自噬在大鼠肝再生中作用的初步探討

尹 麗，徐存拴

(1. 河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007;2.河南省-科技部共建細(xì)胞分化調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地(河南師范大學(xué))，河南 新鄉(xiāng) 453007;3. 漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 漯河 462002)

自噬在大鼠肝再生中作用的初步探討

尹 麗1,2,3，徐存拴1,2*

(1. 河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007;2.河南省-科技部共建細(xì)胞分化調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地(河南師范大學(xué))，河南 新鄉(xiāng) 453007;3. 漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 漯河 462002)

自噬對(duì)肝再生有積極的作用，但具體作用機(jī)制仍有待闡明。為了解自噬在大鼠肝再生的變化和機(jī)理，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)(iTRAQ方法)檢測(cè)了大鼠肝再生中調(diào)控自噬的信號(hào)通路相關(guān)蛋白和自噬過(guò)程相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果表明，調(diào)控自噬的PI3K/Akt，mTOR，AMPK均被激活，泛素-蛋白酶體相關(guān)蛋白發(fā)生顯著表達(dá)變化，溶酶體相關(guān)膜蛋白和水解酶發(fā)生顯著變化。IPA分析發(fā)現(xiàn)，自噬在肝再生的啟動(dòng)階段和進(jìn)展階段上調(diào)。根據(jù)研究結(jié)果，提出線粒體和溶酶體共存假說(shuō)，并初步探討并圖示其存在的可能性和機(jī)理。

肝再生；自噬；泛素蛋白酶體；線粒體自噬；線粒體溶酶體共存

在正常情況下，大部分肝細(xì)胞處于G0期，很少分裂，但是當(dāng)受到某些機(jī)械、病毒、藥物等刺激時(shí)，G0期細(xì)胞可以進(jìn)入G1期，啟動(dòng)細(xì)胞周期。大鼠進(jìn)行2/3肝切除后，剩余肝臟仍可代償性的長(zhǎng)到原來(lái)大小，并恢復(fù)其功能，這個(gè)過(guò)程稱為肝再生(liver regeneration，LR)。很多激素、細(xì)胞因子、蛋白、信號(hào)通路參與肝再生過(guò)程，迄今為止，對(duì)肝再生過(guò)程還沒(méi)有非常明確的了解，尤其是啟動(dòng)和終止階段[1-3]。

溶酶體是廣泛存在于真核細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞功能有重要作用的細(xì)胞器，自噬(autophagy)是溶酶體介導(dǎo)的降解受損或冗余細(xì)胞成分為小分子物質(zhì)的過(guò)程，降解后的物質(zhì)可以被重新利用。這些功能主要是溶酶體膜蛋白和內(nèi)腔中的酸性水解酶類來(lái)執(zhí)行的。迄今為止，發(fā)現(xiàn)至少50種溶酶體酸性水解酶[4]，這些水解酶直接行使催化功能，但溶酶體膜蛋白的作用也極其重要，比如，維持溶酶體內(nèi)酸性環(huán)境，選擇性的運(yùn)輸需要被降解的物質(zhì)，介導(dǎo)溶酶體膜和其他膜的融合等[5]。自噬參與了機(jī)體很多重要的生理過(guò)程，如細(xì)胞發(fā)育、分化、衰老、死亡等[6-7]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，自噬和人類的一些疾病和腫瘤發(fā)生有很大關(guān)系[8]。所以，自噬在細(xì)胞和機(jī)體的生命中扮演著重要角色。

