白細(xì)胞介素23在呼吸道合胞病毒感染致Th1、Th2及Th17細(xì)胞分化中的作用及機(jī)制

馮凈凈，陳家君，王盛美，揭志軍

復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院呼吸科，上海 200240

·論著·

白細(xì)胞介素23在呼吸道合胞病毒感染致Th1、Th2及Th17細(xì)胞分化中的作用及機(jī)制

馮凈凈，陳家君，王盛美，揭志軍

復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院呼吸科，上海 200240

本研究旨在探討白細(xì)胞介素23(interleukin 23，IL-23)在呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B后對(duì)Th1、Th2和Th17細(xì)胞分化的影響及作用機(jī)制。將RSV感染BEAS-2B后的上清液與淋巴細(xì)胞共孵育，并分別阻斷IL-23受體(IL-23 receptor，IL-23R)、IL-23p19亞基及p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)信號(hào)通路。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)上清液中細(xì)胞因子γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)、IL-4、IL-17的濃度。同時(shí)，應(yīng)用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(t-bet、gata3、rorγt)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子(stat4、stat6、stat3)的表達(dá)。結(jié)果顯示，RSV感染后IFN-γ、IL-4和IL-17蛋白表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子的表達(dá)也有所增加。阻斷IL-23和p38 MAPK信號(hào)通路后，Th1、Th2和Th7細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)均明顯下降。結(jié)果提示，阻斷IL-23后可在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)層面抑制RSV感染上皮細(xì)胞后誘導(dǎo)的Th1、Th2和Th17細(xì)胞分化，此過(guò)程可能與p38 MAPK信號(hào)通路有關(guān)。

呼吸道合胞病毒；白細(xì)胞介素23受體；白細(xì)胞介素23 p19亞基；p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路；T輔助細(xì)胞；轉(zhuǎn)錄因子

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)屬副黏病毒科肺炎病毒屬[1]。RSV感染是兒童肺炎和毛細(xì)支氣管炎最常見(jiàn)的病因，也是5歲以下幼兒急性呼吸道感染的最重要病原體[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒時(shí)期因RSV所致毛細(xì)支氣管炎住院的兒童，成年后發(fā)生哮喘的概率顯著增加[3]。但目前為止，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。

Th17細(xì)胞亞群是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種CD4+輔助T細(xì)胞亞群，主要分泌白細(xì)胞介素17A (interleukin 17A，IL-17A)、IL-17F、IL-21、IL-22等炎性細(xì)胞因子，在防御胞外菌感染，介導(dǎo)慢性炎癥、自身免疫病和腫瘤等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。雖然眾多研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞參與RSV感染導(dǎo)致的宿主免疫過(guò)程，但具體機(jī)制還不清楚，其既有促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用，又具備抑制炎癥反應(yīng)的功能[5-6]。IL-23是促進(jìn)Th17細(xì)胞亞群增殖和分化不可或缺的細(xì)胞因子，由一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的蛋白 p19 與 IL-12 共用亞基 p40 組成[7]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)IL-23不僅參與Th17細(xì)胞的增殖和分化，還參與其他Th細(xì)胞的分化。如在潰瘍性結(jié)腸炎模型中，IL-23受體(IL-23 receptor，IL-23R)的缺失不僅導(dǎo)致Th17細(xì)胞減少，Th1細(xì)胞數(shù)量也有所減少[8]。在哮喘模型中，IL-23可通過(guò)調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞發(fā)揮作用。Wakashin等[9]發(fā)現(xiàn)，即使在IL-17缺乏的情況下，IL-23 也能介導(dǎo)Th2相關(guān)細(xì)胞因子的生成和氣道嗜酸性粒細(xì)胞的募集，提示IL-23無(wú)須依賴IL-17即可參與氣道過(guò)敏性炎癥。體外實(shí)驗(yàn)中，IL-23/IL-23R信號(hào)通路能增加Th2細(xì)胞的表達(dá)[10]。

