前交叉韌帶重建早期移植肌腱的生物力學(xué)和關(guān)節(jié)滑液中IL-1β的變化

董向輝,孫正明,靳占奎,常彥海,楊 波,凌 鳴

(陜西省人民醫(yī)院骨科,西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院,西安 710068;*通訊作者,E-mail:m.ling0114@163.com)

前交叉韌帶重建早期移植肌腱的生物力學(xué)和關(guān)節(jié)滑液中IL-1β的變化

董向輝,孫正明,靳占奎,常彥海,楊 波,凌 鳴*

(陜西省人民醫(yī)院骨科,西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院,西安 710068;*通訊作者,E-mail:m.ling0114@163.com)

目的 建立兔前交叉韌帶(anterior cruciate ligament,ACL)重建模型,探討術(shù)后早期關(guān)節(jié)滑液中白細(xì)胞介素1β的表達(dá)水平及移植肌腱生物力學(xué)變化的關(guān)系。 方法 25只成年新西蘭大白兔,一側(cè)后肢作為實(shí)驗(yàn)組,使用同側(cè)踇長伸肌腱建立前交叉韌帶重建模型,對側(cè)作為正常對照組,于術(shù)后2，4，6周分別處死,測定移植肌腱的生物力學(xué)變化,并用ELISA法檢測關(guān)節(jié)滑液中白細(xì)胞介素1β的表達(dá)水平。 結(jié)果 ELISA測定結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組IL-1β水平在術(shù)后第2周達(dá)到高峰后逐漸下降,第6周接近正常水平。術(shù)后2,4,6周實(shí)驗(yàn)組韌帶斷裂所需拉力明顯低于正常對照組(P<0.01),術(shù)后重建韌帶強(qiáng)度急劇下降,4周末時(shí)達(dá)到最低,后強(qiáng)度逐漸升高。 結(jié)論 前交叉韌帶重建手術(shù)后關(guān)節(jié)滑液中IL-1β的水平變化對移植物生物力學(xué)強(qiáng)度產(chǎn)生不利影響,提示降低關(guān)節(jié)內(nèi)IL-1β水平是改善移植肌腱生物力學(xué)強(qiáng)度的積極因素之一。

白細(xì)胞介素1β; 前交叉韌帶重建; 踇長伸肌腱; 生物力學(xué)

前交叉韌帶(ACL)損傷是比較常見的一種運(yùn)動(dòng)損傷,主要特征就是損傷后絕大多數(shù)患者因?yàn)樘弁床幻黠@、誤診或者被其他伴發(fā)疾病所掩蓋等原因,多數(shù)患者延誤早期治療,進(jìn)而發(fā)展為膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定,最終結(jié)局為骨關(guān)節(jié)炎[1,2]。ACL缺乏血液供應(yīng),營養(yǎng)主要來自滑液和腱周組織,損傷后不能自行愈合,需要手術(shù)重建[3],但是手術(shù)后各種因素影響其愈合,如重建肌腱的血供、神經(jīng)營養(yǎng)問題、關(guān)節(jié)滑液和其中炎癥產(chǎn)物的影響等。IL-1作為最經(jīng)典的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)劑,分為兩種亞型,主要是以IL-1β為主發(fā)揮其病理生理效應(yīng),本實(shí)驗(yàn)在ACL重建基礎(chǔ)上,探索術(shù)后早期關(guān)節(jié)滑液中IL-1β的表達(dá)水平及移植肌腱的生物力學(xué)變化及其關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取健康成年[(11.0±2.5)月]雄性新西蘭大白兔25只,體質(zhì)量3-3.5 kg,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供并飼養(yǎng),由實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一提供標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料,飼養(yǎng)溫度22-25 ℃,濕度40%-60%,分籠飼養(yǎng),自由活動(dòng),飼養(yǎng)室內(nèi)每日定時(shí)紫外線消毒。所有動(dòng)物術(shù)前觀察活動(dòng)正常,膝關(guān)節(jié)無腫脹畸形,雙膝關(guān)節(jié)抽屜試驗(yàn)、Lachman征均陰性。每只動(dòng)物均建立以同側(cè)踇長伸肌腱為移植物的ACL重建模型,以此作為實(shí)驗(yàn)組,對側(cè)膝為正常對照組。為避免實(shí)驗(yàn)中標(biāo)本死亡、手術(shù)失敗等原因?qū)е碌臄?shù)據(jù)丟失,額外飼養(yǎng)2只兔子并制成上述模型以保證有效標(biāo)本量。

