干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

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同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院普外科,上海 200065

·綜述·

干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

肖帥(綜述),施寶民(審校)

同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院普外科,上海200065

干細(xì)胞(stem cell)是一類可自我復(fù)制的多潛能細(xì)胞。目前發(fā)現(xiàn),通過體外誘導(dǎo)多種干細(xì)胞可分化為肝樣細(xì)胞,并有肝細(xì)胞的表面標(biāo)記及功能。肝移植為終末期肝病的最有效治療方式,但面臨供肝不足、費(fèi)用大、長(zhǎng)期免疫治療等諸多限制。因此,干細(xì)胞在治療終末期肝病方面顯現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值。文章重點(diǎn)綜述干細(xì)胞分化為類肝細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制進(jìn)展。

干細(xì)胞; 分化; 調(diào)節(jié)機(jī)制; 肝細(xì)胞

全世界每年有超過100萬患者死于肝衰竭。肝移植一直被視為終末期肝病的有效治療方法,但由于供肝不足、費(fèi)用較高、長(zhǎng)期服用免疫抑制劑等原因限制了其臨床推廣[1]。干細(xì)胞有著自我復(fù)制和分化為其他類型細(xì)胞的潛能。20多年的研究證實(shí),多種類型的干細(xì)胞可通過分離純化、定向培養(yǎng)成有功能的肝樣細(xì)胞,在一定程度上改善或者逆轉(zhuǎn)肝功能,但結(jié)果并不理想。如何提高移植效率從而更好地改善肝功能是目前在這一領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和難點(diǎn)。

1 干細(xì)胞來源和分類

1.1 胚胎來源干細(xì)胞

胎肝細(xì)胞是胚胎時(shí)期分裂形成肝臟的前體細(xì)胞,可以分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞,有著巨大的分化潛能。其分化過程中不存在分化方向選擇的問題,而且相對(duì)于其他組織來源的干細(xì)胞有著更加持久的分化能力,在適當(dāng)條件下可分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞,進(jìn)而形成肝小葉重建。胚胎干細(xì)胞(ES cell)在20世紀(jì)80年代首次被認(rèn)識(shí),當(dāng)時(shí)從小鼠囊胚細(xì)胞中分離而來[2],有很高的分化潛能,是一種高度未分化細(xì)胞,可以分化為任一胚層細(xì)胞,甚至包括認(rèn)為是不能再生的神經(jīng)組織[3],也是肝細(xì)胞分化來源之一。但這種干細(xì)胞來自胚胎,由于受倫理道德爭(zhēng)議目前主要用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)而臨床研究與應(yīng)用受限[4]。

1.2 卵圓細(xì)胞

卵圓細(xì)胞是1944年首次在誘發(fā)肝癌中被發(fā)現(xiàn),后于1956年研究肝癌時(shí)觀察到的肝門管區(qū)一類細(xì)胞,命名為卵圓細(xì)胞[5]。該細(xì)胞是一種干細(xì)胞,具有多向分化潛能[6]。按其來源可分為肝源性和非肝源性,肝源性卵圓細(xì)胞由肝內(nèi)終末膽管干細(xì)胞發(fā)育而來,部分卵圓細(xì)胞因與骨髓造血干細(xì)胞有相同細(xì)胞表面標(biāo)志故認(rèn)為可能由骨髓造血干細(xì)胞橫向分化并遷入肝內(nèi)發(fā)育而來[7]。在肝受損時(shí),刺激炎癥細(xì)胞分泌炎性遞質(zhì)(TNF-α和IFN-γ),激活卵圓細(xì)胞增殖及分化為肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞,最終組建新的肝小葉從而改善肝功能。

1.3 間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓中有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞,在一定條件下可分化為肝細(xì)胞、骨骼組織及軟骨組織等,表面可有多種標(biāo)志物如IL-1R、IL2-R等干擾素表面受體,CD166、CD54等黏附分子,具有體外易得、自體來源、免疫原性較弱且可多次移植等優(yōu)點(diǎn),在干細(xì)胞移植方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[8]。其他還有臍帶血干細(xì)胞、脂肪組織干細(xì)胞和胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞等,在一定誘導(dǎo)條件下也可分化為有功能的肝細(xì)胞。