在本課題組前期研究中，用RSV感染支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B，收集感染及未感染RSV的BEAS-2B上清液，與正常人淋巴細(xì)胞共孵育，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1、Th2、Th17細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)RSV感染后Th1、Th2及Th17細(xì)胞均增加。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，阻斷淋巴細(xì)胞表面IL-23R后，不僅Th17細(xì)胞分化受抑制，Th1和Th2細(xì)胞分化也顯著受抑制[11]。IL-23通過(guò)何種途徑影響Th1和Th2細(xì)胞分化，猜測(cè)阻斷IL-23R后，Th1和Th2細(xì)胞分化的信號(hào)途徑被抑制，導(dǎo)致Th1和Th2細(xì)胞數(shù)量降低。本研究同時(shí)阻斷IL-23p19，觀察其對(duì)后續(xù)Th細(xì)胞系信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子的影響。

p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)是MAPK家族成員之一，通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳遞，參與細(xì)胞對(duì)外界刺激的調(diào)節(jié)反應(yīng)，是細(xì)胞外多種刺激傳向胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點(diǎn)，抑制MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能減少炎性細(xì)胞因子的釋放。本研究采用p38 MAPK通路抑制劑(SB203580)，探討該信號(hào)通路在RSV感染后Th1、Th2和Th17細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄因子及所分泌的細(xì)胞因子γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)、IL-4、IL-17變化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑DMEM培養(yǎng)基、杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco’s phosphate buffered saline，DPBS)購(gòu)自Hyclone公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，RNA抽提試劑盒Qiagen RNeasy Min Kit、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒 One Step PrimeScript RT-PCR Kit購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，p38 MAPK 抑制劑SB203580購(gòu)自Sigma Aldrich公司，IL-23R及對(duì)照抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司，IL-23p19及對(duì)照抗體購(gòu)自eBioscience公司，刺激劑佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)和離子霉素(ionomycin)購(gòu)自美國(guó)BD公司，人細(xì)胞因子INF-γ、IL-4和IL-17檢測(cè)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司。

1.1.2病毒和細(xì)胞RSV A2 株由上海中醫(yī)藥大學(xué)喻曉惠贈(zèng)，來(lái)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)；人喉癌上皮細(xì)胞Hep-2、永生型人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B由復(fù)旦大學(xué)附屬上海市公共衛(wèi)生臨床中心保存。 Hep-2細(xì)胞于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層，將RSV接種于Hep-2細(xì)胞，繼續(xù)在含2% FBS的DMEM維持液中培養(yǎng)，3～5 d后細(xì)胞可出現(xiàn)病變，待病變達(dá)80%時(shí)收獲病毒，測(cè)半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50% tissue culture infective dose，TCID50)為1×107/mL時(shí)，凍存于-80 ℃?zhèn)溆肹12]。

1.2 方法

1.2.1RSV感染BEAS-2B細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)。將BEAS-2B細(xì)胞接種于24孔板，每孔2×105個(gè)，每孔培養(yǎng)體積1 mL；次日觀察上皮細(xì)胞貼壁達(dá)60%～70%，棄培養(yǎng)基，用DPBS洗2次；加入感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為5的RSV懸液300 μL，輕輕搖勻，置37 ℃培養(yǎng)箱中吸附2 h(每30 min輕搖培養(yǎng)瓶1次)；棄去未吸附的病毒液，用DPBS洗細(xì)胞2次，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，72 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，800g離心5 min去除細(xì)胞雜質(zhì)。