關(guān)于肝再生與自噬的研究已有不少報(bào)道[9-13]，研究發(fā)現(xiàn)，正常小鼠70%肝切除后，發(fā)生積極自噬而免于細(xì)胞老化，并通過(guò)維持健康的線粒體形態(tài)刺激線粒體代謝，通過(guò)氧化磷酸化為肝再生提供能量[14]。還有研究發(fā)現(xiàn)，肝再生早期，線粒體通透性沒(méi)有明顯改變，而24 h之后內(nèi)膜通透性降低，氧化磷酸化偶聯(lián)增強(qiáng)，效率提高[15]。為了解大鼠2/3肝切除肝再生與自噬的關(guān)系，自噬相關(guān)信號(hào)通路及相關(guān)蛋白在肝再生不同時(shí)間點(diǎn)的變化，并闡明其機(jī)制，本研究借助同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)結(jié)合質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)方法檢測(cè)了大鼠肝再生2、6、12、24、30和36 h等6個(gè)時(shí)間點(diǎn)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，并分析了他們的表達(dá)模式和相互作用及其與肝再生的關(guān)系。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果本文提出溶酶體和線粒體可能有共存的形式，且從分子水平闡釋其存在的可能機(jī)理。除了自噬，真核細(xì)胞還有一種降解蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)兩種蛋白降解體系之間有著某種聯(lián)系[16-19]，但是機(jī)理有待研究。本文首次在蛋白水平分析了大鼠肝再生自噬與泛素介導(dǎo)的蛋白酶體途徑之間可能的聯(lián)系。對(duì)自噬和肝再生的研究對(duì)闡明肝再生的過(guò)程有重要的意義，并且可以對(duì)肝病的治療提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 蛋白質(zhì)組檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)Sprague-Dawle(SD)成年健康雄性大鼠由河南師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重210～250 g。在控制溫度(20±3℃)，相對(duì)濕度(60±10%)，光照時(shí)間(8∶00-20∶00)條件下，實(shí)驗(yàn)大鼠可以自由飲水，攝食。取上述大鼠78只分為13組，每組6只，其中6組假手術(shù)(operation control, OC)，6組肝切除(partial hepatectomy, PH)，1組正常對(duì)照normal control group (NC)。參照實(shí)驗(yàn)室以前的方法構(gòu)建大鼠2/3肝切除模型。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，乙醚吸入法麻醉大鼠，腹部消毒，無(wú)菌條件下從劍突下方約1～2 cm處沿腹中線向上開(kāi)腹至劍突，同時(shí)壓迫大鼠兩側(cè)肋骨，將占全肝重68%的肝左，中葉擠出腹腔外，結(jié)扎蒂部，沿結(jié)扎線外側(cè)切除肝葉，縫合切口，撒上磺胺以防感染。于固定時(shí)間取上述0、2、6、12、24、30、36 h的PH大鼠，乙醚吸入法麻醉，75%酒精消毒腹部皮膚，“十字”打開(kāi)腹腔，取肝右葉?；旌厦拷M6只大鼠的肝組織置于液氮保存?zhèn)溆?。SO組不進(jìn)行肝切除，其他同PH組。

蛋白提取及iTRAQ8標(biāo)同位素標(biāo)記和肽段分離，方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)[20]。概括說(shuō)，組織樣品加入500 μL SDT裂解液，勻漿后，進(jìn)行超聲和沸水浴裂解，離心取上清，BCA方法蛋白質(zhì)定量后，-80℃冰箱保存。FASP酶解，OD280肽段定量。各組樣品肽段分別取約80 μg, 按照AB公司試劑盒:iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit(AB SCIEX)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)記。將標(biāo)記后的所有肽段混合。 樣品采用AKTA Purifier 100 (GE Healthcare)液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。每份樣品經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan)進(jìn)行質(zhì)譜分析。具體為：分析時(shí)長(zhǎng)為60 min，檢測(cè)方式為正離子；母離子掃描范圍為300～1 800 m/z；一級(jí)質(zhì)譜分辨率為70 000 at m/z 200； AGC target為3e6；一級(jí)Maximum IT為10 ms；Number of scan ranges為1，Dynamic exclusion為40.0 s。多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描(full scan)后采集10個(gè)碎片圖譜(MS2 scan)為MS2 Activation Type為HCD；Isolation window為2 m/z；二級(jí)質(zhì)譜分辨率為17 500 at m/z 200； Microscans為1；二級(jí)Maximum IT為60 ms；Normalized collision energy為30eV；Underfill ratio為0.1 %。質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)為RAW文件，查庫(kù)時(shí)將RAW文件通過(guò)Proteome Discoverer提交至Mascot服務(wù)器，選擇已經(jīng)建立好的數(shù)據(jù)庫(kù)，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。采用Proteome Discoverer1.4軟件對(duì)肽段報(bào)告離子峰強(qiáng)度值進(jìn)行定量分析。以混合樣品通道標(biāo)簽為內(nèi)參，各組蛋白質(zhì)的iTRAQ比值均采取各通道標(biāo)簽與內(nèi)參的比值(ratio 值)。當(dāng)ratio 值≥對(duì)照2倍時(shí)，認(rèn)為蛋白發(fā)生有意義表達(dá)上調(diào)，當(dāng)ratio 值≤對(duì)照0.5倍，認(rèn)為蛋白發(fā)生有意義表達(dá)下調(diào)。

