgeland G,Gilhus NE.Serum levels of matrix metalloproteinases:implications in clinical neurology[J].Eur Neurol，2012,67(2):121-128.

[9]郭曉紅，盧 宏，牛瑞娜，等.阿爾茨海默病患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶2和9水平的測(cè)定[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào),2014,49(1):137-139.

EffectofIcariinonMatrixMetalloproteinasesandbrainbarrierpermeabilityinratswithAlzheimer’sdisease

CHENShijian,SHIShengliang,LIUQianqian,etal.

(DepartmentofNeurology,FourthAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Liuzhou545005,China)

ObjectiveTo explore the effect of Icariin on learning and memory,Metalloproteinases(MMPs) expression and brain barrier permeability of hippocampus region in rats with Alzheimer’s disease(AD).MethodsRats models of Alzheimer’s disease were established by direct β-amyloid protein (Aβ1-42)injection method.For Icariin intervention test，the learning and memory ability was observed.The expressions of MMP-9/MMP-2 were analyzed by and Immunohistochemistry.The brain barrier permeability was detected by measured junction protein (ZO-1) expression.ResultsThe learning and memory ability was obviously decreased in AD model rats.The expression of MMP-9/MMP-2 protein level were was higher compared to control group.After Icariin treatment.The the learning and memory ability was improved,and it could also inhibit the MMP-9/MMP-2 activity(P<0.05) compared to AD model rats,the level of ZO-1 expression was significantly reduced.ConclusionOur result suggests that the protective role of Icariin in AD may be inhibit MMPs activity and maintaining BBB integrity could be another interesting therapeutic target at AD.

Alzheimer’s disease; Icariin; Junction protein (ZO-1); MMP-9/MMP-2

圖2 免疫組化檢測(cè)MMP-9、MMP-2在海馬的表達(dá)

R749.1

A

1003-2754(2017)10-0922-03

2017-08-12；

2017-10-03

國(guó)家自然科學(xué)基金(81460813)；廣西區(qū)計(jì)劃項(xiàng)目青年基金(Z2015145)

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 柳州 545005;2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 南寧 530021)