2 分化調(diào)控

干細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,針對(duì)不同干細(xì)胞涉及核酸、細(xì)胞因子、外源誘導(dǎo)分化劑及細(xì)胞形態(tài)和極性形成等多個(gè)環(huán)節(jié)。

2.1 核酸

miRNA是一類短鏈非編碼核苷酸,研究發(fā)現(xiàn)miRNA對(duì)細(xì)胞的新陳代謝及生命活動(dòng)調(diào)節(jié)起重要作用。2008年Ivey等[9]發(fā)現(xiàn)miRNA對(duì)于胚胎干細(xì)胞分化起調(diào)控作用。2013年Cui等[10]通過分析人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化中所涉及到的miRNA并對(duì)比干細(xì)胞分化前后miRNA發(fā)現(xiàn),miR-1246、miR-1290、miR-148a、miR-30a、miR-424 和 miR-542-5p等在分化過程中呈高表達(dá);通過慢病毒介導(dǎo)的miRNA抑制劑體外抑制miR-1246、miR-1290、miR-148a,miR-30a、miR-424和miR-542-5p表達(dá),細(xì)胞攝取低密度脂蛋白效率降低,細(xì)胞功能受到抑制;將分化的肝細(xì)胞導(dǎo)入肝損傷動(dòng)物模型可改善肝細(xì)胞功能。故表明上述miRNA可促進(jìn)干細(xì)胞向有功能肝細(xì)胞分化。Cui等[11]在2012年在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),miR-1246有人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的類似作用。

miR-122是肝細(xì)胞特有miRNA[12],最早由Moroy于1989年研究肝癌時(shí)發(fā)現(xiàn),后來發(fā)現(xiàn)her基因即為miR-122前體。Lagos-Quintana等[13]在2002年報(bào)道,小鼠肝組織miR-122特異高表達(dá)。2013年Doddapaneni等[14]體外培養(yǎng)CD34、CD117雙陽性胎肝細(xì)胞時(shí)觀察到,miR-122和肝細(xì)胞特有基因表達(dá)水平呈正相關(guān)。研究表明,高表達(dá)miR-122能促進(jìn)胎肝細(xì)胞分化及AFP、ALB表達(dá),且AFP含量逐漸降低,這從側(cè)面說明干細(xì)胞越來越成熟。2015年,Chien等[15]報(bào)道,在體外誘導(dǎo)鼠胎肝細(xì)胞分化中,高表達(dá)miR-122的細(xì)胞含有更高水平的HNF-3β、HNF-4α,說明miR-122在細(xì)胞分化中啟動(dòng)了肝細(xì)胞自有的分化調(diào)控體系。2014年伊朗學(xué)者Davoodian等[16]在探究miR-122在脂肪組織間充質(zhì)干細(xì)胞分化的作用時(shí)觀察到,miR-122高表達(dá)與ALB、AFP、CK18及CK19等多種蛋白正相關(guān)性。

這些實(shí)驗(yàn)說明,miR-1246、miR-1290、miR-148a、miR-30a、miR-424、miR-542-5p和miR-122可以促進(jìn)干細(xì)胞向有功能肝樣細(xì)胞的分化及成熟。

2.2 細(xì)胞因子

2.2.1 肝細(xì)胞核因子4α

肝細(xì)胞核因子4α(HNF-4α)是通過調(diào)節(jié)肝內(nèi)基因特異性表達(dá)而控制肝細(xì)胞功能和肝臟發(fā)育的一類轉(zhuǎn)錄因子[17]。2014年Laudes等[18]報(bào)道,人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞HNF-4α高表達(dá),且轉(zhuǎn)染HNF-4α的干細(xì)胞與對(duì)照組相比有更高的ALB、G-6-P及CYP3A4表達(dá)水平。另有報(bào)道,干細(xì)胞分化有關(guān)細(xì)胞因子(HNF6及CEBP/α)高表達(dá),Wnt-β-catenin通路則受抑制;而當(dāng)細(xì)胞被HNF-4α轉(zhuǎn)染則這種抑制作用增強(qiáng)。說明HNF-4α可促進(jìn)干細(xì)胞分化及成熟。