以“autophagy”為關(guān)鍵詞在NCBI、GENEONTOLOGY、CAGP，GENMAPP、KEGG、QIAGEN和RGD等網(wǎng)站進(jìn)行搜索，確認(rèn)大鼠自噬相關(guān)基因和信號(hào)通路，有異議的進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)進(jìn)行確認(rèn)。經(jīng)查詢確定mTOR，AMPK，PI3K/AKT，p53和Hedgehog等5條信號(hào)通路與自噬相關(guān)[21-25]，并把自噬分為溶酶體、自噬、自噬調(diào)節(jié)和線粒體自噬4個(gè)生理過(guò)程。

1.2 統(tǒng)計(jì)與作圖

Cluster3.0和Treeview進(jìn)行熱圖分析。具體為，將表達(dá)譜數(shù)據(jù)整理成txt文本文件，導(dǎo)入Cluster3.0軟件，對(duì)gene和array進(jìn)行聚類，選擇Average linkage并生成cdt文件。把cdt文件導(dǎo)入Treeview軟件生成層次聚類圖。將iTRAQ檢測(cè)的自噬及調(diào)節(jié)它們的信號(hào)通路的肝再生相關(guān)蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)上傳至IPA軟件內(nèi)置的Ingenuity? Knowledge Base數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Heatmap分析[26]。

2 結(jié)果與分析

iTRAQ檢測(cè)到大鼠肝再生自噬相關(guān)蛋白共64種，其中，mTOR，AMPK，PI3K/AKT，p53和Hedgehog 共5條信號(hào)通路與溶酶體、自噬、自噬調(diào)節(jié)和線粒體自噬等生理活動(dòng)相關(guān)蛋白分別為4、12、35、18、6、6、1、4、3種。PSMD2、PSMA1、GFEF等蛋白上調(diào)顯著，IL6、GAA、PARL等下調(diào)顯著。對(duì)64種自噬相關(guān)蛋白聚類發(fā)現(xiàn)，第1聚類主要是6個(gè)時(shí)間點(diǎn)變化不是很明顯，僅12 h有輕微下調(diào)的蛋白。第2聚類主要是幾乎全部上調(diào)蛋白，且有些蛋白上調(diào)顯著。第3聚類主要是30 h變化差異的蛋白。第4聚類主要是下調(diào)的蛋白。第5聚類主要是30和36 h表達(dá)下調(diào)，和前4個(gè)時(shí)間點(diǎn)不一致的蛋白如圖1所示。

圖1 大鼠肝再生自噬相關(guān)蛋白聚類分析Fig.1 The clustering analysis of proteins associated with autophagy in LR

根據(jù)文獻(xiàn)，本文把檢測(cè)的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)劃分為兩個(gè)階段[27]。0～6 h為肝再生啟動(dòng)階段，6～36 h為進(jìn)展階段。各蛋白表達(dá)變化及所參與的信號(hào)通路及各信號(hào)通路之間的聯(lián)系如圖2所示。

肝切除后的低ATP狀態(tài)，激活A(yù)MPK信號(hào)通路。而AMPK信號(hào)通路通過(guò)兩條途徑對(duì)自噬產(chǎn)生作用。一是直接磷酸化抑制raptor從而解除其對(duì)ATG1的抑制，誘導(dǎo)自噬。二是直接磷酸化ATG1，誘導(dǎo)自噬。另外，AMPK信號(hào)通路可以通過(guò)FOXO途徑影響ATG8，影響自噬。AKT通過(guò)對(duì)TSC1/2的抑制作用，解除后者對(duì)Rheb的抑制，從而激活mTORC1復(fù)合體，最終抑制自噬的發(fā)生。Hedgehog信號(hào)通路和肝再生有著非常重要的關(guān)系，但是具體機(jī)制仍不明確，其可能通過(guò)EIF2AK3和EIF2A影響自噬，而本文未檢測(cè)到這兩種蛋白的變化。另外，GFER明顯表達(dá)增多，和26S蛋白酶體相關(guān)的蛋白表達(dá)異常。所檢測(cè)到的溶酶體內(nèi)的酶，除GAA外，其余幾乎都上調(diào)，溶酶體膜蛋白LAMP1，LAMP2皆表達(dá)增強(qiáng)。線粒體自噬相關(guān)蛋白OPA1表達(dá)明顯上調(diào)，而OPA1是維持線粒體內(nèi)膜完整性和電位差的重要的蛋白，這可以推測(cè)線粒體自噬沒(méi)有大量發(fā)生。