1.2 主要試劑及儀器

兔IL-1β ELISA試劑盒購自R&D公司(美國),WDW-100微機(jī)控制電子萬能生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)采用西安交通大學(xué)航空航天學(xué)院力學(xué)實(shí)驗(yàn)室儀器。

1.3 動(dòng)物模型建立

術(shù)前準(zhǔn)備:用動(dòng)物固定架將兔子固定穩(wěn)妥,3.3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)溶液耳緣靜脈注射行全身麻醉,待呼吸、心跳平穩(wěn),全身肌肉松弛后將其仰臥于手術(shù)臺(tái)上,用硫化鈉脫毛劑脫去膝關(guān)節(jié)周圍的兔毛,給予青霉素40萬單位肌肉注射預(yù)防感染。

建立模型:常規(guī)消毒鋪巾單,膝關(guān)節(jié)微屈位,取膝關(guān)節(jié)前正中切口,顯露膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶,在股骨、脛骨附著處切斷,檢查抽屜試驗(yàn)前拉及Lachman征均為陽性,證明前交叉韌帶已完整切除。

取脛骨下段內(nèi)側(cè)縱形切口,約2 cm,分離并取出踇長伸肌肌腱,剔除肌肉后對折成雙股,兩端慕絲線編織,并在兩端保留8 cm長的縫線,預(yù)張10 min后浸泡在生理鹽水中備用,沖洗縫合切口。所取肌腱測量并記錄肌腱直徑。

屈膝45°,用直徑1 mm的克氏針以原ACL起止點(diǎn)為標(biāo)志分別鉆取脛骨、股骨骨道,選取與測量肌腱直徑相近的鉆頭沿克氏針方向分別擴(kuò)大脛骨及股骨髓道,并在骨道出口處鉆取骨橋,將移植肌腱依次穿過脛骨、股骨髓道,屈膝60°將牽引線穿過骨橋牢固打結(jié)固定,再次檢查抽屜試驗(yàn)及Lachman征均為陰性,用雙氧水及生理鹽水徹底沖洗傷口及關(guān)節(jié)周圍,嚴(yán)密縫合切口,碘伏消毒后包扎,術(shù)后分籠飼養(yǎng),自由活動(dòng),每天傷口處碘伏消毒,并給予青霉素(40萬單位)肌肉注射,連續(xù)5 d,預(yù)防感染。術(shù)后1只死亡,1只傷口感染,備用補(bǔ)充保證樣本量。

1.4 留取標(biāo)本

1.5 生物力學(xué)測定

用WDW-100微機(jī)控制電子萬能生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行測試,固定好后進(jìn)行最大載荷拉伸試驗(yàn),加載速度為5 mm/min,詳細(xì)觀察并記錄前交叉韌帶完全斷裂時(shí)的加載負(fù)荷。

1.6 ELISA法測定滑液中IL-1β含量

使用ELISA法進(jìn)行關(guān)節(jié)滑液中IL-1β的水平測定,注意事項(xiàng):在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行;試劑盒應(yīng)該平衡至室溫下再進(jìn)行實(shí)驗(yàn);使用前所有試劑充分混勻,不要產(chǎn)生氣泡,以免造成加樣誤差;每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔均做復(fù)孔;底物使用液必須新鮮配制。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 生物力學(xué)測定結(jié)果