1.2.2RSV感染BEAS-2B細(xì)胞的上清液與淋巴細(xì)胞共孵育分離健康人外周血單核細(xì)胞，培養(yǎng)箱中靜置3 h。因巨噬細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，懸浮的細(xì)胞即為淋巴細(xì)胞，3 h后輕輕收取懸浮的淋巴細(xì)胞。用正常和感染RSV 72 h的BEAS-2B細(xì)胞上清液分別處理淋巴細(xì)胞，分為6組進(jìn)行以下干預(yù)。①淋巴細(xì)胞組(L組)：用1 mL正常BEAS-2B細(xì)胞上清液重懸淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/mL；②RSV+淋巴細(xì)胞組(RL組)：用1 mL感染RSV的BEAS-2B細(xì)胞上清液重懸淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/mL；③RSV+淋巴細(xì)胞+anti-IL-23R組(RL+aIL-23R組)：先將抗anti-IL-23R(5 μg/孔)加入淋巴細(xì)胞作用1 h，后加至1 mL感染RSV的BEAS-2B細(xì)胞上清液中，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL；④RSV+淋巴細(xì)胞+anti-IL-23R對(duì)照抗體組(RL+aIL-23R cab組)：先將抗anti-IL-23R(5 μg/孔)對(duì)照抗體anti-rabbit IgG加入淋巴細(xì)胞中作用1 h，后加至1 mL感染RSV的BEAS-2B細(xì)胞上清液中，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL；⑤RSV+淋巴細(xì)胞+anti-IL-23p19組(RL+aIL-23p19組)：先將抗anti-IL-23p19(0.5 μg/孔)加入BEAS-2B細(xì)胞上清液中作用1 h，后加入淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL；⑥RSV+淋巴細(xì)胞+anti-IL-23p19對(duì)照抗體組(RL+aIL-23p19 cab組)：先將抗anti-IL-23p19(0.5 μg/孔)對(duì)照抗體mouse IgG1加入BEAS-2B細(xì)胞上清液中作用1 h，后加入淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL。

干預(yù)淋巴細(xì)胞時(shí)，各組同時(shí)加入PMA(50 ng/mL)和離子霉素(1 μg/mL)以激活淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)箱中作用12 h，然后收集淋巴細(xì)胞及上清液。

1.2.3阻斷p38MAPK信號(hào)通路后Th細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化淋巴細(xì)胞的獲取步驟同前，實(shí)驗(yàn)分兩組：RSV+淋巴細(xì)胞組(RL組)和RSV+淋巴細(xì)胞+SB203580組(RL+SB203580組)。先將20 μmol/L[13]SB203580加入淋巴細(xì)胞中作用1 h，后加至1 mL感染RSV的BEAS-2B細(xì)胞上清液中。后續(xù)步驟同前。

1.2.4ELISA檢測(cè)各組上清液中IL-17、IL-4、IFN-γ的變化按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17表達(dá)水平。

1.2.5實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)淋巴細(xì)胞中Th1、Th2和Th17細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟抽提各組淋巴細(xì)胞總RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Th1、Th2、Th17細(xì)胞亞群分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(t-bet、gata3、rorγt)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子(stat4、stat6、stat3)的變化，GAPDH作為管家基因。反應(yīng)體系共25 μL，包括2×Buffer 12.5 μL、ExTaqHS 0.5 μL、Enzyme Mix 0.5 μL、上下游引物各0.75 μL、H2O 6.25 μL、RNA模板2.5 μL，用VII7擴(kuò)增儀進(jìn)行。反應(yīng)條件為：反轉(zhuǎn)錄42 ℃ 30 min，預(yù)變性95 ℃ 1 min，然后變性95 ℃ 5 s，退火延伸60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。于退火延伸溫度時(shí)收集熒光信號(hào)，繪制溶解曲線。引物序列見(jiàn)表1。將每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(cycle threshold，CT)，經(jīng)2-ΔΔCT計(jì)算，獲得相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線見(jiàn)圖1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以mean±SEM表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。組間數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布或方差不齊時(shí)，采用多個(gè)獨(dú)立樣本的Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著性差異。

表1PCR引物

Tab.1PrimersusedforPCR

PrimerSequence(5'-3')Size(bp)GAPDHF5'-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3'218R5'-ATCTCGCTCCTGGAAGATGG-3'T-betF5'-CCTGTTGTGGTCCAAGTTCA-3'129R5'-GAAGGACAGGAATGGGAACA-3'GATA3F5'-GGGCAATCAGTGTTACCGTT-3'278R5'-ACCACCTTAGGCCAACTGAA-3'STAT4F5'-AATCAGCAAATGGGAGCCTGTC-3'116R5'-CTGCGTTTCAAAGCTGATGGAG-3'STAT3F5'-ACCAGCAGTATAGCCGCTTC-3'106R5'-GCCACAATCCGGGCAATCT-3'RORγtF5'-CCAGTCCACTGATCTTGGGT-3'278R5'-CAAGAGAGGTTCTGGGCAAG-3'STAT6F5'-GCACTGACTGGAAGGGAAGT-3'145R5'-AACCTGTGCTCTTACCCAGC-3'