圖2 自噬相關(guān)蛋白之間的聯(lián)系Fig.2 The relationship of the proteins associated with autophagy

根據(jù)圖3IPA結(jié)果可見(jiàn)，和自噬相關(guān)的5條信號(hào)通路中，有4條信號(hào)發(fā)生了有意義變化，其中，2條活性增強(qiáng)，即AMPK信號(hào)通路在大鼠肝再生的2～36 h信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性增強(qiáng)，PI3K/Akt信號(hào)通路在大鼠肝再生的12、30 h信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性增強(qiáng)。1條活性減弱，即p53信號(hào)通路在大鼠肝再生的2、6、24、30、36 h信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性減弱。1條在不同時(shí)間點(diǎn)的變化不同，即mTOR信號(hào)通路在大鼠肝再生的2、6、30、36 h信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性增強(qiáng)，在12 h信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性減弱。

圖3 自噬及相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化預(yù)示的自噬及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性Fig.3 The comparison of canonical pathway and signaling pathways associated with autophagy

注：橙色為自噬反應(yīng)活動(dòng)增強(qiáng)，藍(lán)色為自噬反應(yīng)活動(dòng)減弱。

3 討 論

在正常條件下，自噬的發(fā)生處于基礎(chǔ)水平，但是在饑餓、低氧、胞內(nèi)壓力、高溫、生長(zhǎng)因子或激素缺乏等條件下，自噬急劇上升，以應(yīng)對(duì)胞內(nèi)ATP和構(gòu)件分子的缺乏[28-29]。對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，維持自噬的基礎(chǔ)水平非常重要，因?yàn)槠茡p或衰老的細(xì)胞器，折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)在體內(nèi)的聚集都會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的后果，所以通過(guò)自噬的消除作用，提供能量的同時(shí)，還可以重新利用一些消化后的產(chǎn)物，維持細(xì)胞穩(wěn)定[8]。大鼠2/3肝切除后，ATP含量迅速降低。而剩余肝臟在短時(shí)間內(nèi)就可以重建，這個(gè)過(guò)程受到非常復(fù)雜的調(diào)控，各種激素，信號(hào)分子等參與其中，幾乎所有的生化代謝過(guò)程都受到影響。

IPA分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，和自噬相關(guān)的信號(hào)通路除p53減弱外，而其余信號(hào)通路幾乎多不同程度的被激活，自噬也反應(yīng)活動(dòng)增強(qiáng)。p53可能通過(guò)兩個(gè)途徑對(duì)自噬發(fā)揮作用，一個(gè)是核內(nèi)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，一個(gè)是調(diào)控線粒體[30-34]，而以往所認(rèn)知的p53和自噬的關(guān)系究竟是不是通過(guò)調(diào)控下游因子DRAM現(xiàn)在也受到一些挑戰(zhàn)[35]，這都有待進(jìn)一步研究。Hedgehog信號(hào)通路作為最早發(fā)現(xiàn)的和肝再生相關(guān)的信號(hào)通路，其具體機(jī)制至今不是很清楚。它和自噬有著一定的聯(lián)系，但具體的中介連接分子也不很確定[21， 36-38]。