術(shù)后2，4周生物力學(xué)測試時(shí)實(shí)驗(yàn)組各5例標(biāo)本全部從骨髓道內(nèi)脫出,重新夾持后測定,直至重建韌帶斷裂為止,6周時(shí)實(shí)驗(yàn)組2例自骨髓道拔出,其余3例在韌帶體部斷裂,肉眼觀察可見肌腱體部中央處較兩端略細(xì)(4周時(shí)最細(xì)),表面少量滑膜局限覆蓋,未見明顯血管生成,肌腱有部分被溶解吸收。

與對照組相比較,在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組韌帶斷裂所需拉力顯著低于對照組(P<0.01,見表1)。術(shù)后重建韌帶最大載荷急劇下降,在第4周末達(dá)到最低,隨后強(qiáng)度逐漸升高。

表1ACL重建術(shù)后不同時(shí)間兩組移植肌腱完全斷裂所需拉力

分組2周4周6周實(shí)驗(yàn)組 41.62±1.64* 21.19±0.88* 44.64±1.63*對照組181.67±6.77177.17±8.52176.17±6.62

與對照組相比,*P<0.01

術(shù)后2,4,6周實(shí)驗(yàn)組韌帶斷裂所需拉力分別占正常ACL(對照組)的23%，12.2%，25.6%。

2.2 ELISA測定結(jié)果

術(shù)后第1,2,3,4,6周關(guān)節(jié)滑液中IL-1β ELISA法定量測定結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)滑液中IL-1β水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均與對照組比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見表2),ACL重建術(shù)后關(guān)節(jié)滑液中IL-1β水平逐漸增高,在手術(shù)后第2周末達(dá)到最高峰,后逐漸下降,但是仍維持在高水平,第6周時(shí)接近正常(見表2)。

分組1周 2周 3周 4周 6周 實(shí)驗(yàn)組38.17±1.25**98.98±1.61**59.70±1.95**31.78±1.41**15.34±0.93*對照組10.25±0.2510.25±0.90 9.74±1.0010.30±0.4910.25±1.12

與對照組相比,*P<0.05，**P<0.01

3 討論

ACL重建手術(shù)后移植物在生物力學(xué)上經(jīng)歷了由強(qiáng)急劇減弱,再逐漸增強(qiáng)的過程[4-6],移植物在早期由于缺乏血液供應(yīng)而逐漸壞死,強(qiáng)度急劇減弱,此后隨著新生血管和膠原纖維長入替代,強(qiáng)度逐漸增加,經(jīng)過這一系列過程,最終成為在力學(xué)和組織學(xué)上接近正常ACL的替代韌帶[7],移植物與骨髓道之間的腱骨愈合過程復(fù)雜、影響因素較多,比如移植物的種類、微動(dòng)和應(yīng)力、固定的方式、炎性細(xì)胞因子和關(guān)節(jié)滑液的浸泡、骨髓道位置等[8],因此在術(shù)后的各個(gè)階段受到不利影響均會(huì)對術(shù)后效果產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng),因此早期、合理的治療和處理會(huì)對患者產(chǎn)生積極的影響。本實(shí)驗(yàn)通過在ACL重建基礎(chǔ)上,探索術(shù)后早期IL-1β的表達(dá)水平及移植物生物力學(xué)變化及其關(guān)系。