圖1實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線

Fig.1Schemeoftheexperimentalroute

2 結(jié)果

2.1 上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17的變化

ELISA結(jié)果顯示，RSV感染BEAS-2B細(xì)胞的上清液能使淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-17增多，但阻斷IL-23受體及亞基p19后，IFN-γ、IL-4、IL-17表達(dá)均有所下降，不同阻斷劑之間無(wú)明顯差異(圖2)。

2.2Th1、Th2和Th17細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化

與對(duì)照組相比，RNA水平上RSV感染的BEAS-2B細(xì)胞上清液使Th1、Th2和Th17細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(t-bet、gata3、rorγt)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子(stat4、stat6、stat3)表達(dá)均有不同程度的升高。不論阻斷IL-23受體還是阻斷亞基p19，Th1、Th2和Th17細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑均被不同程度抑制，不同阻斷劑之間Th1、Th17細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(t-bet、rorγt)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子(stat4、stat3)的表達(dá)無(wú)顯著差異。但阻斷IL-23p19后，Th2細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子gata3及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子stat6較阻斷IL-23R有更明顯的下降趨勢(shì)(圖3)。

2.3阻斷p38MAPK信號(hào)通路后Th1、Th2、Th17細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化阻斷p38 MAPK信號(hào)通路后，Th1、Th2和Th17細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-17均有不同程度下降。Th1、Th2和Th17細(xì)胞亞群分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(t-bet、gata3、rorγt)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子(stat4、stat6、stat3)mRNA的表達(dá)也均有不同程度下降(圖4)。

#P<0.05,##P<0.01 compared with L group;*P<0.05,**P<0.01 compared with RL group.

圖2阻斷淋巴細(xì)胞表面IL-23R、培養(yǎng)體系IL-23p19后IFN-γ、IL-4、IL-17分泌的變化

Fig.2ConcentrationsofIFN-γ,IL-4andIL-17insupernatantsafterblockageofIL-23RandIL-23p19

#P<0.05,##P<0.01 compared with L group;*P<0.05,**P<0.01 compared with RL group;△P<0.05,△△△P<0.001.

圖3阻斷淋巴細(xì)胞表面IL-23R、培養(yǎng)體系IL-23p19后Th1、Th2和Th17細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化

Fig.3RelativeexpressionsoftranscriptionfactorsinlymphocytesafterblockageofIL-23RandIL-23p19

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with RL group.

圖4阻斷p38MAPK信號(hào)通路后Th1、Th2和Th17細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化

Fig.4ConcentrationsofIFN-γ,IL-4andIL-17insupernatantsandrelativeexpressionsoftranscriptionfactorsinlymphocytesafterblockageofp38MAPKsignalpathway

3 討論

人支氣管上皮細(xì)胞受感染后能分泌前炎性細(xì)胞因子，從而激活宿主的免疫防御機(jī)制。RSV無(wú)論感染原代氣道上皮細(xì)胞(primary airway epithelial cell，AEC)還是氣道上皮細(xì)胞系BEAS-2B，均能產(chǎn)生IL-8、IL-6、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)等介質(zhì)[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，RSV感染BEAS-2B細(xì)胞后，能刺激細(xì)胞分泌Th1和Th17分化相關(guān)的細(xì)胞因子IL-12、IL-23、IL-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β, TGF-β)，在這些細(xì)胞因子的作用下引起Th細(xì)胞亞群的異常漂移。Qin 等[15]建立RSV持續(xù)感染人氣道上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cell，HBEC)模型，其上清液能促使Th細(xì)胞亞群向Th1、Th2、Th17方向分化。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，RSV感染BEAS-2B細(xì)胞的上清液使Th1、Th2、Th17細(xì)胞分化增加，但阻斷IL-23/IL-23R通路后，三細(xì)胞系的比例均下降。本研究沿用以前建立的實(shí)驗(yàn)體系，即通過(guò)建立體外RSV感染BEAS-2B細(xì)胞模型，將RSV感染的上皮細(xì)胞上清液與人外周淋巴細(xì)胞共孵育，分別阻斷淋巴細(xì)胞表面IL-23R和IL-23p19，檢測(cè)Th細(xì)胞分化相關(guān)調(diào)控基因的變化，以探討阻斷IL-23后三細(xì)胞系下降的原因。