線粒體自噬是自噬一種特殊形式，可以選擇性降解功能障礙線粒體。自噬不足和過(guò)度都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡。OPA1(optic atrophy 1)是核基因編碼的線粒體蛋白，在維持內(nèi)膜嵴的完整，呼吸鏈的完整等方面起著非常作用，而這直接和氧化磷酸化產(chǎn)生ATP相關(guān)[39-40]。OPA1在肝再生的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)都發(fā)生明顯上調(diào)，尤其是進(jìn)展階段。高表達(dá)的OPA1對(duì)線粒體的融合很重要，這也可以推測(cè)線粒體在肝再生中維持著良好的形態(tài)和功能，并沒(méi)有形成大量片段化，而線粒體片段化對(duì)自噬是必需的，這應(yīng)該和肝再生階段大量的能量需求有著很重要的關(guān)系。在正常線粒體膜電位下，PARL(presenilin-associated rhomboid-like)會(huì)切割PINK1(PTEN induced putative kinase 1)，一種線粒體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，但在線粒體膜電位降低時(shí)，PARL則會(huì)切割PGAM5 (phosphoglycerate mutase family member 5)，也就是說(shuō)PARL會(huì)根據(jù)線粒體的狀態(tài)選擇不同的切割對(duì)象，因此它是一種比較獨(dú)特的可以感應(yīng)細(xì)胞壓力的駐線粒體磷酸酶[41]。本文發(fā)現(xiàn)，PGAM5在2、24、36 h下調(diào)，其余時(shí)間點(diǎn)未發(fā)生變化。這可以推測(cè)肝切除后線粒體并未發(fā)生明顯損傷，膜電位正常。

和肝再生與線粒體生成都有關(guān)系的肝再生增強(qiáng)因子ALR(augmenter of liver regeneration)在肝再生的整個(gè)階段都高表達(dá)[42-43]，尤其是進(jìn)展階段。而其表達(dá)降低阻礙線粒體生成，也會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡[44]。大鼠2/3肝切除后的6 h內(nèi)ATP一直處于下降狀態(tài)[14]，而肝再生需要大量ATP供應(yīng)[45]，作為機(jī)體能量的發(fā)電站，線粒體功能直接影響ATP的供應(yīng)。溶酶體跨膜蛋白LAMP1(Lysosomal-associated membrane protein 1)在肝再生的所有時(shí)間點(diǎn)均上調(diào)，這對(duì)溶酶體膜的完整，pH的維持和正常代謝起到非常重要的作用的作用。另外溶酶體中參與肝素等代謝的GNS(glucosamine (N-acetyl)-6-sulfatase),GLB1(galactosidase) CD81(cluster of differentiation 81)，INPP5B(inositol polyphosphate-5-phosphatase B)，CRAT(carnitine acetyltransferase)，GLB1(Galactosidase, beta 1)，ACTB(beta-actin)在肝再生整個(gè)階段都明顯上調(diào)。溶酶體內(nèi)水解糖原的GAA(glucosidase)在2、12 h下調(diào)其余時(shí)間點(diǎn)沒(méi)變化。GAA缺乏可能會(huì)因?yàn)槿苊阁w和細(xì)胞質(zhì)之間形成滲透壓梯度而導(dǎo)致溶酶體腫脹。而GAA基因敲除小鼠自噬泡增加，自噬功能改變。巧合的是，骨骼肌raptor(mTORC1復(fù)合體的重要亞基)基因敲除小鼠的表型與GAA非常相似[46]，預(yù)示兩者之間在自噬方面可能存在某些聯(lián)系。溶酶體內(nèi)氨基酸水平的改變導(dǎo)致自噬泡H+-ATP酶構(gòu)象改變， mTORC1從細(xì)胞質(zhì)到溶酶體遷移。有趣的是，mTORC1的上游激活劑Rheb也會(huì)在溶酶體膜上出現(xiàn)，并且受生長(zhǎng)因子刺激而激活。在生長(zhǎng)因子刺激的Rheb活性和氨基酸誘導(dǎo)的mTORC1的募集，共同導(dǎo)致mTORC1的充分活化。因此，考慮到GAA敲除小鼠溶酶體的腫脹，mTORC1的激活可能是對(duì)正常的溶酶體功能喪失的一種妥協(xié)。