2.2.2 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Foxa2

FOXA(forkhead box A)是一組調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物胚胎期器官形成及新陳代謝的重要基因,也稱肝核轉(zhuǎn)錄因子3(HNF3)。哺乳動(dòng)物的FOXA家族包括FOXA1、FOXA2和FOXA3[19]。Liu 等[20]在2013年報(bào)道,胚胎干細(xì)胞分化過程中將細(xì)胞分為Foxa2、HNF-4α及Foxa2/HNF-4α共3組,免疫熒光檢測(cè)Foxa2組細(xì)胞表達(dá)ALB、AFP、CK-18、AAT最多,HNF-4α組肝細(xì)胞蛋白量最低,說明人工導(dǎo)入Foxa2可促進(jìn)干細(xì)胞分化及成熟,且HNF-4α可能有促進(jìn)Foxa2作用,而Foxa2、HNF-4α表達(dá)同時(shí)增強(qiáng)并無明顯促分化作用,其蛋白含量甚至還低于單純Foxa2組。Hang的實(shí)驗(yàn)也證實(shí),HNF-4α有促進(jìn)干細(xì)胞分化及成熟作用。區(qū)別在于兩者在干細(xì)胞分化過程中的各自時(shí)間特異性,HNF-4α主要作用于分化中晚期。亦可能是實(shí)驗(yàn)條件不一致導(dǎo)致結(jié)果各異。

2.2.3 肝X受體α

肝X受體α(NR1H3)屬于配體活化的激素受體超家族成員,主要作用是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,對(duì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化也有調(diào)控作用。2014年,Chen等[21]將NR1H3導(dǎo)入干細(xì)胞細(xì)胞時(shí)觀察到,這些細(xì)胞的尿素合成及細(xì)胞色素氧化酶P450活性較對(duì)照組有明顯提高。與HNF-4α高表達(dá)細(xì)胞相比,NR1H3有類似的促進(jìn)細(xì)胞分化及成熟作用(88.9%);但當(dāng)酶解掉HNF-4α啟動(dòng)子-1 000～500堿基時(shí),其活性完全消失,增強(qiáng)細(xì)胞分化的作用也消失。說明,NR1H3、HNF-4α在調(diào)控胚胎干細(xì)胞分化中是相互促進(jìn)的關(guān)系。

可見,細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化過程中在不同的環(huán)節(jié)發(fā)揮作用,其中不同的細(xì)胞因子可能有著相互關(guān)聯(lián)并發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞分化的作用。

2.3 細(xì)胞形態(tài)及極性

多細(xì)胞生物通過不對(duì)稱分裂實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞極性及細(xì)胞功能。關(guān)于細(xì)胞極性,最早于19世紀(jì)初被提出,后來研究主要集中于果蠅神經(jīng)干細(xì)胞的研究。2012年,Hua等[22]在研究胎肝細(xì)胞分化過程中發(fā)現(xiàn),細(xì)胞極性轉(zhuǎn)變對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)有重要意義。該實(shí)驗(yàn)小組對(duì)人來源胎肝細(xì)胞進(jìn)行兩階段培養(yǎng),第一階段通過HGF作用使胎肝細(xì)胞表現(xiàn)簡(jiǎn)單極性,如細(xì)胞間緊密連接(tight jounctions,TJs),這與先前的研究結(jié)果一致;第二階段是HGF聯(lián)合DEX及OSM共同刺激干細(xì)胞分化,最終觀察到干細(xì)胞有肝細(xì)胞典型的多邊形態(tài)包括核仁及細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu),并通過基因本體論(gene ontology,GO)分析將不同分化階段的不同功能相關(guān)基因分成3個(gè)基因單元:(1)上皮細(xì)胞頂端/底極性構(gòu)建基因,涉及上調(diào)基因有PTK7、PRKCI及PARD3。(2)有絲分裂紡錘絲取向基因,上調(diào)的基因有KNTC2、CENPA及CCDC99。(3)細(xì)胞骨架組織形成及維持相關(guān)基因CAP2、DOCK2及NDE1。干細(xì)胞分化過程中細(xì)胞形態(tài)及極性形成涉及諸多環(huán)節(jié),上述基因?qū)Ω杉?xì)胞分化中形態(tài)及極性的形成具有重要作用。