IL-1作為最經(jīng)典的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)劑,分為IL-1α和IL-1β兩種亞型,以IL-1β為主,共同作用于同一個(gè)受體,發(fā)揮類似的生物學(xué)活性,在炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展和結(jié)束過程中均起到重要作用[9]。IL-1受體拮抗蛋白(IL-1Ra)是IL-1的天然拮抗劑,由滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分泌,與IL-1競爭性結(jié)合滑膜細(xì)胞膜表面的IL-1受體,進(jìn)而阻斷其生物學(xué)活性。陳游等[10]發(fā)現(xiàn)在不同病變程度的OA患者中IL-1β水平與病情正相關(guān),提示IL-1β會(huì)對關(guān)節(jié)內(nèi)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞作用。Henderson等[11]向兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射IL-1,結(jié)果導(dǎo)致了與兔膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中蛋白多糖的丟失相關(guān)聯(lián)的滑膜組織炎癥,通過向兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射IL-1Ra,不但抑制軟骨基質(zhì)中蛋白多糖的丟失,而且有效地抑制了滑膜炎癥,明顯減輕關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥反應(yīng),但是它在體內(nèi)的半衰期很短,只有幾個(gè)小時(shí),每天注射才能取得肯定的療效。ACL重建手術(shù)后,滑膜組織明顯增生腫脹,分泌功能旺盛,炎癥細(xì)胞趨化到手術(shù)部位,同時(shí)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)激活,和滑膜細(xì)胞一起大量分泌以IL-1為主的炎癥介質(zhì),IL-1又進(jìn)一步刺激巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)等,如IL-1、6、8,TNF-α、PGE2、MMP等[12,13],加重關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的損傷[14]。

本實(shí)驗(yàn)定量動(dòng)態(tài)測定ACL重建術(shù)后早期關(guān)節(jié)滑液中IL-1β的變化,定期測定移植肌腱的生物學(xué)力學(xué)變化,觀察二者關(guān)聯(lián)情況。本組25例膝關(guān)節(jié)滑液標(biāo)本中,兩組均能檢出IL-1β,在ACL重建術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組IL-1β水平明顯高于正常對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表2結(jié)果顯示ACL重建手術(shù)后關(guān)節(jié)內(nèi)IL-1β水平逐漸升高,在第2周達(dá)到高峰后逐漸下降,但仍然維持在較高水平,第6周時(shí)接近正常。手術(shù)后2，4，6周重建韌帶生物力學(xué)檢測結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組韌帶強(qiáng)度明顯低于正常對照組,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。生物力學(xué)測定結(jié)果顯示:手術(shù)后移植肌腱強(qiáng)度逐漸下降,在第4周時(shí)強(qiáng)度達(dá)到最低,后逐漸增高。這與Weiler等[4]、Goradia等[5]研究的韌帶強(qiáng)度變化結(jié)果相一致,組織學(xué)上移植物經(jīng)歷了缺血壞死、再血管化,爬行替代、塑形改造等過程,最終完全替代成為在力學(xué)和組織學(xué)上接近ACL的替代韌帶。術(shù)后2，4，6周實(shí)驗(yàn)組肌腱斷裂所需拉力大小分別占正常對照組的23%，12.2%，25.6%。兩組韌帶最大載荷差異主要是由于實(shí)驗(yàn)組屬于重建韌帶,表面缺乏血供及滑膜包裹,且要經(jīng)歷壞死重建,受關(guān)節(jié)滑液[16]和以IL-1β為代表的炎癥產(chǎn)物影響,抑制延緩重建韌帶生物力學(xué)強(qiáng)度的恢復(fù)。