綜合上述分析，線粒體自噬在大鼠肝再生中起到非常重要的作用。大鼠肝切除后，合成活動(dòng)旺盛，需要大量的能量供應(yīng)。和能量相關(guān)的AMPK信號(hào)通路激活，以對(duì)抗這種應(yīng)激狀態(tài)。而和自噬直接相關(guān)的溶酶體膜蛋白和大量酸性水解酶表達(dá)上調(diào)，線粒體內(nèi)膜相關(guān)蛋白表達(dá)增強(qiáng)，意味著線粒體功能并未受到大的影響，根據(jù)以上分析，本文提出一個(gè)設(shè)想，溶酶體和線粒體可以融合共存。也就是內(nèi)體溶酶體和自噬體融合后，并未發(fā)生傳統(tǒng)的線粒體完全被消化，而是像十幾億年前的原真核細(xì)胞吞噬原線粒體一樣，線粒體內(nèi)膜與溶酶體外膜共存，這無(wú)論從能量和節(jié)約體內(nèi)物質(zhì)成分，還是從快速提供能量上，都不失為一種合理的存在方式，示意圖如圖4(a)所示，其共存機(jī)理如圖4(b)所示。線粒體內(nèi)外膜間隙為酸性環(huán)境，而溶酶體內(nèi)也是酸性環(huán)境，這就為它們的共存提供了可能。線粒體內(nèi)膜電子傳遞鏈不斷向膜間隙泵出電子，產(chǎn)生電位差。膜間隙的酸性環(huán)境對(duì)于酸性水解酶的催化作用必不可少，而水解后的成分轉(zhuǎn)運(yùn)出共存體，可以滿足肝再生的需要，而H+向線粒體基質(zhì)中的回流又可以產(chǎn)生ATP供機(jī)體需要。這樣也就不難理解泛素-蛋白酶體的相關(guān)蛋白、溶酶體膜蛋白、線粒體膜蛋白等的不同尋常的表達(dá)變化。值的注意是GFER在其中究竟起了什么作用還不得知，但它的表達(dá)變化卻暗示著其和肝再生的關(guān)系或許與此有關(guān)。

韓淑媛等[47]研究發(fā)現(xiàn)，肝切除后15 h左右，溶酶體數(shù)量和體積明顯增加，許多細(xì)胞器衰退，唯獨(dú)溶酶體數(shù)量增加并形成多種形式的自噬體，這表明細(xì)胞進(jìn)入S期前，結(jié)構(gòu)更新加速，溶酶體自噬增加，以清除這些衰退結(jié)構(gòu)，這是細(xì)胞增殖的必要前提條件?？娒饔赖萚15,48]對(duì)肝再生中線粒體變化的長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)，肝再生中線粒體通過(guò)降低線粒體內(nèi)膜的通透性繼而增強(qiáng)氧化磷酸化來(lái)適應(yīng)再生中的能量需求，并且提出可以有兩個(gè)方面增強(qiáng)線粒體功能，一是表達(dá)合成大量與氧化磷酸化有關(guān)的蛋白質(zhì)提高ATP產(chǎn)能，但這會(huì)消耗很多ATP。二是直接調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜性質(zhì)，呼吸鏈結(jié)構(gòu)或內(nèi)環(huán)境來(lái)提高氧化磷酸化的效率。顯然，第2種比較合理。而線粒體溶酶體共存假說(shuō)可以解釋這個(gè)問(wèn)題。早期，溶酶體外膜和線粒體外膜融合或把線粒體外膜降解，那么溶酶體本身含有的內(nèi)含物和酶可以直接把物質(zhì)降解成小分子跨越線粒體內(nèi)膜進(jìn)入線粒體，但是這個(gè)時(shí)候因?yàn)檠鯕庀陆?，所以呼吸鏈功能不?huì)太強(qiáng)，而溶酶體內(nèi)部的酸性環(huán)境直接可以提供質(zhì)子濃度梯度，從ATP合酶進(jìn)入內(nèi)膜，合成ATP，所以這個(gè)時(shí)候ATP不會(huì)下降太多。而后期24 h之后，隨著功能的恢復(fù)，線粒體功能逐漸恢復(fù)，呼吸鏈恢復(fù)正常。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過(guò)降低pH人為的加在線粒體膜質(zhì)側(cè)一個(gè)質(zhì)子質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即使缺少氧化型底物，也能合成ATP[49]。翟心慧等[50]研究發(fā)現(xiàn)，輔酶Q10在肝再生增值期有明顯促進(jìn)線粒體氧化磷酸化功能，且效果和劑量正相關(guān)，其中以pH后48 h最明顯。依共存理論，肝再生初期，ATP生成溶酶體建立的質(zhì)子梯度對(duì)ATP的生成起了重要的作用，那么前期添加CoQ10對(duì)氧化磷酸化的影響不顯著而后期顯著(后期線粒體內(nèi)膜通透性恢復(fù))就不難理解了。