2.4 外源誘導(dǎo)分化劑

一般在培養(yǎng)肝干細(xì)胞過程中更多考慮的是用細(xì)胞因子或使某特定基因高表達(dá)來誘導(dǎo)或提高分化效率。2014年日本學(xué)者Kondo等[23]在研究人多能干細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞,通過向?qū)嶒?yàn)組加入丙戊酸,繼而檢測(cè)ALB、AFP等水平時(shí)發(fā)現(xiàn),蛋白水平與對(duì)照組相比有明顯提升。2013年Dong等[24]在研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化時(shí)也得出同樣結(jié)論,其具體機(jī)制可能是丙戊酸是組蛋白脫乙酰酶抑制劑,與改變分化相關(guān)基因產(chǎn)物乙酰化狀態(tài)有關(guān)。說明丙戊酸可促進(jìn)干細(xì)胞分化及實(shí)現(xiàn)肝樣細(xì)胞功能。

2015年,M?bus等[25]報(bào)道,在小鼠胚胎干細(xì)胞分化過程中,miR-199a-5p抑制劑不僅在細(xì)胞形態(tài)、更重要在細(xì)胞功能上加速干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化,這可能與miR-199a-5p降低分化過程中染色體穩(wěn)定性而其抑制劑起穩(wěn)定染色體作用有關(guān)。2015年,Yin等[26]在研究脂肪組織來源干細(xì)胞(AT-MSCs)分化為肝樣細(xì)胞過程中發(fā)現(xiàn),曲古菌素A(TSA)可促進(jìn)AT-MSCs分化、成熟,促進(jìn)干細(xì)胞向內(nèi)胚層細(xì)胞分化進(jìn)而分化為肝樣細(xì)胞,從而表達(dá)更多成熟肝細(xì)胞表達(dá)的蛋白。

表1 肝干細(xì)胞常見調(diào)控機(jī)制

3 現(xiàn)存問題與展望

如何促進(jìn)干細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞主要面臨技術(shù)和倫理兩個(gè)方面的問題。在技術(shù)上,干細(xì)胞有較高分化潛能,但細(xì)胞分化過程錯(cuò)綜復(fù)雜,涉及不同基因表達(dá)和微環(huán)境變化,分化隨機(jī)性較強(qiáng),分化方向存在不確定性,包括在分化中不能完全避免畸胎瘤或肝細(xì)胞腫瘤形成,涉及干細(xì)胞移植效率和安全性問題。由于胎肝細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞均取自胚胎,胚胎相關(guān)干細(xì)胞臨床研究涉及難以解決的倫理問題。盡管目前干細(xì)胞研究如火如荼,涉及各臟器多種疾病,甚至遍地開花,但缺乏一套令人信服的理論和實(shí)踐體系。干細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞的安全性、穩(wěn)定性、高效性,都是亟待解決的關(guān)鍵問題。因此,真正走向臨床并廣泛應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路要走。但一項(xiàng)新理論的發(fā)現(xiàn)和新技術(shù)的運(yùn)用從來都不是一帆風(fēng)順的,尤其是劃時(shí)代意義的革新或者革命。隨著對(duì)干細(xì)胞研究的日漸深入,相信會(huì)找到干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞更可靠的誘導(dǎo)方法,使肝病患者從中獲益,從而推動(dòng)肝干細(xì)胞移植醫(yī)學(xué)的進(jìn)步。

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Progressonregulatorymechanismofstemcellsdifferentiatedintohepatocyte-likecells

XIAOShuai,SHIBaomin

DepartmentofGeneralSurgery,TongjiHospitalAffiliatedtoTongjiUniversity,Shanghai200065,China

Stem cells have the potential for self-renewal and multi-directional differentiation.Experiments have proven that stem cells can differentiate into hepatocyte-like cells under certain conditions,with hepatocyte markers and functions.Liver transplantation is the only effective and curative way for end-stage liver disease,but is limited by a shortage of donor organs,high costs of surgery,long-term immune therapy,and so on.In light of that,stem cells are of potential application value in the treatment of end-stage liver disease.This review focused on the regulatory mechanisms of stem cells differentiated into hepatocyte-like cells.

Stem cells; Differentiation; Regulatory mechanism; Hepatocyte-like cells

R329.2+1

A

2095-378X(2017)03-0189-04

2017-05-06)

肖 帥(1989—),男,同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院外科學(xué)碩士在讀

施寶民,電子信箱:baominsph@163.com

10.3969/j.issn.2095-378X.2017.03.013