結(jié)果顯示，RSV感染后三細(xì)胞系分泌的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4和IL-17均有不同程度升高。相應(yīng)地，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在RSV刺激下表達(dá)較對(duì)照組有所增加。阻斷IL-23后，三細(xì)胞系分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子均有不同程度下降，表明IL-23可在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)層面影響三細(xì)胞系的分化。很多研究證實(shí)，Th1與Th17細(xì)胞關(guān)系密切，且IL-23在其中起重要作用。Ahern等[8]發(fā)現(xiàn)，缺失IL-23R信號(hào)后，炎癥性腸病中Th1和Th17細(xì)胞數(shù)量有所減少。近期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Th17有向Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)化的可塑性[16]。人Th17細(xì)胞表面不但表達(dá)CCR6和IL-23R，還表達(dá)IL-12Rβ2和CD161，以及Th1和Th17細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子t-bet和rorc。一部分細(xì)胞同時(shí)能產(chǎn)生IFN-γ和IL-17A，稱為Th1/Th17細(xì)胞[17]。本研究結(jié)果也顯示，阻斷IL-23后Th1和Th17細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(t-bet、rorγt)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子(stat4、stat3)的基因表達(dá)有所下降。不同的阻斷途徑，即阻斷IL-23R與IL-23p19之間，兩系細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)無(wú)顯著差異。

IL-23與Th2細(xì)胞亞群的關(guān)系也非常密切。Wakashin等[9]研究顯示，不論是正常小鼠還是IL-17缺乏小鼠，IL-23均能介導(dǎo)抗原誘導(dǎo)的Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生和氣道嗜酸性粒細(xì)胞募集，提示IL-23可能不依賴IL-17途徑調(diào)節(jié)過(guò)敏性氣道炎癥。Peng等[10]的研究也證明，IL-23缺乏可通過(guò)減少嗜酸性粒細(xì)胞募集和Th2細(xì)胞產(chǎn)生來(lái)減輕氣道炎癥反應(yīng)，T細(xì)胞特異性IL-23R 的過(guò)度表達(dá)能加重Th2樣反應(yīng)和氣道炎癥，缺乏IL-23能部分抑制Th2細(xì)胞的分化，IL-23敲除小鼠脾細(xì)胞中Th2細(xì)胞亞群的量也顯著減少；體外實(shí)驗(yàn)表明，IL-23能獨(dú)立調(diào)控Th2細(xì)胞的致病作用，而不通過(guò)它促進(jìn)Th17細(xì)胞的作用，IL-23/IL-23R信號(hào)能促使GATA-3和Th2細(xì)胞因子的表達(dá)。Cosmi等[18]發(fā)現(xiàn)，有少部分細(xì)胞能同時(shí)分泌IL-17A和IL-4，即Th17/Th2細(xì)胞，其表面可少量表達(dá)IL-23R。因此，阻斷IL-23后，Th2細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子gata3、stat6及特異分泌因子IL-4的表達(dá)也降低。本研究還顯示，相對(duì)于阻斷IL-23R，阻斷IL-23p19后IL-4分泌有更下降的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子gata3及stat6明顯下降?？赡芟鄬?duì)于蛋白層面，基因?qū)用姹憩F(xiàn)得更突出、更敏感。但阻斷IL-23p19導(dǎo)致Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步下降的原因還不清楚，是否IL-23p19的阻斷影響其他途徑的Th2細(xì)胞產(chǎn)生方式，還需進(jìn)一步研究。