手術(shù)后IL-1β水平在第2周末時(shí)含量最高,之后雖然有所下降,但仍然維持在較高水平,關(guān)節(jié)內(nèi)大量積聚著以IL-1β為代表的炎癥產(chǎn)物,介導(dǎo)炎癥細(xì)胞聚集,如大量分泌溶酶、膠原酶、蛋白水解酶和各種細(xì)胞因子等,重建韌帶缺乏血液供應(yīng),沒有結(jié)締組織和腱周組織包裹覆蓋,與炎癥產(chǎn)物直接接觸,被逐漸消化分解,加上血供破壞遠(yuǎn)離骨髓道壁處和關(guān)節(jié)腔內(nèi)肌腱最先壞死,肌腱組織變細(xì)變松脆,壞死部分被巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞吞噬,所以術(shù)后早期韌帶強(qiáng)度急劇下降,在第4周末時(shí)達(dá)到最低點(diǎn),隨著自體血管、成纖維細(xì)胞長入韌帶內(nèi)替代逐漸壞死的移植肌腱組織,滑膜組織開始包裹覆蓋、塑形修復(fù)和關(guān)節(jié)滑液的吸收、IL-1β水平下降病理生理效應(yīng)期已過、炎癥反應(yīng)急性期已過等原因,韌帶強(qiáng)度逐漸升高。發(fā)現(xiàn)手術(shù)后移植肌腱生物力學(xué)強(qiáng)度與關(guān)節(jié)滑液中IL-1β水平的變化趨勢相反。Henderson等[11]認(rèn)為,IL-1可以引起滑膜炎癥狀和軟骨破壞,提示ACL重建術(shù)后IL-1會(huì)破壞關(guān)節(jié)內(nèi)結(jié)構(gòu),對移植肌腱重塑產(chǎn)生不利影響。李康華等[17]研究發(fā)現(xiàn),橫斷兔前交叉韌帶后IL-1β表達(dá)增高,可以引起股骨外髁軟骨組織退變,提示以IL-1為代表的炎癥產(chǎn)物會(huì)對韌帶、軟骨等關(guān)節(jié)內(nèi)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生負(fù)面影響。綜上,ACL重建手術(shù)后,IL-1β水平變化對移植物生物力學(xué)強(qiáng)度產(chǎn)生不利影響,抑制和延緩移植物載荷的恢復(fù)。

因此,本研究認(rèn)為前交叉韌帶重建術(shù)后關(guān)節(jié)滑液中IL-1β的水平變化對移植物生物力學(xué)強(qiáng)度產(chǎn)生不利影響,提示降低關(guān)節(jié)內(nèi)IL-1β水平是改善移植肌腱生物力學(xué)強(qiáng)度的積極因素之一。

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RelationshipbetweenthechangesofbiomechanicsandIL-1βinearlystageafteranteriorcruciateligamentreconstruction

DONG Xianghui, SUN Zhengming, JIN Zhankui, CHANG Yanhai, YANG Bo, LING Ming*

(DepartmentofOrthopedics,People’sHospitalofShaanxiProvince,ThirdAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversityMedicalCollege,Xi’an710068,China;*Correspondingauthor,E-mail:m.ling0114@163.com)

ObjectiveTo establish the model of anterior cruciate ligament reconstruction in rabbits, and explore the relationship between the expression of interleukin 1β in synovial fluid and the biomechanical changes of transplanted tendon in the early stage after operation.MethodsTwenty-five healthy adult New Zealand rabbits were selected, with one side of hind legs as experimental group and the contralateral as normal control group. The anterior cruciate ligament reconstruction model was reconstructed with the ipsilateral hallux longus tendon. All animals were executed at 2, 4, 6 week after surgery.The biomechanical changes of transplanted tendon was determined. The expression level of IL-1β in synovial fluid was detected by ELISA.ResultsELISA results showed that the level of IL-1β in experimental group peaked at 2 week after surgery, and then decreased gradually to the normal level at the end of 6 weeks. At 2, 4 and 6 week after surgery, the tensile force of ligament rupture in experimental group was significantly lower than that in normal control group(P<0.01). The strength of the reconstructed ligament decreased rapidly and reached the lowest at the end of 4 weeks.ConclusionThe level of IL-1β in synovial fluid has an adverse effect on the biomechanical strength of grafts after anterior cruciate ligament reconstruction. The results suggest that the decrease of IL-1β level in the joint is one of the positive factors to improve the biomechanical strength of the transplanted tendon.

interleukin 1β; anterior cruciate ligament reconstruction; hallux longus tendon; biomechanics

R686

A

1007-6611(2017)10-1019-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.10.009

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2011JM4050)

董向輝,男,1985-08生,碩士,主治醫(yī)師,E-mail:286314413@qq.com

2017-06-14