圖4 溶酶體和線粒體共存及可能性Fig.4 The hypothesis of coexistance of lysosome and mitochondrion and the mechanism of coexistence of lysosome and mitochondria

泛素-蛋白酶體(the ubiquitin-proteasomes system，UPS)和自噬作為真核細(xì)胞兩個(gè)最主要的蛋白降解系統(tǒng)，尤其本文發(fā)現(xiàn)UPS相關(guān)蛋白表達(dá)異常，很有必要分析下它和自噬及肝再生的相互聯(lián)系。蛋白酶體降解得到的3～25個(gè)氨基酸殘基的寡肽或多肽，最終要經(jīng)由溶酶體降解[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，UPS抑制劑可以誘導(dǎo)自噬，這可能是作為UPS系統(tǒng)的一種補(bǔ)償作用[16, 18]。如果UPS系統(tǒng)被抑制，短壽命和錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)會(huì)增多，最終導(dǎo)致細(xì)胞毒性。持續(xù)的氨基酸缺乏導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受阻，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。低氨基酸濃度會(huì)影響到mTOR信號(hào)通路，導(dǎo)致自噬活動(dòng)增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠2/3肝臟切除后，PSMA1，PSMD2，PSMB8在0～36 h明顯上升甚至幾百倍。PSMC5，PSMD3則在0～36 h一直明顯下調(diào)。PSMA3則在0～24 h明顯上升，30～36 h下調(diào)。這都顯示26S蛋白酶體在大鼠2/3肝切除后發(fā)揮了重要作用。這一方面可能與受損肝臟產(chǎn)生大量受損蛋白需要清除有關(guān)，另一方面可能和肝切除后細(xì)胞增殖需要大量的氨基酸原料有關(guān)系，也可能參與溶酶體本身的構(gòu)建。

4 結(jié) 語(yǔ)

大鼠肝切除后，能量的大量需求和組織損傷形成一種矛盾，而自噬可以在一定程度上解決這個(gè)問(wèn)題。根據(jù)能量需求和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，本文提出酶體和線粒體可以融合共存假說(shuō)。無(wú)論從能量和節(jié)約體內(nèi)物質(zhì)成分，還是從快速提供能量上，都不失為一種合理的存在方式。如果本文提出的線粒體溶酶體共存假說(shuō)成立，將對(duì)理解細(xì)胞功能和細(xì)胞器進(jìn)化都有一定的啟發(fā)作用。

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Preliminaryresearchontheroleofautophagyinratliverregeneration

YIN Li1,2,3, XU Cunshuan1,2*

(1.CollegeofLifeScience,HenanNormalUniversity,Xinxiang453007,Henan,China; 2.StateKeyLaboratoryCultivationBaseforCellDifferentiationRegulationandHenanBioengineeringKeyLaboratory(HenanNormalUniversity),Xinxiang453007,Henan，China; 3.LuoheMedicalCollege,Luohe462002,Henan,China)

Autophagy affects the liver regeneration (LR). However, the detailed mechanism remains to be elucidated. In order to explore the change and mechanism of autophagy in rat LR, we detected the expression changes of proteins in the signal pathways which regulate autophagy and the proteins associated with autophagy process by isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) combined with mass spectrometry (MS). The results indicated that the PI3K/Akt, mTOR and AMPK signaling pathways were activated. The ubiquitin-proteasome-related proteins and the membrane proteins and hydrolases associated with lysosome changed significantly. Autophagy up-regulated at the priming and progression stage in LR by the analysis from IPA. We proposed the hypothesis that lysosomes and mitochondria might coexist and explore the possible mechanism about that kind of coexistence.

liver regeneration; autophagy; ubiquitin-proteasomes system (UPS); mitophagy; coexistence of mitochondria and lysosome; ATP release

Q2

A

1672-5565(2017)03-156-08

10.3969/j.issn.1672-5565.20161222001

2016-12-22;

2017-03-10.

國(guó)家自然科學(xué)基金(31201093);國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2012CB722304).

尹麗，女，副教授，研究方向：肝再生的分子機(jī)理; E-mail：vcourse@163.com.

*通信作者：徐存拴，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：肝再生的分子機(jī)理；E-mail：xucs@x263.net.