MAPK是多種細(xì)胞外刺激傳向胞內(nèi)信號(hào)通路的交匯處。p38 MAPK是MAPK家族成員之一，抑制MAPK信號(hào)通路能減少炎性細(xì)胞因子的釋放。Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信號(hào)通路在多種炎癥性疾病中也發(fā)揮重要作用。Shan等[19]研究發(fā)現(xiàn)，胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)可通過(guò)MAPK和STAT3信號(hào)通路刺激人氣道平滑肌細(xì)胞表達(dá)炎性細(xì)胞因子。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞在組織缺氧情況下分泌IL-6，IL-6激活JAK/STAT途徑，抑制p38 MAPK信號(hào)通路，可抑制IL-6產(chǎn)生，從而使p-STAT3減少。這些研究提示，STAT3與 p38 MAPK信號(hào)通路可能相關(guān)。Choi等[21]研究表明，p38 MAPK信號(hào)通路的激活與RSV和甲型流感病毒的感染及復(fù)制關(guān)系密切，抑制該信號(hào)通路后可抑制兩種病毒復(fù)制。Migita等[22]發(fā)現(xiàn)，血清類淀粉樣蛋白A能刺激類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞分泌IL-23p19，該過(guò)程可被p38 MAPK抑制劑完全抑制，推測(cè)RSV感染引起的IL-23分泌可能是通過(guò)p38 MAPK信號(hào)途徑。本研究通過(guò)阻斷淋巴細(xì)胞中p38 MAPK信號(hào)通路，觀察其對(duì)RSV感染導(dǎo)致Th細(xì)胞系分泌細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子升高的影響。結(jié)果顯示，三系細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子及分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在SB203580作用下均表達(dá)下降，與阻斷IL-23的結(jié)果一致，提示阻斷IL-23信號(hào)導(dǎo)致的三系細(xì)胞分泌細(xì)胞因子下降可能與p38 MAPK信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RSV感染支氣管上皮細(xì)胞后，能促進(jìn)Th1、Th2和Th17相關(guān)細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，而阻斷IL-23或使用p38 MAPK抑制劑能顯著抑制這些因子的表達(dá)。因此，IL-23在調(diào)控RSV感染上皮細(xì)胞后誘導(dǎo)的Th1、Th2和Th17細(xì)胞分化過(guò)程中起重要作用，這可能與p38 MAPK信號(hào)通路有關(guān)。本研究有助于闡明RSV感染后的宿主免疫反應(yīng)和免疫調(diào)控機(jī)制。

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. JIE Zhijun, E-mail: jiezjlxh@163.com

Roleofinterleukin23infacilitatingTh1,Th2andTh17differentiationafterrespiratorysyncytialvirusinfection

FENG Jingjing, CHEN Jiajun, WANG Shengmei, JIE Zhijun

DepartmentofRespiratoryMedicine,ShanghaiFifthPeople’sHospital,FudanUniversity,Shanghai200240,China

The present paper aims to investigate the role of interleukin 23 (IL-23) in facilitating Th1, Th2 and Th17 differentiation during respiratory syncytial virus (RSV) infection of epithelial cells (BEAS-2B). Lymphocytes were treated by supernatants from BEAS-2B cells with RSV or mock infection. Then they were blocked by specific anti-IL-23R antibody, anti-IL-23p19 antibody and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) inhibitor (SB203580). The concentrations of cytokines such as interferon γ (IFN-γ), IL-4 and IL-17 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The mRNA expressions of transcription factors (t-bet,gata3,rorγt), signal transducers (stat4,stat6,stat3) were determined by real-time polymerase chain reaction (PCR). The results showed that the concentrations of cytokines (IFN-γ, IL-4 and IL-17) were significantly increased after RSV infection, accompanied with the enhanced expressions of transcription factors. However, these cytokines and transcription factors were significantly decreased when IL-23 pathway was blocked by antibodies. The blockage of p38 MAPK signal pathway showed the same results. The results suggest that IL-23 could facilitate Th1, Th2 and Th17 differentiation in RSV-infected BEAS-2B cells, which might be associated with p38 MAPK signal pathway.

Respiratory syncytial virus; Interleukin 23 receptor；Interleukin 23 p19 subunit; p38 mitogen-activated protein kinase signal pathway; T helper cell; Transcription factor

上海市閔行區(qū)自然科學(xué)基金(2014MHZ056)，上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題(20164Y0264)

揭志軍

2017-02-10)